片成形体和止血材料的制作方法

片成形体和止血材料的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种聚合物组合物的片成形体，其含有选自纤维蛋白原和凝血酶中的至少一种蛋白质以及选自脂肪族聚酯和水溶性聚合物中的至少一种聚合物；并且提供一种层叠片成形体，其含有：含有纤维蛋白原和水溶性聚合物而成的第一聚合物组合物层以及含有凝血酶和脂肪族聚酯而成的第二聚合物组合物层。这些成形体适用于创伤部位并作为止血材料发挥功能。
【专利说明】片成形体和止血材料

【技术领域】
[0001] 本发明涉及片成形体和包含其的止血材料。更详细而言，涉及含有纤维蛋白原和 /或凝血酶、这些止血性蛋白质的溶出性和担载性良好、且止血性优异的片成形体和包含其 的止血材料。

【背景技术】
[0002] 纤维蛋白原是存在于血液凝固级联的最终阶段的凝固因子。血管受到损伤时，发 生凝固体系的活化，最终被活化的凝血酶将可溶性纤维蛋白原转换成不溶性的纤维蛋白。 该纤维蛋白具有粘合力，对止血和创伤治愈发挥重要的功能。
[0003] 在医疗现场、尤其是外科手术中，止血和组织封闭等组织粘合操作比较重要，应用 了本原理的纤维蛋白糊粘合材料被广泛利用于外科手术的现场。
[0004] 关于纤维蛋白糊粘合材料的使用方法，截止至今进行了各种研究而实现了对其的 改善，存在如下制剂：将纤维蛋白原溶液和凝血酶溶液涂布或喷雾于患部的液状型制剂(双 液混合制剂：参照日本专利特公平9-2971号公报和国际公开W097/33633号）；将在胶原等 支撑体上混合固定纤维蛋白原和凝血酶而成的片贴附于患部的片制剂(参照日本专利特表 2004-521115 号公报）。
[0005] 然而，对于现有的液状型制剂而言，在使用时分别将进行了冷冻干燥的纤维蛋白 原和凝血酶进行溶解来使用，因此冷冻干燥制剂的溶解需要数分钟左右的时间，在应对紧 急时的手术的方面、简便性方面无法说是能够得到满足的剂型。
[0006] 另外，对于上述纤维蛋白糊粘合材料而言，由于纤维蛋白原浓度的浓度越高则越 能够获得强粘合力，为了实现强力的粘合力而需要使少量的高浓度凝血酶作用于高浓度的 纤维蛋白原。
[0007] 然而，对于现有的液状型制剂而言，由于将纤维蛋白原溶液与凝血酶溶液进行等 量混合而导致浓度减半，无法发挥出纤维蛋白原的最大功效。进而，对于纤维蛋白原的浓度 而言，实际上10%左右的溶液是浓度的极限，因此在双液等量混合的体系中还难以对浓度 进行改善。
[0008] 从这一点来看，由于片制剂能够将纤维蛋白原溶液以高浓度适用于患部，理论上 看可期待比双液混合制剂更加稳固的粘合力。另外，如果为片制剂，则能够对喷出性·渗出 性的出血部位进行压迫止血·压迫封闭，可期待其优异的方便性。
[0009] 在使用片状的组织粘合材料时，由于能够将纤维蛋白原溶液以高浓度适用于患 部，因此需要使适用于创伤部位时的、片制剂对组织的浸透性增加。另外，为了使片制剂密 合于创伤部位而有时将其撑圆或弯曲，因此需要提高片的柔软性、双成分的保持力，以便不 会因这样的力而发生片的破损、纤维蛋白原成分和凝血酶成分的脱落。
[0010] 已报告有将有效成分固定于各种基材而成的片状组织粘合材料和片状止血材 料(参照日本专利特公昭61-34830号公报、日本专利特表2002-513645号公报、国际公开 W02004/064878号以及国际公开W02005/113030号）。在日本专利特公昭61-34830号公报 中公开了向来源于马的胶原表层固定有纤维蛋白原和凝血酶的片制剂，该片制剂已经实用 化（TachoComb(注册商标)）。然而，胶原基材较厚且较硬，因此在创伤部位的密合性下降，有 时难以有效的封闭。另外，本片制剂的支撑体为马胶原，在适用对象为人时，存在相对于不 同种蛋白的抗体的表达、朊病毒病等人畜共通感染症的危险性，因此难以说是理想的制剂。
[0011] 在日本专利特表2002-513645号公报中公开了由止血化合物均等地分散而成的 纸状组合物。该组合物通过在非水性溶剂中形成包含生物体吸收性聚合物和止血化合物 (主要为凝血酶、纤维蛋白原)的纤维状纸浆，并实施制纸处理来制造。与前述TachoComb相 t匕，止血时间减少14倍，且能够在使用中重新粘贴。然而，由于其为纸状，因此在组织追随 性方面存在改善的余地。
[0012] 在国际公开W02004/064878号和国际公开W02005/113030号中公开了组合使用将 凝血酶固定于生物体吸收性合成无纺布的片和纤维蛋白原溶液的材料。这些组合物通过将 无纺布浸渍于有效成分的水溶液中，并实施冷冻干燥来进行复合化。该方法中存在如下问 题：冷冻干燥工序的生产率差、片的柔软性低、进行了固定的蛋白质的担载性差而从片上剥 落。
[0013] 日本专利特开2009-183649号公报中，出于控制凝固反应的目的而示出了在含有 纤维蛋白原的层与含有凝血酶的层的中间设置以纤维素衍生物作为材料的中间层而成的 片状组织止血材料，但存在该组织止血材料中包含的纤维蛋白原的溶解性不充分、且因其 为冷冻干燥品而处理性差、无法进行修剪之类的问题。
[0014] 另外，作为片制剂，分别在日本专利特开2010-069031号公报中公开了一种片状 纤维蛋白糊粘合材料，其由固定有包含非离子表面活性剂的纤维蛋白原的生物体吸收性支 撑体和固定有凝血酶的生物体吸收性支撑体而成；在日本专利特表2002-515300号公报中 公开了包含纤维蛋白原层、凝血酶层、吸收物质层等的止血三层绷带（sandwichbandage); 并且，在日本专利特表2009-533135号公报中公开了包含第一吸收性无纺布、一个以上的 第二吸收性织布或坯布、以及凝血酶和/或纤维蛋白原的多孔的创伤护理用品。但是，这些 止血材料是通过纤维蛋白原和凝血酶的冷冻干燥而制造的，因此容易产生纤维蛋白原和凝 血酶的脱落、柔软性也不充分，纤维蛋白原与凝血酶相邻，因此上述那样的组织粘合效果不 充分。另外，在纤维蛋白原与凝血酶直接接触的形态的情况下，保存过程中微量水分即可推 进凝固反应，从而形成纤维蛋白，因此还存在保存稳定性的问题。进而，由于需要冷冻干燥 工序，因此存在其制造耗时耗力的问题。
[0015] 像这样，尚未确立通过纤维蛋白原与凝血酶的组合而能够期待实际效果和方便性 的片状止血材料。另外，为了发挥出强力的组织粘合效果而需要高浓度的纤维蛋白原溶液， 但由于纤维蛋白原的溶解性差，在现有组成状态下将纤维蛋白原固定于支撑体时，纤维蛋 白原几乎不会溶解，因此无法期待会发挥出充分的药效。


【发明内容】

[0016] 本发明的目的在于，提供止血性蛋白质、换言之纤维蛋白原和/或凝血酶的担载 性和溶出性良好、柔软性(组织追随性)、进而止血性优异的片成形体。
[0017] 本发明的其它目的在于，提供包含本发明的上述片成形体的、适用于创伤部位而 能够达成优异的止血效果的止血材料。
[0018] 本发明的另一个目的和优点根据以下的说明而变得明确。
[0019] 根据本发明，第一，本发明的上述目的和优点可通过如下的聚合物组合物的片成 形体来达成，所述聚合物组合物的片成形体含有：选自纤维蛋白原和凝血酶中的至少一种 的蛋白质、以及选自脂肪族聚酯和水溶性聚合物中的至少一种聚合物。
[0020] 根据本发明，第二，本发明的上述目的和优点可通过如下的层叠片成形体来达成， 所述层叠片成形体中，作为上述段落的片成形体的组合而含有：含有纤维蛋白原和水溶性 聚合物而成的第一片成形体层以及含有凝血酶和脂肪族聚酯而成的第二片成形体层。
[0021] 另外，根据本发明，第三，本发明的上述目的和优点可通过包含本发明的上述片成 形体或层叠片成形体的止血材料来达成。即，这些成形体被适用于创伤部位，作为止血材料 而可用于处置创伤部位。

【专利附图】

【附图说明】
[0022] 图1是表示含有凝血酶的聚乙醇酸-聚乳酸共聚物从纤维成形体中溶出的凝血酶 溶出性的图。

【具体实施方式】
[0023] 本发明的片成形体为含有选自纤维蛋白原和凝血酶中的至少一种蛋白质以及选 自脂肪族聚酯和水溶性聚合物中的至少一种聚合物（以下，也称为"基材聚合物"。）的聚合 物组合物的片成形体。此处，"含有蛋白质"是指蛋白质的至少一部分进入到基材聚合物组 合物内部的状态。这样的结构与蛋白质存在于组合物表面或组合物的空隙的基于冷冻干燥 的复合体是不同的，蛋白质的担载性优异。
[0024] 作为本发明的片成形体，只要是片状的就没有特别限定，作为优选的片成形体可 列举出纤维成形体和膜成形体。纤维成形体是指所得的一根或多根纤维经层叠并利用纺 织、编织或其它方法而形成的三维成形体。作为具体的纤维成形体的形态，可列举出例如无 纺布。进而，以此作为基础而加工的管、网等也包括在纤维成形体中。膜成形体是指利用吹 塑挤出成形法、T模挤出成形法等挤出成形法、压延法、流延法(铸造法）等成形法而制作的 膜状成形体。
[0025] 本发明的片成形体单独存在可发挥其效果，与含有纤维蛋白糊中的补充蛋白质 (对于凝血酶而言为纤维蛋白原，或者，对于纤维蛋白原而言为凝血酶）的第二片组合也可 发挥其效果。在单独使用时，优选为在脂肪酸聚酯中含有凝血酶的纤维成形体。
[0026] 另外，上述片成形体可以用作与本发明的第二片成形体构成层叠片成形体的片成 形体，与本发明的第二片成形体的层叠片成形体是含有如下片成形体的层叠片成形体：含 有纤维蛋白原和水溶性聚合物的第一片成形体、以及含有凝血酶和脂肪族聚酯的第二片成 形体。
[0027] 本发明中可使用的止血性蛋白质即纤维蛋白原和凝血酶可以是由动物制备的，也 可以是通过基因重组技术制造的。如果来源于动物，则优选来源于人。另外，也可以使用改 变了氨基酸序列的蛋白质。
[0028] 需要说明的是，上述聚合物组合物尤其是在含有纤维蛋白原和凝血酶的情况下 等，有时在保存过程中部分产生纤维蛋白，包含这种纤维蛋白的组合物也在本发明的范围 内。
[0029] 本发明可使用的止血性蛋白质中也可以添加药学上可允许的添加剂。作为那样的 添加剂的例子，可列举出选自凝血因子XIII、白蛋白、异亮氨酸、甘氨酸、精氨酸、谷氨酸、苯 丙氨酸、组氨酸、表面活性剂、氯化钠、糖醇(甘油、甘露醇等)、海藻糖、柠檬酸钠、抑肽酶以 及氯化钙中的一种以上。
[0030] 本发明可使用的止血性蛋白质或者止血性蛋白质与添加剂的混合物可以分别以 分子的形式分散存在于基材聚合物，优选以各分子集结而成的颗粒（以下，包括其与添加剂 的混合颗粒在内，有时记载为"蛋白质颗粒"。）的形式分散存在于基材聚合物中。由此，有时 能够提高止血性蛋白质的溶出性、在片成形体为纤维状成形体时能够提高片的柔软性等。
[0031] 本发明中,所含有的蛋白质颗粒的平均粒径为0. 1~200μπι。制作粒径小于0.Ιμ-- 的颗粒在技术上来看是困难的。另外，大于200μm时，所得片成形体会变得脆弱、难以处 理，故不优选。优选为0. 5?150μm、进一步优选为f100μm。
[0032] 本发明的片成形体为纤维成形体时，含有相对于基材聚合物通常为1~200重量％、 优选为KTlOO重量％、更优选为2(Γ100重量％、进一步优选为5(Γ100重量％的含蛋白质的 颗粒。少于该范围时，有时源自片成形体的蛋白质的溶出性、片成形体的柔软性或止血性变 得不良，另外，多于该范围时，片成形体自身的自我支撑性会降低，故不优选。另外，在膜成 形体的情况下，含有相对于基材聚合物通常为100重量％以上、优选为500重量％以上、更 优选为80(Γ950重量％的含蛋白质的颗粒。少于该范围时，有时止血性变得不良，多于该范 围时，有时膜的成形性变得不良。
[0033] 作为本发明中可使用的脂肪族聚酯，具体而言，可例示出聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳 酸-聚乙醇酸共聚物、聚己内酯、聚甘油癸二酸、聚羟基链烷酸、聚丁二酸丁二醇酯、以及它 们的衍生物。这些之中，优选从聚乳酸、聚乙醇酸、聚己内酯、以及它们的共聚物、以及它们 的混合物中选择。
[0034] 此处，使用聚乳酸的共聚物时，可以包含会赋予伸缩性的单体成分。此处，赋予 伸缩性的单体成分可例示出己内酯单体、乙二醇、1，2-丙二醇、1，3-丙二醇、1，2-丁二醇、 1，4- 丁二醇、聚己内酯二醇、聚亚烷基碳酸酯二醇、聚乙二醇单元等软质成分。这些软质成 分越少越优选，优选相对于聚合物单元为不足50mol%。软质成分多于该范围时，容易丧失自 我支撑性、过于柔软而难以处理。
[0035] 使用聚乳酸或其共聚物时，构成聚合物的单体有L-乳酸、D-乳酸，但没有特别限 定。另外，聚合物的光学纯度、分子量、L体与D体的组成比或序列没有特别限定，优选为L 体多的聚合物，也可以使用聚L乳酸与聚D乳酸的立体复合物。另外，作为聚合物的分子量， 通常为1\103?5父10 6、优选为1\10^1\106、更优选为5\104?5\105。另夕卜，可任意地选 择聚合物的末端结构、将聚合物进行聚合的催化剂。
[0036] 作为本发明可使用的水溶性聚合物，作为优选的聚合物可列举出例如具有N-乙 烯基环状内酰胺单元的聚合物和水溶性纤维素衍生物。
[0037] 作为具有N-乙烯基环状内酰胺单元的聚合物，可列举出例如使N-乙烯基吡咯烷 酮、N-乙烯基己内酰胺类进行聚合或共聚而得到的均聚物或共聚物。作为这样的均聚物， 具体而言，可列举出聚（N-乙烯基-2-吡咯烷酮)、聚（N-乙烯基-5-甲基-2-吡咯烷酮)、 聚（N-乙烯基-2-哌啶酮)、聚（N-乙烯基-6-甲基-2-哌啶酮)、聚（N-乙烯基-ε-己内酰 胺)、聚（N-乙烯基-7-甲基-ε-己内酰胺）等。
[0038] 另外，作为前述共聚物，具体而言，可列举出使N-乙烯基吡咯烷酮、N-乙烯基己内 酰胺等与例如醋酸乙烯酯、（甲基）丙烯酸酯、（甲基）丙烯酸、马来酸酯、马来酸、丙烯腈、苯 乙烯、烷基乙烯基醚、N-乙烯基咪唑、乙烯基吡陡、烯丙基醇、烯烃类等进行共聚而得到的共 聚物。需要说明的是，作为前述酯，可列举出碳原子数为1~20的烷基酯、二甲氨基烷基酯及 其季盐、羟基烷基酯等。这样的骨干聚合物可以仅使用一种，也可以组合使用两种以上。从 制造容易度、获取容易度出发，最优选为聚乙烯基吡咯烷酮。
[0039] 作为本发明中可使用的具有N-乙烯基环状内酰胺单元的聚合物的平均分子量， 没有特别限定，通常为IXIO3?5X106、优选为IXIO4?IX106、更优选为5XIO4?5X105。另 夕卜，可任意地选择聚合物的末端结构、将聚合物进行聚合的催化剂。
[0040] 另外，水溶性纤维素衍生物选自羟丙基纤维素、甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙 甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、以及它们的混合物。
[0041] 这些之中，优选从羟丙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙甲基纤维素、以及它们的混 合物中选择，最优选为羟丙基纤维素。
[0042] 另外，作为本发明可使用的水溶性纤维素衍生物的分子量，没有特别限定，例如在 浓度2%、20°C下进行粘度测定时，通常为flOOOOmPa_s、优选为2~5000mPa_s、更优选为 2?4000mPas。
[0043] 在本发明的片成形体中，在不损害其目的的范围内，也可以组合使用其它聚合物、 其它化合物。例如为聚合物共聚、聚合物共混、化合物混合。作为化合物混合的例子，具体 而言，可列举出磷脂、表面活性剂等。
[0044] 本发明可使用的聚合物优选为高纯度，特别优选聚合物中包含的添加剂、增塑剂、 残留催化剂、残留物单体、成形加工或后续加工中使用的残留溶剂等残留物较少。尤其是用 于医疗时，需要抑制至低于安全性的基准。
[0045] 本发明的片成形体的平均厚度在纤维成形体的情况下通常为KTlOOOμm、优选为 5(Γ200μπι、更优选为10(Γ?50μπι。小于该范围时，变得无法保持片成形体的强度、无法修 剪，故不优选，大于该范围时，片成形体的柔软性和/或止血性会降低，故不优选。在片成形 体为膜成形体的情况下，其平均厚度通常为5~200μm、优选为KTlOOμm。
[0046] 本发明的片成形体包含纤维蛋白原时，优选以0. 05~30mg/cm2的范围包含纤维蛋 白原。纤维蛋白原的含量少于〇· 05mg/cm2时，显示不出基于蛋白质特性的效果，多于30mg/ cm2时，纤维成形体自身变得脆弱，故不优选。含量优选为0.l~25mg/cm2、进一步优选为 0. 2~25mg/cm2。另外，尤其是片成形体为膜成形体时，从止血性的观点出发，纤维蛋白原含 量为2mg/cm2以下、优选为I. 5mg/cm2以下，进一步优选为I. 4mg/cm2以下。
[0047] 本发明的片成形体包含凝血酶时，其含量优选为0.l~100U/Cm2的范围。凝血酶的 含量少于0.lU/cm2时，显示不出止血效果，多于lOOU/cm2时，片成形体自身变得脆弱，故不 优选。含量优选为2~80U/cm2、进一步优选为5~50U/cm2。
[0048] 本发明中，纤维成形体是指所得一根或多跟纤维经层叠并利用纺织、编织或其它 方法而形成的三维成形体。作为具体的纤维成形体的形态，可列举出例如无纺布。进而，以 此作为基础而加工的管、网等也包括在纤维成形体中。
[0049] 本发明的片成形体为纤维成形体时，平均纤维直径优选为0. 01~50μm。平均纤 维直径小于0.Olμm时，无法保持纤维成形体的强度，故不优选。另外，平均纤维直径大于 50μm时，由于纤维的比表面积变小，止血性蛋白质的溶解性变差，故不优选。平均纤维直径 进一步优选为〇.〇2~30μπι。需要说明的是，纤维直径表示纤维剖面的直径。纤维剖面的形 状不限定于圆形，有时也可成为椭圆形、异形。此时的纤维直径是将该椭圆形的长轴方向的 长度与短轴方向的长度的平均作为其纤维直径而算出的。另外，纤维剖面既不是圆形也不 是椭圆形时，近似于圆或椭圆来算出纤维直径。
[0050] 本发明的片成形体为纤维成形体时，其单位面积重量优选为0.l~50mg/cm2。单位 面积重量小于0.lmg/cm2时，无法充分地担载止血性蛋白质，故不优选。另外，单位面积重 量大于50mg/cm2时，引发炎症的可能性增加，故不优选。进一步优选为0. 2~20mg/cm2。
[0051] 本发明的片成形体为纤维成形体时，其体积密度优选为10(T200mg/Cm3。体积密度 小于lOOmg/cm3时，处理性会降低，故不优选。另外，体积密度大于200mg/cm3时，纤维成形 体的空隙变少、柔软性和止血性蛋白质的溶出性会降低，故不优选。
[0052] 本发明的片成形体为纤维成形体时，其制法还可以采用在塑料纤维的制造中可采 用的任意方法，没有特别限定，为了防止止血性蛋白质的活性降低，为了容易地使止血性蛋 白质或含止血性蛋白质的颗粒进行分散，优选利用溶液成形来进行。另外，纤维成形体优选 为长纤维。长纤维是指：具体而言，在由纺丝加工成纤维成形体的工序中，不实施用于切断 纤维的工序而形成的纤维成形体，可以利用电纺丝法、纺粘法、熔喷法等来形成，优选使用 电纺丝法。
[0053] 电纺丝法是通过对使聚合物溶于溶剂而得的溶液施加高电压从而在电极上得到 纤维成形体的方法。作为工序，包括如下工序：使高分子溶于溶剂而制造溶液的工序；对该 溶液施加高电压的工序；使该溶液喷出的工序；使溶剂从所喷出的溶液中蒸发来形成纤维 成形体的工序；作为可任意实施的工序，使所形成的纤维成形体的电荷消失的工序；以及， 通过电荷消失而使纤维成形体累积的工序。
[0054] 针对电纺丝法中的制造纺丝液的阶段进行说明。本发明中的纺丝液优选使用由基 材聚合物溶液和止血性蛋白质颗粒形成的悬浮液。
[0055] 悬浮液中的基材聚合物的浓度优选为1~30重量％。聚合物的浓度低于1重量％ 时，难以形成纤维成形体，故不优选。另外，高于30重量％时，所得纤维成形体的纤维直径变 大、另外悬浮液的粘度变高，故不优选。悬浮液中的聚合物的浓度更优选为1.5~20重量％。
[0056] 水溶性聚合物的溶剂只要是能够溶解水溶性聚合物、且能够与止血性蛋白质颗粒 形成悬浮液、并在纺丝的阶段蒸发从而形成纤维的溶剂，就没有特别限定，可以单独使用一 种，也可以将多种溶剂组合。可列举出例如氯仿、2-丙醇、甲苯、苯、苄醇、二氯甲烷、四氯化 碳、环己烷、环己酮、三氯乙烷、甲乙酮、醋酸乙酯、丙酮、乙醇、甲醇、四氢呋喃、1，4-二噁烷、 1 _丙醇、苯酚、批陡、醋酸、甲酸、六氟_2_丙醇、六氟丙酮、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基 乙酰胺、乙腈、N-甲基-2-吡咯烷酮、N-甲基吗啉-N-氧化物、1，3-二氧戊环、水、以及这些 溶剂的混合溶剂。这些之中，从处理性、物性等出发，优选使用二氯甲烷、氯仿、2-丙醇、乙 醇、N，N-二甲基甲酰胺。
[0057] 作为用于溶解脂肪族聚酯的溶剂，只要是能够溶解脂肪族聚酯、且能够与止血性 蛋白质颗粒形成悬浮液、并在纺丝的阶段蒸发从而形成纤维的溶剂，就没有特别限定，可以 单独使用一种，也可以将多种溶剂组合。可列举出例如氯仿、2_丙醇、甲苯、苯、苄醇、二氯 甲烷、四氯化碳、环己烷、环己酮、三氯乙烷、甲乙酮、醋酸乙酯、以及它们的混合溶剂。另外， 在形成乳状液的范围内，可以包含丙酮、乙醇、甲醇、四氢呋喃、1，4-二噁烷、1-丙醇、苯酚、 吡陡、醋酸、甲酸、六氟-2-丙醇、六氟丙酮、N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺、乙腈、 N-甲基-2-吡咯烷酮、N-甲基吗啉-N-氧化物、1，3-二氧戊环等溶剂。这些之中，从处理 性、物性出发，优选使用二氯甲烷、乙醇。
[0058] 作为制备所述悬浮液的方法，没有特别限定，可以使用超声波、各种搅拌方法。作 为搅拌方法，也可以使用均质混合器之类的高速搅拌或超微粉碎机、球磨机等搅拌方法。其 中，优选为基于超声波处理的分散方法。
[0059] 另外，利用溶剂与止血性蛋白质颗粒形成悬浮液后，添加水溶性聚合物或脂肪族 聚酯，也能够制备纺丝液。
[0060] 另外，可以在制备悬浮液之前对止血性蛋白质颗粒进行微细处理。作为微细处理， 有干式粉碎和湿式粉碎，本发明中也可以采用任意方式，还可以将两者进行组合。作为干式 粉碎处理，可列举出使用了球磨机的处理、使用了行星磨或振动磨的处理、使用乳钵利用乳 棒进行的碾磨处理、介质搅拌型粉碎机、锤磨机等冲击式粉碎机、使用气流磨、石磨进行的 碾磨处理等。另一方面，作为湿式粉碎处理，可列举出：在适当的分散介质中分散有止血性 蛋白质的状态下，利用高剪切力的搅拌装置、混炼装置等进行搅拌的处理；在介质中进行了 分散的状态下的球磨机、珠磨机处理等。进而，也可以使用利用喷雾干燥机制作的止血性蛋 白质颗粒。
[0061] 接着，针对对溶液施加高电压的阶段、使溶液喷出的阶段、使溶剂从所喷出的溶液 中蒸发来形成纤维成形体的阶段，进行说明。
[0062] 本发明的纤维成形体的制造方法中，为了使由聚合物溶液和止血性蛋白质颗粒形 成的悬浮液喷出来形成纤维成形体，需要对悬浮液施加高电压。关于施加电压的方法，只要 是使悬浮液喷出来形成纤维成形体的方法，就没有特别限定，有如下方法：向溶液中插入电 极来施加电压的方法、对溶液喷出喷嘴施加电压的方法等。
[0063] 另外，也可以设置与施加于溶液的电极不同的辅助电极。另外，关于施加电压的 值，只要可形成前述纤维成形体，就没有特别限定，通常优选为5~50kV的范围。施加电压小 于5kV时，纺丝液不会喷出从而不会形成纤维成形体，故不优选，施加电压大于50kV时，会 由电极向接地电极产生放电，故不优选。更优选为l(T30kV的范围。期望的电位利用任意 的适当方法制作即可。
[0064] 通过这样操作，刚刚使由聚合物溶液和止血性蛋白质颗粒形成的悬浮液喷出之 后，所使用的溶剂会挥发，从而形成纤维成形体。通常的纺丝在大气下、室温下进行，挥发不 充分时，也可以在负压下进行、在高温的气氛下进行。另外，进行纺丝的温度依赖于溶剂的 蒸发行为、纺丝液的粘度，通常为(T50°C的范围。
[0065] 接着，针对使所形成的纤维成形体的电荷消失来进行累积的阶段进行说明。使纤 维成形体的电荷消失来使其累积的方法没有特别限定，可列举出通过将纤维成形体捕集至 接地电极来使电荷消失、同时使其累积的方法。另外，还可列举出利用电离器等在累积前使 电荷消失的方法。此时，使纤维成形体进行累积的方法没有特别限定，作为通常的方法，可 列举出通过电荷消失使纤维成形体丧失静电力，从而利用自重来下落、累积的方法。另外， 根据需要也可以进行如下方法：吸引使静电力消失的纤维成形体而使其在网上累积的方 法、使装置内的空气发生对流而使其在网上累积的方法等。需要说明的是，电离器是指能够 利用内藏的离子发生装置来发生离子，并使离子释放至带电物从而使带电物的电荷消失的 装置。作为构成本发明的纤维成形体的制造方法中可使用的电离器的优选离子发生装置， 可列举出对内藏的放电针施加高电压从而产生离子的装置。
[0066] 所述电纺丝法是公知的，只要能够制备本发明的纤维成形体，则该装置、条件没有 限定，除了后述的实施例之外，可以参考例如国际公开W02004/072336号说明书、国际公开 2005/087988号说明书的记载。
[0067] 本发明的片成形体为膜成形体时，关于其制法，也可以利用一直以来作为膜的制 法而采用的任意方法来制造。可列举出例如流延法(铸造法)。这样进行的成形可以利用熔 融成形来进行，也可以利用溶液成形来进行，为了防止止血性蛋白质的活性降低，为了使止 血性蛋白质容易地分散，优选进行溶液成形。
[0068] 接着，针对本发明的层叠片成形体进行说明。
[0069] 本发明的层叠片成形体含有：含有纤维蛋白原和水溶性聚合物而成的第一聚合物 组合物层、以及含有凝血酶和脂肪族聚酯而成的第二聚合物组合物层。
[0070] 水溶性聚合物选自纤维素衍生物、具有N-乙烯基环状内酰胺单元的聚合物、聚环 氧乙烷、聚乙烯醇、透明质酸、葡聚糖、支链淀粉或淀粉、或者它们的混合物。
[0071] 水溶性聚合物优选为纤维素衍生物或具有N-乙烯基环状内酰胺单元的聚合物、 或者它们的混合物。
[0072] 纤维素衍生物具体而言选自羟丙基纤维素、甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙甲基 纤维素、以及羧甲基纤维素钠、以及它们的混合物。
[0073] 这些之中，优选从羟丙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙甲基纤维素、聚乙烯基吡咯 烷酮、以及它们的混合物中选择，最优选为羟丙基纤维素或聚乙烯基吡咯烷酮。
[0074] 另外，水溶性聚合物为具有N-乙烯基环状内酰胺单元的聚合物时的平均分子量 没有特别限定，为IXIO3?5X106、优选为IXIO4?IX106、更优选为5XIO4?5X105。另外，将 聚合物的末端结构、聚合物进行聚合的催化剂可以任意地选择。
[0075] 另外，水溶性聚合物为纤维素衍生物时，在浓度2%、20°C下进行粘度测定时，优选 为0·OfIOOOOmPa·s、更优选为0·l?5000mPa·s、进一步优选为0·fIOOOmPa·s、最优选为 0.flOOmPa·s的范围内。
[0076] 水溶性聚合物中，在不损害其目的的范围内，也可以组合使用其它聚合物、其它化 合物。例如为聚合物共聚、聚合物共混、化合物混合。
[0077] 所述水溶性聚合物优选为高纯度，特别优选聚合物中包含的增塑剂、残留催化剂、 残留单体、成形加工或后续加工中使用的残留溶剂等残留物较少。尤其是用于医疗时，需要 抑制至低于安全性的基准值。
[0078] 另外，由水溶性聚合物和纤维蛋白原形成的层还可以包含药学上可允许的添加 齐IJ。作为那样的添加剂的例子，可列举出与前述片成形体的说明中记载的相同的添加剂。尤 其是，纤维蛋白原为平均粒径0.OflOOμm的颗粒时，这些添加剂优选添加在该颗粒中。 [0079] 作为脂肪族聚酯，可同样地使用前述片成形体的说明中记载的聚酯。
[0080] 需要说明的是，脂肪族聚酯中，在不损害其目的的范围内，也可以组合使用其它聚 合物、其它化合物。例如为聚合物共聚、聚合物共混、化合物的混合。
[0081] 所述脂肪族聚酯优选为高纯度，特别优选聚合物中包含的添加剂、增塑剂、残留催 化剂、残留单体、成形加工或后续加工中使用的残留溶剂等残留物较少。尤其是用于医疗 时，需要抑制至低于安全性的基准值。
[0082] 另外，由脂肪族聚酯和凝血酶形成的层还可以包含药学上可允许的添加剂。作为 那样的添加剂的例子，可列举出选自多元醇、表面活性剂、氨基酸、寡糖(少糖)、氯化钠、柠 檬酸钠、以及氯化钙中的一种以上。由此，有时能够提高凝血酶的稳定性、溶解性、柔软性 等。
[0083] 由水溶性聚合物和纤维蛋白原形成的第一聚合物组合物层优选由纤维成形体或 膜形成。纤维成形体是指所得的一根或多根纤维经层叠并利用纺织、编织或其他方法而形 成的三维成形体。作为具体的纤维成形体的形态，可列举出例如无纺布。进而，以此作为基 础而加工的管、网等也包括在纤维成形体中。
[0084] 膜可以利用一直以来采用的任意方法来制造。可列举出例如流延法(铸造法)。这 样进行的成形可以利用熔融成形来进行，也可以利用溶液成形来进行，为了防止止血性蛋 白质的活性降低，为了使止血性蛋白质容易地分散，优选进行溶液成形。
[0085] 由水溶性聚合物和纤维蛋白原形成的纤维成形体的平均纤维直径为0. 01~50μm。 平均纤维直径小于0. 01μm时，无法保持纤维成形体的强度，故不优选。另外，平均纤维直 径大于50μm时，由于纤维的比表面积变小，溶解性变差，故不优选。平均纤维直径进一步 优选为0.02~30μπι。需要说明的是，纤维直径表示纤维剖面的直径。纤维剖面的形状不限 定于圆形，有时也可成为椭圆形、异形。此时的纤维直径是将该椭圆形的长轴方向的长度与 短轴方向的长度的平均作为其纤维直径而算出的。另外，纤维剖面既不是圆形也不是椭圆 形时，近似于圆或椭圆来算出纤维直径。
[0086] 本发明的层叠片成形体的平均厚度优选为5(Γ350μπι、更优选为10(Γ300μπι、进 一步优选为1〇〇?250μm。
[0087] 由水溶性聚合物和纤维蛋白原形成的纤维成形体的单位面积重量优选为 0.l~50mg/cm2。单位面积重量小于0.lmg/cm2时，无法充分地担载纤维蛋白原，故不优选。 另外，单位面积重量大于50mg/cm2时，引发炎症的可能性增加，故不优选。
[0088] 由水溶性聚合物和纤维蛋白原形成的纤维成形体的体积密度优选为10(T200mg/ cm3。体积密度小于100mg/cm3时，处理性会降低，故不优选。另外，体积密度大于200mg/cm3 时，纤维成形体的空隙变少、柔软性和溶解性会降低，故不优选。
[0089] 由水溶性聚合物和纤维蛋白原形成的纤维成形体通常以0. 05~30mg/cm2的范围 包含纤维蛋白原。纤维蛋白原的含量少于〇· 〇5mg/cm2时，显示不出止血效果，多于30mg/ cm2时，纤维成形体自身变得脆弱，故不优选。含量优选为0.l~25mg/cm2、进一步优选为 0. 2~25mg/cm2。另外，尤其是片成形体为膜成形体时，从止血性的观点来看，纤维蛋白原含 量为2mg/cm2以下、优选为I. 5mg/cm2以下、进一步优选为I. 4mg/cm2以下。
[0090] 由水溶性聚合物和纤维蛋白原形成的纤维成形体优选由长纤维而成。长纤维是 指：具体而言，在由纺丝加工成纤维成形体的工序中，不实施用于切断纤维的工序而形成的 纤维成形体，可以利用电纺丝法、纺粘法、熔喷法等来形成，优选使用电纺丝法。
[0091] 关于电纺丝法，将前述片成形体的说明中记载的水溶性聚合物与纤维蛋白原粉 末混合来制备悬浮液时，纤维蛋白原粉末的尺寸优选在〇.OflOOym的范围。制作小于 0.Olμm的纤维蛋白原粉末在技术上是困难的，大于100μm时，分散性差、纤维成形体变得 脆弱，故不优选。
[0092] 由水溶性聚合物和纤维蛋白原形成的膜也可以利用一直以来采用的任意方法来 制造。可列举出例如流延法(铸造法)。这样进行的成形可以利用熔融成形来进行，也可以利 用溶液成形来进行，为了防止止血性蛋白质的活性降低，为了使止血性蛋白质容易地分散， 优选进行溶液成形。
[0093] 由水溶性聚合物和纤维蛋白原形成的膜中的水溶性聚合物的含量因聚合物的种 类而异，优选为〇. 1~50重量％、进一步优选为0. 5~20重量％。另外，关于纤维蛋白原的蛋白 质颗粒，相对于水溶性聚合物，还因聚合物的种类而异，通常含有100重量％以上、优选含有 500重量％以上、更优选含有80(Γ950重量％。少于该范围时，有时止血性变得不良，多于该 范围时，有时膜的成形性变得不良。
[0094] 由水溶性聚合物和纤维蛋白原形成的膜的平均厚度优选为KTlOOOμm。
[0095] 由水溶性聚合物和纤维蛋白原形成的膜优选以0. 05~10mg/cm2的范围包含纤维蛋 白原。少于〇· 05mg/cm2时，难以表现出止血效果，多于10mg/cm2时，膜自身变得脆弱，故不 优选。含量更优选为〇·l~8mg/cm2、进一步优选为0· 2~4mg/cm2。
[0096] 本发明中，由脂肪族聚酯和凝血酶形成的第二聚合物组合物层优选由纤维成形体 形成。需要说明的是，纤维成形体的定义如上所述。
[0097] 由脂肪族聚酯和凝血酶形成的纤维成形体的平均纤维直径为0. 01~50μm。平均 纤维直径小于0. 01μm时，无法保持纤维成形体的强度，故不优选。另外，平均纤维直径大 于50μm时，由于纤维的比表面积变小，凝血酶的释放性变差，故不优选。平均纤维直径进 一步优选为〇· 02?30μm。
[0098] 由脂肪族聚酯和凝血酶形成的纤维成形体的平均厚度为KTlOOOμm。平均厚度小 于10μm时，变得无法保持纤维成形体的强度、无法进行修剪，故不优选。另外，平均厚度大 于1000μm时，纤维成形体的柔软性会降低，故不优选。平均厚度进一步优选为2(Γ500μm。
[0099] 由脂肪族聚酯和凝血酶形成的纤维成形体的单位面积重量为0.l~50mg/cm2。单位 面积重量小于0.lmg/cm2时，无法充分地担载凝血酶，故不优选。另外，单位面积重量大于 50mg/cm2时，引发炎症的可能性变高，故不优选。进一步优选为0. 2~20mg/cm2。
[0100] 由脂肪族聚酯和凝血酶形成的纤维成形体的体积密度为10(T200mg/cm3。体积密 度小于lOOmg/cm3时，处理性会降低，故不优选。另外，体积密度大于200mg/cm3时，纤维成 形体的空隙变低、柔软性和凝血酶的释放能力会降低，故不优选。
[0101] 本发明中，由脂肪族聚酯和凝血酶形成的纤维成形体优选以〇.l~l〇〇U/Cm2包含凝 血酶。凝血酶的含量少于0.lU/cm2时，止血效果不充分，故不优选。多于100U/cm2时，纤维 成形体自身变得脆弱，故不优选。含量优选为2~80U/cm2、进一步优选为5~50U/cm2。另外，凝 血酶的含蛋白质的颗粒相对于脂肪族聚酯通常含有广200重量％、优选含有ΚΓ100重量％、 更优选含有2(Γ100重量％、进一步优选含有5(Γ100重量％。少于该范围时，有时凝血酶的 溶出性、片成形体的柔软性或止血性变得不良，另外，多于该范围时，片成形体的自我支撑 性会降低，故不优选。
[0102] 由脂肪族聚酯和凝血酶形成的纤维成形体优选由长纤维而成。长纤维的意义及其 制造方法如上所述。
[0103] 所述由脂肪族聚酯和凝血酶形成的纤维成形体可以利用电纺丝法来制造。电纺丝 法在前述片成形体的说明中已经记载。将脂肪族聚酯与凝血酶粉末混合来制备悬浮液时， 凝血酶粉末的尺寸没有特别限定，优选在0.OflOOμm的范围。制作小于0. 01μm的凝血 酶粉末在技术上是困难的，大于100μm时，分散性差、纤维成形体变得脆弱，故不优选。
[0104] 针对本发明的片成形体的表面或层叠片成形体的各层的表面，在不损害本发明目 的的范围内，可任意地实施进一步层叠棉状的纤维结构物的加工、将棉状结构物用本发明 的层叠片成形体夹持而制成三明治结构等的加工。
[0105] 本发明的片成形体和层叠片成形体中的纤维成形体的纤维内部还可任意地包含 药剂。用电纺丝法进行成形时，只要可溶于有机溶剂或水溶液、且其生理活性不会因溶解而 受损，则对要使用的药剂没有特别限定。
[0106] 本发明的层叠片成形体包含：1层以上的由水溶性聚合物和纤维蛋白原形成的第 一聚合物组合物层、以及1层以上的由脂肪族聚酯和凝血酶形成的第二聚合物组合物层， 还可以设置它们之外的层。另外，这些各层进行层叠的顺序不做限定，也可以具有同种的层 相邻的部分。
[0107] 本发明的层叠片成形体可以是由水溶性聚合物和纤维蛋白原形成的第一聚合物 组合物层与由脂肪族聚酯和凝血酶形成的第二聚合物组合物层分别重叠而成的，也可以向 所形成的任意层上利用通常的涂覆方法进行层叠。作为所述涂覆的方法，没有特别限定，可 列举出电纺丝、电喷射、浇铸、浸渍、喷射、压制、热压等方法。其中，作为在由纤维成形体形 成的层上层叠由纤维成形体形成的层的方法，优选为电纺丝法。可以在由水溶性聚合物和 纤维蛋白原形成的纤维成形体上层叠由脂肪族聚酯和凝血酶形成的纤维成形体，也可以在 由脂肪族聚酯和凝血酶形成的纤维成形体上层叠由水溶性聚合物和纤维蛋白原形成的纤 维成形体。
[0108] 将本发明的层叠片成形体作为止血材料而适用于创伤部位时，优选以由水溶性聚 合物和纤维蛋白原形成的层接触创伤部位的方式来适用。通过这样操作，由水溶性聚合物 和纤维蛋白原形成的层刚接触创伤部位时，由水溶性聚合物和纤维蛋白原形成的层就会溶 解，纤维蛋白原充分地浸透创伤部位，接着凝血酶从由脂肪族聚酯和凝血酶形成的层中立 即被释放，从而伴随着纤维蛋白的生成而进行凝固反应。需要说明的是，由脂肪族聚酯和凝 血酶形成的层中的脂肪族聚酯作为压迫止血所需的增强材料而起作用后，随时间而分解。
[0109] 本发明的片成形体和层叠片成形体薄且柔软性优异，因此与创伤部位的密合性良 好。另外，本发明的片成形体和层叠片成形体的纤维成形体等中含有作为有效成分的纤维 蛋白原和/或凝血酶，因此与冷冻干燥品不同，担载性优异。另一方面，纤维蛋白原的溶解 性以及凝血酶的释放性和在纤维蛋白原层中的溶出性也优异，因此在短时间内表现出止血 效果。另外，用于在短时间内表现出止血效果所需的纤维蛋白原量少，在成本方面也是优异 的。另外，本发明的片成形体通过选择要使用的材料，适用于创伤部位后的创伤部位的可视 性优异。由此，能够通过目视来确认对于截止至今的制品而言较困难的止血状态，需要缝合 时可容易地确定应缝合的部位。进而，制造本发明的片成形体和层叠片成形体时不需要冷 冻干燥工序，因此生产率也优异。 实施例
[oho] 以下，通过实施例来说明本发明的实施方式，但它们不限定本发明的范围。
[0111] 〈针对实施例1飞和16?29、比较例1、2的测定方法〉 1A.蛋白质颗粒粒径(平均粒径）： 将纤维蛋白原冷冻干燥粉末用乳钵粉碎后，利用数码显微镜（KEYENCECORPORATION: 商品名"VHX-100"）以1000倍的倍率进行拍摄，从所得照片中随机地选择10个颗粒并测定 直径，将其平均值作为平均粒径。
[0112] 2A.平均纤维直径： 利用扫描型电子显微镜（KEYENCECORPORATION:商品名"VE8800"）以3000倍的倍率对 所得纤维成形体的表面进行拍摄，从所得照片中随机地选择20处并测定纤维直径，求出所 有的纤维直径的平均值来作为平均纤维直径。n=20。
[0113] 3A.平均厚度： 使用高精度数码测长机（MitutoyoCorporation:商品名"LITEMATICVL-50"）以 0.OlN的测定力、n=15对所得纤维成形体测定纤维成形体的膜厚并算出平均值。需要说明 的是，本测定中，利用测定机器可使用的最小测定力来进行测定。
[0114] 4A.单位面积重量： 将所得纤维成形体切割成50mmX100mm，测定其重量，进行换算来算出单位面积重量。
[0115] 5A.体积密度 由上述测定的单位面积重量和平均厚度的值来算出体积密度。
[0116] 6A.溶解测试：将所得纤维成形体切割成IcmXIcm，添加15μL生理盐水，确认其 溶解性。
[0117] 7Α.ELISA测定 (1)纤维蛋白原 在ELISA板（NUNC468667)中固定10μg/mL的抗人纤维蛋白原抗体（DAK0Α0080)。用 包含 0.05% 吐温 20 的PBS清洗后，将BlockAce(DSPharmaBiomedicalCo.,LtdUK-B80) 添加至各孔中，进行掩蔽。用包含0. 05%吐温20的PBS清洗后，添加被检体。使用人纤维 蛋白原（EnzymeResearchLaboratoriesNo.FIB3)作为标准品，制作了标准曲线。用包含 0. 05%吐温20的PBS清洗后，添加HRP标记抗人纤维蛋白原抗体（CPL5523)，反应后，用包 含0. 05%吐温20的PBS清洗，添加TMB试剂（KPL50-76-02 50-65-02)，静置6分钟而使其 显色。添加IMH3PO4来停止显色，用酶标仪测定0D450-650nm。
[0118] (2)凝血酶 在ELISA板（NUNC468667)中固定5μg/mL的抗人凝血酶抗体（AffinityBiologicals,Inc.、No.SAHT-AP)。用包含(λ05%吐温20的PBS清洗后，将BlockAce(DSPharma BiomedicalCo.，Ltd.UK-B80)添加至各孔中，进行掩蔽。用包含0. 05%吐温20的PBS清 洗后，添加被检体。使用人凝血酶（HaematologicTechnologies,Inc. :HCT_0020)作为标 准品，制作了标准曲线。用包含〇.05%吐温20的PBS清洗后，添加0. 1μg/mL的HRP标记 抗人凝血酶抗体（AffinityBiologicals，Inc.、No.SAHT-HRP)。反应后，用包含0. 05%吐温 20的PBS清洗，添加TMB试剂（DaKoS1599)，静置10分钟而使其显色。添加0. 5MH2SO4来 停止显色，用酶标仪测定0D450-650nm。
[0119] 8Α·凝血酶活性测定 在FALCONCorporation制造的 2008 管中添加试样 20μL、50mMTris-HCl(ρΗ8· 5) +50mMNaCl缓冲液 60μL、0. 1%PLURONICF-68 20μL，以 37°C培养 3 分钟。作为标准 品，使用了将源自人血楽的纯化〇-凝血酶（购自HaematologicTechnologies,Inc.: HCT-0020)用相同缓冲液稀释至5、2. 5、1. 25、0. 625、0. 3125U/mL而成的产物。向其反应液 中添加100μL的TestTeam显色基质S-2238(ImM:第一化学药品工业）并搅拌混合，以 37 °C反应5分钟后，添加0.IM柠檬酸溶液800μL来停止反应。将反应液200μL转移至96 孔板中，测定0D405/650。
[0120] 实施例1 将纤维蛋白原冷冻干燥粉末（B0LHEAL(注册商标，以下相同）组织粘合用：VIAL1)用乳 钵粉碎，制作了平均粒径为Hym的粉碎纤维蛋白原冷冻干燥粉末。使该粉碎了的纤维蛋 白原冷冻干燥粉末分散在乙醇中后，以达到l〇wt%的方式溶解聚乙烯基吡咯烷酮（K90和 光纯药制)，制备了纤维蛋白原冷冻干燥粉末/聚乙烯基吡咯烷酮=100/100 (w/w)的纺丝 液。在温度22°C、湿度26%以下利用电纺丝法进行纺丝，从而得到片状的纤维成形体。喷出 喷嘴的内径为〇. 8mm、电压为13. 5kV、纺丝液流量为I. 2mL/h、从喷出喷嘴至平板为止的距 离为15cm。所得纤维成形体的平均纤维直径为0. 51μm、平均厚度为285μm、单位面积重量 为2. 35mg/cm2、体积密度为82mg/cm3。实施所得纤维成形体的溶解测试时，在1秒钟以内溶 解。另外，将所得片切断成〇. 5cmX0. 5cm，用62. 5μL生理盐水提取出蛋白质并实施ELISA 测定。其结果，固定化蛋白质量为〇.54mg/cm2。所得片能够用剪刀进行修剪。
[0121] 实施例2 使实施例1中粉碎了的纤维蛋白原冷冻干燥粉末分散在乙醇中后，以达到i〇wt%的方 式溶解聚乙烯基吡咯烷酮（K90和光纯药制)，制备了纤维蛋白原冷冻干燥粉末/聚乙烯基 吡咯烷酮=100/200 (w/w)的纺丝液。在温度22°C、湿度26%以下利用电纺丝法进行纺丝， 从而得到片状的纤维成形体。喷出喷嘴的内径为〇. 8mm、电压为17kV、纺丝液流量为I. 2mL/ h、从喷出喷嘴至平板为止的距离为15cm。所得纤维成形体的平均纤维直径为0. 33μm、平 均厚度为469μηι、单位面积重量为5. 28mg/cm2、体积密度为113mg/cm3。实施所得纤维成形 体的溶解测试时，在1秒钟以内溶解。另外，将所得片切断成〇. 5cmX0. 5cm，用62. 5μL生 理盐水提取出蛋白质并实施ELISA测定。其结果，固定化蛋白质量为1.61mg/cm2。所得片 能够用剪刀进行修剪。
[0122] 实施例3 使实施例1中粉碎了的纤维蛋白原冷冻干燥粉末分散在2-丙醇中后，以达到16wt%的 方式溶解羟丙基纤维素（6-10mPa_s和光纯药制)，制备了纤维蛋白原冷冻干燥粉末/羟丙 基纤维素=20/100 (w/w)的纺丝液。在温度22°C、湿度26%以下利用电纺丝法进行纺丝，从 而得到片状的纤维成形体。喷出喷嘴的内径为〇. 8mm、电压为llkV、纺丝液流量为I. 2mL/h、 从喷出喷嘴至平板为止的距离为15cm。所得纤维成形体的平均纤维直径为0.86μm、平均 厚度为137μηι、单位面积重量为1.59mg/cm2、体积密度为116mg/cm3。实施所得纤维成形体 的溶解测试时，在1秒钟以内溶解。另外，将所得片切断成〇. 5cmX0. 5cm，用62. 5μL生理 盐水提取出蛋白质并实施ELISA测定。其结果，固定化蛋白质量为0.17mg/cm2。所得片能 够用剪刀进行修剪。
[0123] 比较例1 使实施例1中粉碎了的纤维蛋白原冷冻干燥粉末以达到15w/V%的方式溶解在 1，1，1,3,3,3-六氟-2-丙醇/MINMUMESSENTIALMEDIUMEAGLE(Sigma-Aldrich Corporation制）IOX(9/l=v/v)中。在温度22°C、湿度26%以下利用电纺丝法进行纺 丝，从而得到片状的纤维成形体。喷出喷嘴的内径为0. 8mm、电压为23. 5kV、纺丝液流量为 2. 45mL/h、从喷出喷嘴至平板为止的距离为12cm。实施所得纤维成形体的溶解测试时，未发 生溶解。
[0124] 比较例2 使纤维蛋白原冷冻干燥粉末(均包含在B0LHEAL组织粘合用中)溶解于纤维蛋白原溶解 液后，以达到16wt%的方式溶解轻丙基纤维素（6-10mPa·S和光纯药制)，制备了纤维蛋白 原冷冻干燥粉末/羟丙基纤维素=20/100 (w/w)的纺丝液，但羟丙基纤维素与纤维蛋白原 发生相分离，纤维蛋白原析出，无法进行电纺丝。
[0125] 实施例4 使实施例1中粉碎了的纤维蛋白原冷冻干燥粉末分散在2-丙醇中后，以达到16wt%的 方式溶解羟丙基纤维素（6-10mPa_s和光纯药制)，制备了纤维蛋白原冷冻干燥粉末/羟丙 基纤维素=40/100 (w/w)的纺丝液。在温度22°C、湿度26%以下利用电纺丝法进行纺丝，从 而得到片状的纤维成形体。喷出喷嘴的内径为〇. 8mm、电压为12. 5kV、纺丝液流量为I. 2mL/ h、从喷出喷嘴至平板为止的距离为15cm。所得纤维成形体的平均纤维直径为0.43μm、平 均厚度为152μηι、单位面积重量为1.86mg/cm2、体积密度为122mg/cm3。实施所得纤维成形 体的溶解测试时，在1秒钟以内溶解。另外，将所得片切断成〇. 5cmX0. 5cm，用62. 5μL生 理盐水提取出蛋白质并实施ELISA测定。其结果，固定化蛋白质量为0.30mg/cm2。所得片 能够用剪刀进行修剪。
[0126] 实施例5 使实施例1中粉碎了的纤维蛋白原冷冻干燥粉末分散在2-丙醇中后，以达到16wt%的 方式溶解羟丙基纤维素（6-10mPa_s和光纯药制)，制备了纤维蛋白原冷冻干燥粉末/羟丙 基纤维素=100/100(W/w)的纺丝液。在温度22°C、湿度26%以下利用电纺丝法进行纺丝，从 而得到片状的纤维成形体。喷出喷嘴的内径为〇. 8mm、电压为12. 5kV、纺丝液流量为I. 2mL/ h、从喷出喷嘴至平板为止的距离为15cm。所得纤维成形体的平均纤维直径为0.35μm、平 均厚度为191μηι、单位面积重量为2. 74mg/cm2、体积密度为143mg/cm3。实施所得纤维成形 体的溶解测试时，在1秒钟以内溶解。另外，将所得片切断成〇. 5cmX0. 5cm，用62. 5μL生 理盐水提取出蛋白质并实施ELISA测定。其结果，固定化蛋白质量为0.51mg/cm2。所得片 能够用剪刀进行修剪。
[0127] 实施例6 〈由脂肪族聚酯和凝血酶形成的层的制作〉 使与实施例1同样地用乳钵粉碎了的凝血酶冷冻干燥粉末（B0LHEAL组织粘合用：VIAL3)分散在乙醇中后，添加二氯甲烷，以达到10wt%的方式溶解聚乳酸（PL18Purac Biomaterialcompany制)，制备了凝血酶冷冻干燥粉末/聚乳酸=100/100 (w/w)的纺丝 液。在温度22°C、湿度26%以下利用电纺丝法进行纺丝，从而得到片状的纤维成形体。喷出 喷嘴的内径为〇. 8mm、电压为15kV、纺丝液流量为3. 0mL/h、从喷出喷嘴至平板为止的距离 为25cm。将所得片切断成2cmX2cm，用ImL生理盐水提取出蛋白质并实施活性·ELISA测 定。其结果，活性测定值为23U/cm2、ELISA测定值为16μg/cm2。
[0128] 〈组织粘合效果评价试验〉 为了确认纤维蛋白原的活性，利用实施例5中制作的由水溶性聚合物和纤维蛋白原形 成的层与实施例6中制作的由脂肪族聚酯和凝血酶形成的层的组合来进行粘合试验。关于 粘合力，使兔子的皮与该片（2cmX2cm)粘合，确认是否形成纤维蛋白凝胶、是否粘合。此时， 对于重叠的片，事先向由水溶性聚合物和纤维蛋白原形成的层中添加200μL水，经过40秒 钟后将由水溶性聚合物和纤维蛋白原形成的层贴附于兔子的皮。其后，以37°C静置3分钟 后，确认了皮与片的粘合性。作为对照，使用了固定有纤维蛋白粘合材料的成分的胶原片制 齐U(制品名：TachoComb/CSL?一U >夕''(株)）：纤维蛋白原和凝血酶等成分以海绵状的马 胶原的片作为支撑体并利用真空干燥而固接在片的单面而成的制剂：2cmX2Cm)。其结果， 评价对象的片显示出比较对照的胶原片制剂以上的粘合力。
[0129] 〈考察〉 比较例 1 中使用 1，1，1，3, 3, 3-六氟-2-丙醇/MINMUM ESSENTIAL MEDIUM EAGLE IOX (9/l=v/v)是为了能够利用电纺丝法由纤维蛋白原冷冻干燥粉末制造纤维成形体。纤维蛋 白原难以溶于水性溶剂，因此该纤维蛋白原冷冻干燥粉末中包含用于增加纤维蛋白原的溶 解性的添加剂。该比较例1中，尽管直接使用了这样的纤维蛋白原冷冻干燥粉末，在将其制 成纤维成形体时，也观察不到纤维蛋白原从其中溶出。
[0130] 与此相对，如实施例1-5那样，通过将纤维蛋白原制成平均粒径为0. OflOO μ m的 颗粒、经由其分散液而将其制成在水和乙醇中含有溶解性聚合物的形态，从而实现在1秒 钟以内溶解。另外，由实施例6可知：本发明的片成形体中的止血性蛋白质的生理活性得以 保持。
[0131] 另一方面，比较例2中，按照国际公开W02009/031620号，尝试了将B0LHEAL的纤 维蛋白原冷冻干燥粉末溶解于其纤维蛋白原溶解液，并将其与水溶性纤维素衍生物溶液混 合的方法，但无法获得均匀的组合物。
[0132] 〈针对实施例疒13的测定法〉 1B.纺丝用涂料中的纤维蛋白原、凝血酶、和纤维蛋白的分散性： 通过目视来观察即将添加脂肪族聚酯之前的纤维蛋白原、凝血酶、以及纤维蛋白的分 散液，确认了这些蛋白质的分散性。
[0133] 2B.纤维成形体的厚度：利用与IA相同的方法来测定。
[0134] 3B.纤维直径(平均纤维直径）：利用与2A相同的方法来测定。
[0135] 4B.片的处理性： 定性地评价所得纤维成形体是否能够容易地处理。
[0136] 实施例7 使用气流磨（株式会社七4 ^企业：商品名"ultrasmallamountlabjetmill，'） 对纤维蛋白原冷冻干燥粉末（BOLHEAL组织粘合用：VIALl)进行微粒化。将其添加至乙醇 (和光纯药工业株式会社制)中，利用超声波浴实施5分钟的处理，制备了分散性优异的纤维 蛋白原分散液。向所得分散液中添加二氯甲烷(和光纯药工业株式会社制）和L体100%聚 乳酸（PurasorbPL18、Purac公司制)，将聚乳酸溶解而制备均勻的溶液。以所得纺丝用聚 乳酸溶液的聚乳酸浓度为10重量％、纤维蛋白原冷冻干燥粉末浓度为4重量％(以纤维蛋白 原计为I. 8重量％)、乙醇与二氯甲烷之比达到1:8的重量比的方式进行制备。目视观察聚 乳酸添加前的蛋白质/有机溶剂分散液时可知：没有沉淀而处于均匀的分散状态。将所得 聚乳酸溶液在30%以下的湿度下利用电纺丝法进行纺丝，从而得到片状的纤维成形体。喷 出喷嘴的内径为〇. 8mm、电压为12kV、从喷出喷嘴至平板为止的距离为25cm。上述平板在纺 丝时用作阴极。所得纤维成形体的平均纤维直径为3. 3μm、厚度为161μm，柔软且能够处 理。需要说明的是，使用二氯甲烷来代替上述乙醇时(实施例14)，可见所得纤维成形体的处 理性降低，从该观点出发可以认为乙醇是更优选的。
[0137] 实施例8 将凝血酶冷冻干燥粉末（B0LHEAL组织粘合用：VIAL3)添加至乙醇(和光纯药工业株式 会社制）中，利用超声波浴实施5分钟的处理，制备了分散性优异的凝血酶分散液。向所得 分散液中添加二氯甲烷(和光纯药工业株式会社制）和L体100%聚乳酸（PurasorbPL18、 Purac公司制)，将聚乳酸溶解而制备均匀的溶液。以所得纺丝用聚乳酸溶液的聚乳酸浓度 为10重量％、凝血酶冷冻干燥粉末浓度为4重量％(以凝血酶计为0. 045重量％)、乙醇与二 氯甲烷之比达到1:8的重量比的方式进行制备。目视观察聚乳酸添加前的蛋白质/有机溶 剂分散液时可知：没有沉淀而处于均匀的分散状态。将所得聚乳酸溶液在30%以下的湿度 下利用电纺丝法进行纺丝，从而得到片状的纤维成形体。喷出喷嘴的内径为〇. 8mm、电压为 12kV、从喷出喷嘴至平板为止的距离为25cm。上述平板在纺丝时用作阴极。所得纤维成形 体的平均纤维直径为6. 2μm、厚度为170μm，柔软且能够处理。需要说明的是，使用二氯甲 烷来代替上述乙醇时（实施例15)，可见所得纤维成形体的处理性降低，从该观点出发可以 认为乙醇是更优选的。
[0138] 实施例9 将凝血酶冷冻干燥粉末（B0LHEAL组织粘合用：VIAL3)添加至乙醇(和光纯药工业株式 会社制）中，利用超声波浴实施5分钟的处理，制备了分散性优异的凝血酶分散液。向所得 分散液中添加二氯甲烷(和光纯药工业株式会社制）和L体100%聚乳酸（PurasorbPL18、 Purac公司制)，将聚乳酸溶解而制备均匀的溶液。以所得纺丝用聚乳酸溶液的聚乳酸浓度 为10重量％、凝血酶冷冻干燥粉末浓度为7重量％(以凝血酶计为0. 078重量％)、乙醇与二 氯甲烷之比达到1:8的重量比的方式进行制备。目视观察聚乳酸添加前的蛋白质/有机溶 剂分散液时可知：没有沉淀而处于均匀的分散状态。将所得聚乳酸溶液在30%以下的湿度 下利用电纺丝法进行纺丝，从而得到片状的纤维成形体。喷出喷嘴的内径为〇. 8mm、电压为 12kV、从喷出喷嘴至平板为止的距离为25cm。上述平板在纺丝时用作阴极。所得纤维成形 体的平均纤维直径为8. 1μm、厚度为175μm，柔软且能够处理。
[0139] 实施例10 将凝血酶冷冻干燥粉末（B0LHEAL组织粘合用：VIAL3)添加至乙醇(和光纯药工业株式 会社制）中，利用超声波浴实施5分钟的处理，制备了分散性优异的凝血酶分散液。向所得 分散液中添加二氯甲烷(和光纯药工业株式会社制）和L体100%聚乳酸（PurasorbPL18、 Purac公司制)，将聚乳酸溶解而制备均匀的溶液。以所得纺丝用聚乳酸溶液的聚乳酸浓度 为10重量％、凝血酶冷冻干燥粉末浓度为10重量％(以凝血酶计为0. 11重量％)、乙醇与二 氯甲烷之比达到1:8的重量比的方式进行制备。目视观察聚乳酸添加前的蛋白质/有机溶 剂分散液时可知：没有沉淀而处于均匀的分散状态。将所得聚乳酸溶液在30%以下的湿度 下利用电纺丝法进行纺丝，从而得到片状的纤维成形体。喷出喷嘴的内径为0. 8mm、电压为 12kV、从喷出喷嘴至平板为止的距离为25cm。上述平板在纺丝时用作阴极。所得纤维成形 体的平均纤维直径为9. 4μm、厚度为210μm，柔软且能够处理。
[0140] 实施例11 将凝血酶冷冻干燥粉末（B0LHEAL组织粘合用：VIAL3)添加至乙醇(和光纯药工业株式 会社制）中，利用超声波浴实施5分钟的处理，制备了分散性优异的凝血酶分散液。向所得 分散液中添加二氯甲烷(和光纯药工业株式会社制）和聚乙醇酸-聚乳酸共聚物（Purasorb roLG5010、Purac公司制)，将聚乙醇酸-聚乳酸共聚物溶解而制备均匀的溶液。以所得纺丝 用聚乙醇酸-聚乳酸共聚物溶液的聚合物浓度为10重量％、凝血酶冷冻干燥粉末浓度为5 重量％ (以凝血酶计为0. 06重量％)、乙醇与二氯甲烷之比达到1:8的重量比的方式进行制 备。目视观察聚乙醇酸-聚乳酸共聚物添加前的蛋白质/有机溶剂分散液时可知：没有沉 淀而处于均匀的分散状态。将所得聚乙醇酸-聚乳酸共聚物溶液在30%以下的湿度下利用 电纺丝法进行纺丝,从而得到片状的纤维成形体。喷出喷嘴的内径为0. 8mm、电压为15kV、 从喷出喷嘴至平板为止的距离为25cm。上述平板在纺丝时用作阴极。所得纤维成形体的平 均纤维直径为4. 8μm、厚度为330μm，柔软且能够处理。
[0141] 实施例12 将凝血酶冷冻干燥粉末（B0LHEAL组织粘合用：VIAL3 )添加至2-丙醇(和光纯药工业株 式会社制)中，利用超声波浴实施5分钟的处理，制备了分散性优异的凝血酶分散液。向所得 分散液中添加二氯甲烷(和光纯药工业株式会社制）和聚乙醇酸-聚乳酸共聚物（Purasorb roLG5010、Purac公司制)，将聚乙醇酸-聚乳酸共聚物溶解而制备均匀的溶液。以所得纺丝 用聚乙醇酸-聚乳酸共聚物溶液的聚合物浓度为10重量％、凝血酶冷冻干燥粉末浓度为5 重量％(以凝血酶计为0. 06重量％)、2_丙醇与二氯甲烷之比达到1:8的重量比的方式进行 制备。目视观察聚乙醇酸-聚乳酸共聚物添加前的蛋白质/有机溶剂分散液时可知：没有 沉淀而处于均匀的分散状态。所得聚乙醇酸-聚乳酸共聚物溶液在30%以下的湿度下利用 电纺丝法进行纺丝,从而得到片状的纤维成形体。喷出喷嘴的内径为0. 8mm、电压为15kV、 从喷出喷嘴至平板为止的距离为25cm。上述平板在纺丝时用作阴极。所得纤维成形体的平 均纤维直径为6. 4μm、厚度为320μm，柔软且能够处理。
[0142] 实施例13 使凝血酶冷冻干燥粉末(将重组凝血酶lmg/mL、3. 4%氯化钠、1. 2%柠檬酸钠、0. 29%氯 化钙、1%甘露醇PH7冷冻干燥而成)分散在乙醇中后，添加二氯甲烷，以达到10重量％的方 式溶解聚乙醇酸-聚乳酸共聚物（PurasorbFiDLGSOKKPurac公司制)，制备了凝血酶冷冻 干燥粉末/聚乙醇酸-聚乳酸共聚物=1〇〇 (以凝血酶计为1.67)/100 (w/w)的纺丝液。在 温度26°C、湿度29%以下利用电纺丝法进行纺丝，从而得到片状的纤维成形体。喷出喷嘴的 内径为0. 8mm、电压为20V、纺丝液流量为4.OmL/h、从喷出喷嘴至进行了接地的平板为止的 距离为35cm。所得纤维成形体的厚度为136μm，柔软且能够处理。利用溶出试验来确认所 得片的凝血酶溶出性。试验方法如下所示。
[0143] 〈溶出试验〉 (1)将试样冲切成直径6mm的大小，测定质量。
[0144] (2)将试样放入微管中，利用含HPC的生理盐水或生理盐水来实施溶出试验。
[0145] (3)取样时间为 10、30、60、120 秒。
[0146] (4)利用液相色谱仪对所采取的试样进行测定，由峰面积求出凝血酶含量。
[0147] (5)利用下述式求出溶出率。 溶出率（％) =所得凝血酶含量/理论固定化凝血酶含量X100。
[0148] 理论固定化凝血酶含量由所投入的凝血酶重量％和纤维成形体的单位面积重量 来算出。
[0149] 将溶出试验的结果示于图1。含HPC的生理盐水与生理盐水相比溶出率提高。由 此可知：对于本发明的层叠片成形体而言，使片中含有HPC会有助于提高凝血酶的溶出率。
[0150] 〈针对实施例1Γ15、比较例3?4的测定方法〉 1C.止血性蛋白质颗粒粒径(平均粒径）： 利用数码显微镜（KEYENCECORPORATION:商品名"VHX-100")，以1000倍的倍率对纺 丝溶液进行拍摄，从所得照片中随机地选择10个颗粒并测定直径，将其平均值作为平均粒 径。
[0151] 2C.纤维成形体的厚度：利用与IA相同的方法来测定。
[0152] 3C.纤维直径(平均纤维直径）：利用与2A相同的方法来测定。
[0153] 4C.止血性蛋白质的溶出试验： 将所得纤维成形体切成2cmX2cm，在ImL生理盐水中浸渍3分钟或3小时，从而使水溶 性成分溶出。以n=3飞来测定前后的重量变化，求出由以下式算出的提取率的平均值。水 溶性成分理论重量由投入的止血性蛋白质重量％与纤维成形体的单位面积重量而算出。 提取率[%]=(重量减少[mg]/水溶性成分理论重量[mg])X100。
[0154] 5C.止血性蛋白质的担载性试验： 将所得纤维成形体切成IcmX lcm，将其用剪刀切分成大致4等分。测定前后的重量，算 出重量变化。 重量变化[%]=(分割后的重量[mg]/分割前的重量[mg])X100。
[0155] 6C.纤维成形体的柔软性试验： 以（JIS-L-1906 8. 19. 2B法）玻片法作为参考，将试验片的尺寸设为0. 5cmX3. 5cm， 利用以下的步骤进行柔软性测定。使试验机主体与移动台的上表面保持一致，然后以宽度 0. 5cm的部分被盖玻片与试验机主体夹持的形态设置试验片。使移动台下降，由标尺算出试 验片的自由端离开移动台时的下降长度S值（δ值越大则柔软性越高)。
[0156] 实施例14 使用气流磨（株式会社七4 ^企业：商品名"ultrasmallamountlabjetmill，'） 对纤维蛋白原冷冻干燥粉末（BOLHEAL组织粘合用：VIALl)进行微粒化。将其添加至二氯 甲烷(和光纯药工业株式会社制)中，利用超声波浴实施5分钟的处理，从而制备了纤维蛋白 原分散液。添加L体100%聚乳酸（PurasorbPL18、Purac公司制)，将聚合物溶解而制备溶 液。以所得纺丝用聚合物溶液的聚合物浓度为10重量％、纤维蛋白原冷冻干燥粉末浓度为 4重量％ (以纤维蛋白原计为1.8重量％)的方式进行制备。在纺丝溶液中分散的纤维蛋白 原的粒径为12μm。将所得聚合物溶液在30%以下的湿度下利用电纺丝法进行纺丝，从而 得到片状的纤维成形体。喷出喷嘴的内径为〇. 8_、电压为12kV、从喷出喷嘴至平板为止的 距离为25cm。上述平板在纺丝时用作阴极。所得纤维成形体的平均纤维直径为14.9μm、 厚度为325μπι。由片重量和投料比算出的、片中包含的纤维蛋白原量为0.43mg/cm2。浸渍 3小时后的提取率为40%。担载性试验中未发生重量变化(保持100%)。由柔软性试验得到 的S值为2. 7cm。
[0157] 实施例15 将凝血酶冷冻干燥粉末（BOLHEALVIAL3)(冷冻干燥粉末40mg中包含1. 12%的凝血酶 (750unit)。）添加在二氯甲烷(和光纯药工业株式会社制）中，利用超声波浴实施5分钟的 处理，从而制备了凝血酶分散液。添加L体100%聚乳酸（PurasorbPL18、Purac公司制)， 将聚合物溶解而制备溶液。以所得纺丝用聚合物溶液的聚合物浓度为10重量％、凝血酶冷 冻干燥粉末浓度为4重量％ (以凝血酶计为0. 045重量％或750单元（U) /g)的方式进行 制备。在纺丝溶液中分散的凝血酶的粒径为9μm。将所得聚合物溶液在30%以下的湿度 下利用电纺丝法进行纺丝，从而得到片状的纤维成形体。喷出喷嘴的内径为〇. 8mm、电压为 12kV、从喷出喷嘴至平板为止的距离为25cm。上述平板在纺丝时用作阴极。所得纤维成形 体的平均纤维直径为16. 6μm、厚度为291μm。由片重量和投料比算出的、片中包含的凝血 酶量为 3L39U/cm2。
[0158] 比较例3 将凝血酶冷冻干燥粉末（BOLHEAL组织粘合用：VIAL3)添加至乙醇(和光纯药工业株式 会社制）中，利用超声波浴实施5分钟的处理，制备了凝血酶分散液。向所得分散液中添加 二氯甲烧(和光纯药工业株式会社制)和L体100%聚乳酸（PurasorbPL18、Purac公司制)， 将聚合物溶解而制备均匀的溶液。以所得纺丝用聚合物溶液的聚合物浓度为10重量％、凝 血酶冷冻干燥粉末浓度为4重量％ (以凝血酶计为0. 045重量％或750U/g)、乙醇与二氯甲 烷之比达到1:8的重量比的方式进行制备。在纺丝溶液中分散的凝血酶的粒径为12μm。 将该聚合物溶液风干而制成固体状态。与纤维成形体同样地进行溶出试验，结果在浸渍3 分钟后提取了约3%的水溶性成分。
[0159] 比较例4 作为纤维成形体，使用聚乙醇酸系无纺布即才、才?一>(注册商标、GUNZELTD.制)， 按照以下的步骤来制作纤维蛋白原固定化片(冷冻干燥法)。将市售的生物体组织粘合材料 (制品名：BOLHEAL:-般财团法人化学及血清疗法研究所制）的试剂盒中包含的纤维蛋白原 溶液I. 25mL染色在上述纤维成形体（5X5cm2)上。将该被检体冷冻后,冷冻干燥24小时后 作为纤维蛋白原固定化片。在担载性试验中，所担载的纤维蛋白原崩塌，以粉末的形式损失 (重量变化为89%)。由柔软性试验得到的δ值为〇.7cm。
[0160] 〈针对实施例16~29的测定方法〉 1D.蛋白质粉末粒径(平均粒径） 将纤维蛋白原冷冻干燥粉末用乳钵粉碎后，利用激光衍射式粒度分布测定装置(Malvern:商品名"Mastersizer2000"）测定粒度分布，将D50值（中值粒径）作为平均粒 径。
[0161] 2D.纤维蛋白原含量测定 将所得片切成Φ0. 5cm后，利用0. 1%TFA溶液来提取纤维蛋白原，用高效液相色谱仪进 行定量。
[0162] 〈试验条件〉 检测器：紫外吸光光度计(测定波长：214nm) 柱：AgilentBioSEC-3 (3ym、30nm、4.6X300mm、AgilentTechnologies) 柱温：35°C取样器温度：5°C 流动相：含〇. 1%TFA的水/含0. 1%TFA的乙腈=50/50 流量：〇· 5mT,/miη 分析时间：IOmin。
[0163] 实施例16 〈由水溶性聚合物和纤维蛋白原形成的片成形体的制作〉 使纤维蛋白原冷冻干燥粉末（B0LHEAL组织粘合用：VIAL1)分散在2-丙醇中后，以达到16重量％的方式溶解羟丙基纤维素（6-10mPa·s、和光纯药工业株式会社制)，制备了纤维蛋 白原冷冻干燥粉末/羟丙基纤维素=100(以纤维蛋白原计为46)/100 (w/w)的纺丝液。在 温度22°C、湿度26%以下利用电纺丝法进行纺丝，从而得到片状的纤维成形体。喷出喷嘴的 内径为0. 8_、电压为12. 5kV、纺丝液流量为I. 2mL/h、从喷出喷嘴至进行了接地的平板为 止的距离为15cm。所得纤维成形体的平均纤维直径为0. 35 μ m、平均厚度为191 μ m、单位面 积重量为2. 74mg/cm2、体积密度为143mg/cm3。将所得片切断成0. 5cmX0. 5cm，用62. 5 μ L 的生理盐水来提取蛋白质，实施了ELISA测定("7Α. ELISA测定（1)纤维蛋白原"中记载的 方法)。其结果，固定化蛋白质量为0. 51mg/cm2。
[0164] 实施例17 〈由脂肪族聚酯和凝血酶形成的片成形体的制作〉 使凝血酶冷冻干燥粉末（B0LHEAL组织粘合用：VIAL3)分散在乙醇中后，添加二氯甲 烧，以达到10重量％的方式溶解聚乳酸（PL18PuracBiomaterialcompany制)，制备了 凝血酶冷冻干燥粉末/聚乳酸=100(以凝血酶计为1.1)/100 (w/w)的纺丝液。在温度 22°C、湿度26%以下利用电纺丝法进行纺丝，从而得到片状的纤维成形体。喷出喷嘴的内径 为0. 8mm、电压为15kV、纺丝液流量为3.OmL/h、从喷出喷嘴至进行了接地的平板为止的距 离为25cm。所得纤维成形体的平均纤维直径为9. 37μm、平均厚度为210μm、单位面积重量 为3. 15mg/cm2、体积密度为150mg/cm3。将所得片切断至2cmX2cm，用ImL生理盐水来提取 蛋白质，实施了活性("8A.凝血酶活性测定"中记载的方法）_ELISA测定("7A.ELISA测 定（2)凝血酶"中记载的方法)。其结果，活性测定值为23.OU/cm2、ELISA测定值为16μg/ cm2。
[0165] 实施例18 〈层叠片成形体的组织粘合效果评价试验〉 为了确认以实施例16中制作的由水溶性聚合物和纤维蛋白原形成的片成形体与实施 例17中制作的由脂肪族聚酯和凝血酶形成的片成形体的组合来使用时的效果，进行粘合 力的比较。关于粘合力，使兔子的皮与该片（2cmX2cm)粘合，确认是否形成纤维蛋白凝胶、 是否粘合。此时，对于重叠的片，事先将200μL水添加至由水溶性聚合物和纤维蛋白原形 成的片成形体，经过40秒钟后将由水溶性聚合物和纤维蛋白原形成的片成形体贴附于兔 子的皮。其后，以37°C静置3分钟后，确认了皮与片成形体的粘合性。作为对照，使用了固 定有纤维蛋白粘合材料的成分的胶原片制剂（制品名：TachoComb/CSL?一U>夕'' (株)）： 纤维蛋白原和凝血酶等成分以海绵状的马胶原的片作为支撑体并利用真空干燥而固接在 片的单面而成的制剂：2CmX2cm)。其结果，本发明的层叠片成形体显示出比较对照的胶原 片制剂以上的粘合力。
[0166] 实施例19 〈由水溶性聚合物和纤维蛋白原形成的片成形体的制作〉 使纤维蛋白原冷冻干燥粉末（B0LHEAL组织粘合用：VIAL1)分散在2-丙醇中后，以达 到16重量％的方式溶解羟丙基纤维素（6-10mPa·s和光纯药工业株式会社制)，制备了纤 维蛋白原冷冻干燥粉末/羟丙基纤维素=100 (以纤维蛋白原计为46)/100 (w/w)的纺丝 液。以温度22°C、湿度26%以下利用电纺丝法进行纺丝，从而得到片状的纤维成形体。喷出 喷嘴的内径为〇. 8mm、电压为12. 5kV、纺丝液流量为I. 2mL/h、从喷出喷嘴至进行了接地的 平板为止的距离为15cm。所得纤维成形体的平均纤维直径为0. 35μm、平均厚度为191μm、 单位面积重量为2. 74mg/cm2、体积密度为143mg/cm3。将所得片以20kGy进行了电子射线灭 菌。将进行了灭菌的片切断成〇. 5cmX0. 5cm，用62. 5μL生理盐水来提取蛋白质，实施了 ELISA测定("7Α.ELISA测定（1)纤维蛋白原"中记载的方法)。其结果，固定化蛋白质量为 0· 78mg/cm2。
[0167] 实施例20 〈由脂肪族聚酯和凝血酶形成的片成形体的制作〉 使凝血酶冷冻干燥粉末（B0LHEAL组织粘合用：VIAL3)分散在乙醇中后，添加二氯甲 烧，以达到10重量％的方式溶解聚乳酸（PL18PuracBiomaterialcompany制)，制备了 凝血酶冷冻干燥粉末/聚乳酸=100 (以凝血酶计为1.1)/100 (w/w)的纺丝液。在温度 22°C、湿度26%以下利用电纺丝法进行纺丝，从而得到片状的纤维成形体。喷出喷嘴的内径 为0. 8mm、电压为15kV、纺丝液流量为3.OmL/h、从喷出喷嘴至进行了接地的平板为止的距 离为25cm。所得纤维成形体的平均纤维直径为9. 37μm、平均厚度为210μm、单位面积重量 为3. 15mg/cm2、体积密度为150mg/cm3。将所得片成形体以20kGy进行了电子射线灭菌。将 所得片成形体切断成2cmX2cm，用ImL生理盐水来提取蛋白质，实施了活性("8A.凝血酶 活性测定"中记载的方法）·ELISA测定("7A.ELISA测定（2)凝血酶"中记载的方法)。其 结果，活性测定值为14. 7U/cm2、ELISA测定值为11. 4μg/cm2。
[0168] 实施例21 〈对兔子肝脏渗出性出血的止血效果〉 将实施例19中制作的由水溶性聚合物和纤维蛋白原形成的片成形体与实施例20中制 作的由脂肪族聚酯和凝血酶形成的片成形体组合使用时的止血效果与使用TachoComb时 的止血效果进行对比。
[0169] 作为动物的止血模型，使用了兔子。对兔子进行剖腹，切出一部分肝脏，对其出血 部位重叠适用由水溶性聚合物和纤维蛋白原形成的片成形体以及由脂肪族聚酯和凝血酶 形成的片成形体，观察其止血效果(是否止血、出血量)。试验方法如下所示。
[0170] (1)肌肉内给予SelactarlOmg/kg(约I.OmL)、Ketalar50mg/kg(约 3.OmL)。
[0171] (2)测定体重，将腹部剃毛后，以仰卧位保持固定。
[0172] (3)由耳静脉进行持续麻醉（2%Ketalar、添加20U/mL肝素的生理盐水)。
[0173] (4)利用正中切口而从胸骨剑突正下方剖腹至下腹部。
[0174] (5)由耳静脉给予300U/kg的肝素钠注射液。
[0175] (6)使用肠用镊子、纱布等，引出对于制作创伤而言具有充分厚度的肝叶(外侧左 叶、内侧左叶、右叶)。
[0176] (7)用皮肤打孔器(皮^)对肝叶制作直径10mm、深度4mm的创伤，用手术刀切 除该部分。
[0177] (8)将源自切除创口的出血用BENSHEET吸收10秒钟，测定其重量。将创伤部出血 为0. 5g以上的伤口用于试验。
[0178] (9)在创伤部位上叠加被切成2. 5cm见方的由水溶性聚合物和纤维蛋白原形成的 层以及由脂肪族聚酯和凝血酶形成的层，对出血部位适用由水溶性聚合物和纤维蛋白原形 成的层，压迫1分钟。作为对照而使用TachoComb时，切断成2. 5cm见方后，滴加312. 5μ L 的生理盐水，适用于出血部位，压迫1分钟。
[0179] (10)压迫后，确认是否出血并将源自创伤部位的出血用BENSHEET吸收，测定其重 量。
[0180] 其结果，使用本发明的层叠片成形体时，血被止住（n=l)，适用后1分钟的出血量 极微量，为〇. 〇〇3g。另一方面，作为对照而使用TachoComb时（n=5)，适用后1分钟的出血 量为I. 57g，止血效果不充分，出血量多。
[0181] 实施例22 〈由脂肪族聚酯和凝血酶形成的片成形体的制作〉 使凝血酶冷冻干燥粉末(将重组凝血酶lmg/mL、3. 4%氯化钠、1. 2%柠檬酸钠、0. 29%氯 化钙、1%甘露醇PH7冷冻干燥而成)分散在乙醇中后，添加二氯甲烷，以达到10重量％的方 式溶解聚乙醇酸-聚乳酸共聚物（PurasorbFiDLGSOKKPurac公司制)，制备了凝血酶冷冻 干燥粉末/聚乙醇酸-聚乳酸共聚物=1〇〇 (以凝血酶计为1.67)/100 (w/w)的纺丝液。在 温度22°C、湿度26%以下利用电纺丝法进行纺丝，从而得到片状的纤维成形体。喷出喷嘴的 内径为0. 8mm、电压为20kV、纺丝液流量为4.OmL/h、从喷出喷嘴至进行了接地的平板为止 的距离为35cm。所得纤维成形体的平均纤维直径为3. 8μm、平均厚度为127μm、单位面积 重量为I. 38mg/cm2、体积密度为109mg/cm3。将所得片成形体切成ΦΙαιι，用200μL的生理 盐水来提取蛋白质，实施了凝血酶活性测定("8Α.凝血酶活性测定"中记载的方法)。其结 果，活性测定值为18.3U/cm2。
[0182] 实施例23 〈含有由水溶性聚合物和纤维蛋白原形成的层以及由脂肪族聚酯和凝血酶形成的层而 成的层叠片成形体的制作〉 将纤维蛋白原冷冻干燥粉末(将重组纤维蛋白原lOmg/mL、IOmM精氨酸、130mM氯化钠、 〇. 5%甘露醇pH8. 5冷冻干燥而成）用乳钵粉碎，从而制作了平均粒径为30μm的粉碎纤维 蛋白原冷冻干燥粉末。使该进行了粉碎的纤维蛋白原冷冻干燥粉末分散在2-丙醇中后，以 达到15重量％的方式溶解羟丙基纤维素（2. 0-2. 9mPa·s日本曹达株式会社制）和聚乙二 醇(分子量：400三洋化成工业株式会社制)，制备了纤维蛋白原冷冻干燥粉末/羟丙基纤 维素/聚乙二醇=51 (以纤维蛋白原计为25. 92)/34/15 (w/w/w)的涂料液。使用所得涂 料液，利用流延法来制作膜。涂布间隔为127μπι、涂布速度为30.lmm/sec。制作膜后，在 1分钟以内从上部积载实施例22中制作的由脂肪族聚酯和凝血酶形成的层，从而得到含有 由水溶性聚合物和纤维蛋白原形成的层以及由脂肪族聚酯和凝血酶形成的层而成的层叠 片成形体。所得层叠片成形体的平均膜厚为157μm。将所得层叠片成形体以20kGy进行了 电子射线灭菌。将所得层叠片成形体切成Φlcm，用200μL的生理盐水来提取蛋白质，实施 纤维蛋白原的ELISA测定("7Α.ELISA测定（1)纤维蛋白原"中记载的方法)。其结果，固 定化蛋白质量为〇· 58mg/cm2。
[0183] 实施例24 〈对兔子肝脏渗出性出血的止血效果〉 将实施例23中制作的含有由水溶性聚合物和纤维蛋白原形成的层以及由脂肪族聚酯 和凝血酶形成的层而成的层叠片成形体的止血效果与使用TachoSil时的止血效果进行对 比。
[0184] 作为动物的止血模型，使用了兔子。对兔子进行剖腹，切出一部分肝脏，对其出血 部位适用含有由水溶性聚合物和纤维蛋白原形成的层以及由脂肪族聚酯和凝血酶形成的 层而成的层叠片成形体，观察其止血效果(是否止血、出血量)。试验方法与实施例21中记 载的方法相同。
[0185] 其结果，使用了本发明的层叠片成形体时（n=4)，适用后1分钟的出血量极微量， 为0. 003g。另一方面，作为对照而使用TachoSil时（n=4)，适用后1分钟的出血量为0. 65g， 止血效果不充分，出血量多。
[0186] 实施例25 〈由脂肪族聚酯和凝血酶形成的片成形体的制作〉 使凝血酶冷冻干燥粉末(将重组凝血酶lmg/mL、3. 4%氯化钠、1. 2%柠檬酸钠、0. 29%氯 化钙、1%甘露醇PH7冷冻干燥而成)分散在乙醇中后，添加二氯甲烷，以达到10重量％的方 式溶解聚乙醇酸-聚乳酸共聚物（PurasorbFiDLGSOKKPurac公司制)，制备了凝血酶冷冻 干燥粉末/聚乙醇酸-聚乳酸共聚物=1〇〇 (以凝血酶计为1.67)/100 (w/w)的纺丝液。在 温度22°C、湿度26%以下利用电纺丝法进行纺丝，从而得到片状的纤维成形体。喷出喷嘴的 内径为0. 8mm、电压为20kV、纺丝液流量为4.OmL/h、从喷出喷嘴至进行了接地的平板为止 的距离为35cm。所得纤维成形体的平均纤维直径为2. 97μm、平均厚度为137μm、单位面积 重量为1.49mg/cm2、体积密度为108mg/cm3。
[0187] 实施例26 〈含有由水溶性聚合物和纤维蛋白原形成的层以及由脂肪族聚酯和凝血酶形成的层而 成的层叠片成形体的制作〉 将纤维蛋白原冷冻干燥粉末(将重组纤维蛋白原lOmg/mL、IOmM精氨酸、130mM氯化钠、 〇. 5%甘露醇pH8. 5冷冻干燥而成）用乳钵粉碎，从而制作了平均粒径为30μm的粉碎纤维 蛋白原冷冻干燥粉末。使该进行了粉碎的纤维蛋白原冷冻干燥粉末分散在2-丙醇中后，以 达到2. 9重量％的方式溶解羟丙基纤维素（2. 0-2. 9mPa·s日本曹达株式会社制）和聚乙 二醇(分子量：400三洋化成工业株式会社制)，制备了纤维蛋白原冷冻干燥粉末/羟丙基 纤维素/聚乙二醇=90 (以纤维蛋白原计为36. 98)/7/3 (w/w/w)的涂料液。使用所得涂 料液，利用流延法来制作膜。涂布间隔为50.8μm、涂布速度为30.lmm/sec。制作膜后，在 1分钟以内从上部积载实施例25中制作的由脂肪族聚酯和凝血酶形成的层，从而得到含有 由水溶性聚合物和纤维蛋白原形成的层以及由脂肪族聚酯和凝血酶形成的层而成的层叠 片成形体。所得层叠片成形体的平均膜厚为169μm。将所得层叠片成形体切成Φ0. 5cm， 用0. 1%TFA溶液来提取纤维蛋白原，利用高效液相色谱仪来进行定量("2D.纤维蛋白原含 量测定"中记载的方法)。其结果，固定化蛋白质量为0. 54mg/cm2。
[0188] 实施例27 〈对兔子肝脏渗出性出血的止血效果〉 将实施例26中制作的含有由水溶性聚合物和纤维蛋白原形成的层以及由脂肪族聚酯 和凝血酶形成的层而成的层叠片成形体的止血效果与使用TachoSil时的止血效果进行对 比。
[0189] 作为动物的止血模型，使用了兔子。对兔子进行剖腹，切出一部分肝脏，对其出血 部位适用含有由水溶性聚合物和纤维蛋白原形成的层以及由脂肪族聚酯和凝血酶形成的 层而成的层叠片成形体，观察其止血效果(是否止血、出血量)。试验方法与实施例21中记 载的方法相同。
[0190] 其结果，使用了本发明的层叠片成形体时（n=6)，适用后1分钟的出血量极微量， 为0.003g。另一方面，如实施例24那样，作为对照而使用TachoSil时（n=4)，适用后1分 钟的出血量为0. 65g，止血效果不充分，出血量多。
[0191] 实施例28 将纤维蛋白原冷冻干燥粉末(将重组纤维蛋白原lOmg/mL、IOmM精氨酸、IIOmM氯化钠、 1%甘氨酸、〇. 2%甘露醇、0. 25%苯丙氨酸、0. 4%组氨酸、0. 1%柠檬酸3钠pH8. 5冷冻干燥而 成)用乳钵粉碎，从而制作了平均粒径为22μm的粉碎纤维蛋白原冷冻干燥粉末。使该进行 了粉碎的纤维蛋白原冷冻干燥粉末分散在2-丙醇中后，以达到4. 2重量％的方式溶解羟丙 基纤维素（2. 0-2. 9mPa·s日本曹达株式会社制)，制备了纤维蛋白原冷冻干燥粉末/羟丙 基纤维素/=90 (以纤维蛋白原计为26. 55)/10 (w/w)的涂料液。使用所得涂料液，利用流 延法来制作膜。涂布间隔为101. 6μm、涂布速度为30.lmm/sec。制作膜后，在3分钟以内 从上部积载由实施例25所记载的方法制作的凝血酶冷冻干燥粉末/聚乙醇酸-聚乳酸共 聚物=20/100、40/100、60/100、80/100、100/100的比率的片状纤维成形体，从而得到含有 由水溶性聚合物和纤维蛋白原形成的层以及由脂肪族聚酯和凝血酶形成的层而成的层叠 片成形体。使用大鼠oozing模型药效评价(使用对大鼠肝脏造成创伤的渗出血模型来实施 试验。将被检片成形体在创伤部上压迫一定时间(本实施例中为5分钟)，其后利用目视来 评价其后1分钟是否出血。）来确认这些层叠片成形体的止血效果。试验以n=6来实施，确 认是否出血。
[0192] 其结果，如表1所示，所评价的凝血酶冷冻干燥粉末/聚乙醇酸-聚乳酸共聚物的 比率在20/ΚΚΓ100/100的范围内，均确认到超过TachoSil的止血效果。

【权利要求】
1. 聚合物组合物的片成形体，其含有：选自纤维蛋白原和凝血酶中的至少一种蛋白 质、以及选自脂肪族聚酯和水溶性聚合物中的至少一种聚合物。
2. 权利要求1所述的片成形体，其中，选自脂肪族聚酯和水溶性聚合物中的至少一种 聚合物为选自纤维素衍生物、具有N-乙烯基环状内酰胺单元的聚合物、聚环氧乙烷、聚乙 烯醇、透明质酸、葡聚糖、支链淀粉、淀粉、以及它们的混合物中的聚合物。
3. 权利要求1所述的片成形体，其中，选自脂肪族聚酯和水溶性聚合物中的至少一种 聚合物为选自羟丙基纤维素、甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙甲基纤维素、羧甲基纤维素 钠、以及它们的混合物中的聚合物。
4. 权利要求1所述的片成形体，其中，选自脂肪族聚酯和水溶性聚合物中的至少一种 聚合物为选自聚乙醇酸、聚乳酸、聚己内酯、以及它们的共聚物、以及它们的混合物中的聚 合物。
5. 权利要求Γ4中任一项所述的片成形体，其中，片成形体为膜成形体或纤维成形体。
6. 层叠片成形体，其含有：含有纤维蛋白原和水溶性聚合物而成的第一聚合物组合物 层以及含有凝血酶和脂肪族聚酯而成的第二聚合物组合物层。
7. 权利要求6所述的层叠片成形体，其中，水溶性聚合物为选自纤维素衍生物、具有 N-乙烯基环状内酰胺单元的聚合物、聚环氧乙烷、聚乙烯醇、透明质酸、葡聚糖、支链淀粉、 淀粉、以及它们的混合物中的至少一种。
8. 权利要求6所述的层叠片成形体，其中，水溶性聚合物为选自羟丙基纤维素、甲基纤 维素、羟乙基纤维素、羟丙甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、以及它们的混合物中的至少一种。
9. 权利要求6~8中任一项所述的层叠片成形体，其中，脂肪族聚酯为选自聚乙醇酸、聚 乳酸、聚己内酯、以及它们的共聚物、以及它们的混合物中的至少一种。
10. 权利要求6、中任一项所述的层叠片成形体，其中，第一聚合物组合物层包含选自 凝血因子XIII、白蛋白、异亮氨酸、甘氨酸、精氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、表面活性剂、 氯化钠、糖醇、海藻糖、柠檬酸钠、抑肽酶以及氯化钙中的至少一种添加剂。
11. 权利要求6~10中任一项所述的层叠片成形体，其中，第一聚合物组合物层由膜成 形体或纤维成形体形成。
12. 权利要求6~10中任一项所述的层叠片成形体，其中，第一聚合物组合物层由膜成 形体形成。
13. 权利要求12所述的层叠片成形体，其中，膜成形体中的水溶性聚合物的含量为 0. 1?50重量％。
14. 权利要求12或13所述的层叠片成形体，膜成形体包含0. 05~10mg/cm2的纤维蛋白 原。
15. 权利要求12~14中任一项所述的层叠片成形体，其中，膜成形体是由由水溶性聚合 物溶液和纤维蛋白原粉末形成的悬浮溶液制造的。
16. 权利要求6~15中任一项所述的层叠片成形体，其中，第二聚合物组合物层由纤维 成形体形成。
17. 权利要求16所述的层叠片成形体，其中，在选自脂肪族聚酯和水溶性聚合物中的 至少一种聚合物中，止血性蛋白质或止血性蛋白质与添加剂的混合物以蛋白质颗粒的形式 分散存在。
18. 权利要求17所述的层叠片成形体，其中，止血性蛋白质为凝血酶。
19. 权利要求18所述的层叠片成形体，其中，蛋白质颗粒与脂肪族聚酯的重量比为 10:10?100。
20. 权利要求17~19中任一项所述的层叠片成形体，其中，纤维成形体是由由脂肪族聚 酯溶液和凝血酶粉末形成的悬浮溶液制造的。
21. 止血材料，其包含权利要求1飞中任一项的片成形体或权利要求6~20中任一项的 层叠片成形体。
22. 组织粘合材料或组织封闭材料，其包含权利要求1飞中任一项的片成形体或权利 要求6~20中任一项的层叠片成形体。
23. 创伤部位的处置方法，其包括对创伤部位适用权利要求21所述的止血材料或权利 要求22所述的组织封闭材料的工序。
【文档编号】A61K38/00GK104271164SQ201380025265
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2013年5月13日 优先权日:2012年5月14日
【发明者】景山由佳子, 藤永贤太郎, 山口鲇子, 秋山佑介, 大野晃稔, 本多勧, 佐竹真, 兼子博章, 今村隆幸, 川村亮一, 平岛正树 申请人:帝人株式会社, 帝人制药株式会社, 一般财团法人化学及血清疗法研究所