拟穴青蟹抗菌肽hyastatin基因克隆及编码蛋白重组和用途
【专利摘要】本发明涉及的是拟穴青蟹抗菌肽hyastatin基因克隆及编码蛋白重组和用途。本发明利用构建cDNA文库技术、3'和5'末端快速扩增技术从拟穴青蟹血淋巴文库中克隆到抗菌肽Hyastatin基因全长序列，该基因在拟穴青蟹免疫防御方面发挥着重要作用。本发明利用体外重组表达技术获得了拟穴青蟹抗菌肽Hyastatin基因成熟肽表达蛋白，分子量为29358.0，等电点为5.05，该重组蛋白对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌均有一定的抑制作用。本发明可为拟穴青蟹的病害防治、医药产品开发和饲料添加剂应用奠定基础。
【专利说明】拟穴青蟹抗菌肽hyastatin基因克隆及编码蛋白重组和用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及的是拟穴青蟹抗菌肽hyastatin基因克隆及编码蛋白重组和用途，属于分子生物学【技术领域】。
【背景技术】
[0002]拟穴青蟹{Scylla paramamosain)隶属于节肢动物门iArthropoda )、甲壳纲{Crustacea)、十足目 iJ)ecapoda)、短尾亚目(Brachyura)、梭子蟹科(Portunidae)、青蟹属(Scylla)，具有很高的经济价值和营养价值，是中国重要海水养殖品种之一。由于拟穴青蟹具食性广、适应性强、生长速度快、养殖周期短、耐干露时间长、易运输和养殖效益高等优点，深受养殖户喜爱，是渔民主要经济来源之一。
[0003]随着养殖强度增大以及日益恶化的养殖环境，拟穴青蟹养殖过程不断受到包括细菌、真菌以及病毒等多种病原体的侵害(王荣智等，2008)。在病原感染早期，作为无脊椎动物的拟穴青蟹只能依赖先天性非特异免疫，识别和清除入侵微生物，维持机体健康(Begumet al，2000)。其中，抗菌肽由于具有光谱抗细菌、抗真菌以及独特的作用机理，在蟹类防御病原微生物入侵方面起着重要作用(Sperstad et al,2009)。
[0004]目前，专家于蟹类不同组织分离鉴定了多种抗菌肽。1988-2000年多位学者相继于招潮蟹iFiddler crab )中分离出Tachyplesi η族抗菌肽，包括Tachyplesin I和TachyplesinII,序列分析表明其C端含甲酰胺基精氨酸，N端含焦谷氨酸，由四个半胱氨酸形成两个二硫键，并且对革兰氏阳性和阴性菌以及寄生虫存在一定抑制性(舱^T，etal.1988;Miyata T，et al, 1989;Kawano K, et al, 1990;Kawabata S，et al, 1996;SilvaP I, et al, 2000) -,Schanpp D 等 iSchnapp D, et al, 1996)从岸蟹(Carci'nus Maenas)血细胞裂解物中纯化出一种富含脯氨酸分子量为6.5 KDa的抗菌肽，其序列类似哺乳动物抗菌肽并且对革兰氏阳性和阴性细菌都有毒性；2008年Stensv^ig等(Stensvag K, et al, 2008.)于互爱蟹0--血细胞中分离出包含37个氨基酸的抗菌肽1，其N端富含脯氨酸和精氨酸，体外表达蛋白具有明显抗菌活性；次年^iSperstad S V, et a7, 2009)则从互爱蟹血细胞中纯化出一种分子量为11.7 kDa的抗菌肽-Ajasiaii/?,其氨基酸序列包含3种不同区域:N端富含甘氨酸，C端具六个半胱氨酸残基，中间为脯氨酸/精氨酸富集区域，对革兰氏阳性和阴性菌以及酵母具有显著抑制作用；Peng H等从锯缘青蟹serraia)精液中分离到分子量为11kDa的抗菌肽scygonadin,其重组蛋白对革兰氏阳性菌和阴性菌都有抗性,但对酵母和真菌无抗性(Peng et al, 2010) ;Imjongjirak 等和 Yue 等(Imjongjirak C et al, 2009 ；Yue F et al, 2010)分别从拟穴青蟹(5b_F77a paranianiosain)和中华纸蜜蟹(Portunus
血细胞中分离纯化到抗菌妝crustin (Crus5)9和PtCrustin),两种抗菌肽均在C端具有包含乳清酸性蛋白(whey acidic protein,WAP)结构的典型保守性半胱氨酸残基，对革兰氏阳性菌具有一定抑制作用。[0005]抗菌妝办asiaiin是Sperstad等(2009)从蛛形互爱蟹iHyas araneus)血细胞中纯化鉴定的一种对G+/G-菌、真菌均有抑制活性的新型抗菌肽，其C端结构域与对虫下抗菌肽Penaeidins同源，有6个保守的Cys残基，形成3对分子内二硫键，属于Penaeidins家族抗菌肽。由于抗菌肽是一类具有很强的光谱抗菌活性的天然小肽类物质，极易扩散到感染部位，使用后不存在产生耐药性问题，且进入机体后无有害残留。因此，抗菌肽的研发与应用将是实现海水养殖动物健康养殖、减少抗生素污染的重要保证。海洋动物中蕴藏着世界上丰富的抗菌活性物质，从海洋动物中研究开发具有抗耐药性细菌的抗生素有效替代品将是未来医学、农业、药学等发展的必然方向。因此，充分利用并发掘中国海洋动物的抗菌肽资源，研发出高效抗菌的抗菌肽基因工程产品，作为研发优质饲料的添加剂或者环境友好型生物农药，以期替代部分抗生素，对我国水产养殖业的可持续健康发展具有重要的科学价值和应用前景。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是从拟穴青蟹血淋巴中进行拟穴青蟹抗菌肽hyastatin基因克隆及编码蛋白重组，本发明的另一目的是公开拟穴青蟹抗菌肽hyastatin基因克隆及其编码蛋白重组用途，为研究拟穴青蟹先天性免疫机制提供科技支撑，为进一步了解Hyastatin基因及其在免疫应答中的作用，为拟穴青蟹的免疫与疾病防控提供理论基础，并为开发医药产品和饲料添加剂奠定基础。
[0007]上述发明目的是由下述技术方案实现的:拟穴青蟹抗菌肽hyastatin基因克隆及编码蛋白重组和用途，所述拟穴青蟹抗菌肽Hyastatin基因，具有序列表SEQ ID N0.1中碱基序列，该基因是从拟穴青蟹血淋巴cDNA文库中筛选到的表达序列标签，该序列全长837bp，包括396 bp的开放阅读框(0RF)，编码131个氨基酸，5’非编码区长105 bp，3’非编码区长336 bp,有多聚腺苷酸加尾信号和多聚腺苷酸尾巴； 所述拟穴青蟹抗菌肽Hyastatin基因编码蛋白，具有SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列，该蛋白分子量为70547.7KDa，等电点为5.04，其中编码序列的106-153为信号肽序列，成熟肽分子量为29358.0，等电点为5.05。氨基酸具有Penaeidins家族特有区域:N端为Pro/Arg区，C端含有6个Cys,形成3个分子内二硫键；
所述拟穴青蟹抗菌肽hyastatin基因克隆及编码蛋白重组的表达产物对革兰氏阳性菌中的藤黄微球菌和枯草芽孢杆菌，革兰氏阴性菌中的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和真菌中的啤酒酵母、白色念珠菌具有杀菌活性，提示了所述表达产物在制备抗菌药物、免疫增强剂、饲料添加剂的应用。
[0008]本发明利用表达序列标签(EST)技术、cDNA末端快速扩增(RACE)技术从拟穴青蟹血淋巴中扩增出Hyastatin基因的全长序列。以此为模板设计引物扩增该基因的成熟肽片段，通过双酶切与载体连接构建pET28a-Hyastatin融合表达载体,利用卡那霉素抗性于大肠杆菌BL21 (DE3)中实现体外重组表达。重组产物经His Trap HP亲和柱纯化和透析复性后，对革兰氏阳性菌藤黄微球菌(Miccrococcus te tragenus )和枯草芽孢杆菌{Bacillus革兰氏阴性菌大肠杆菌{Escherichia coli )、金黄色葡萄球菌{Staphyloccocus aareiAs)及真菌中的啤酒酵母、白色念珠菌具有明显抑制作用。具体结果如表1所示，表1为本发明实例提供的Hyastatin抗菌肽的最小抑菌浓度测定表；其中一:无菌生长；+:有菌生长。
[0009]表1
【权利要求】
1.拟穴青蟹抗菌肽hyastatin基因克隆及编码蛋白重组，其特征在于:所述拟穴青蟹抗菌肽Hyastatin基因，具有序列表SEQ ID N0.1中碱基序列，该基因是从拟穴青蟹血淋巴cDNA文库中筛选到的表达序列标签，该序列全长837 bp，包括396 bp的开放阅读框(ORF)，编码131个氨基酸，5’非编码区长105 bp, 3'非编码区长336 bp，有多聚腺苷酸加尾信号和多聚腺苷酸尾巴； 所述拟穴青蟹抗菌肽Hyastatin基因编码蛋白，具有SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列，该蛋白分子量为70547.7KDa，等电点为5.04，其中编码序列的106-153为信号肽序列，成熟肽分子量为29358.0，等电点为5.05，氨基酸具有Penaeidins家族特有区域:N端为Pro/Arg区，C端含有6个Cys,形成3个分子内二硫键。
2.根据权利要求1所述的拟穴青蟹抗菌肽hyastatin基因克隆及编码蛋白重组表达，在制备抗菌药物、免疫增强剂、饲料添加剂的应用。
【文档编号】A61K38/17GK103789317SQ201410007185
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2014年1月8日 优先权日:2014年1月8日
【发明者】蔡小辉, 彭银辉, 王志成, 梁志辉, 黄国强, 文雪 申请人:广西壮族自治区海洋研究所