用于食管癌防治的hpv16，18l1重组dna疫苗的制作方法
【专利摘要】用于食管癌防治的HPV16，18L1重组DNA疫苗,属于生物医药【技术领域】。本发明提供一种优化型的编码HPV16，18型主要衣壳蛋白L1的基因序列，以及含有该序列的pVR-HPV16，18L1DNA疫苗并提供了制备制备上述pVR-HPV16，18L1DNA疫苗的方法。本发明提供的重组HPV16，18L1的重组DNA疫苗还可用于制备治疗和预防HPV引起的疾病如宫颈癌及头颈癌的疫苗。
【专利说明】用于食管癌防治的HPV16，18L1重组DNA疫苗
【技术领域】
[0001]本发明属于生物制药领域。本发明涉及一种含密码子优化型HPV16，18L1基因的肿瘤DNA疫苗的制备方法。
【背景技术】
[0002]子宫颈癌是全球第二大妇科恶性肿瘤，仅次于乳腺癌，全球有50万左右新发宫颈癌病例，约有20万人死于宫颈癌，其中90%以上来自发展中国家。死亡率为各类妇科肿瘤之首。我国每年新发现的病例为13.15万，约占全球总数的28.8%。20世纪70年代，ZurHausen提出HPV是宫颈癌的病毒学成因，之后国内外学者就两者之间的关系进行了大量研究并提出90%以上的宫颈癌是由于HPV感染引起，国际癌症研究协会(IARC)发表的研究显示超过2/3的子宫颈癌病例与HPV16型(51%)或HPV18型(16.2%)感染有关。
[0003]食管癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，全球每年新发病例约40万，我国约占一半左右，其中淮河流域和太行山地区属于食管癌的高发地区。1982年syr jane的研究表明HPV和食管鳞癌之间存在相关性，之后的不少研究也证实了这一观点(Shen ZY, Xu LY, Li EM,et al.The multistage process ofcarcinogenesis in human esophageal epithelialcells induced by human papillomavirus.0ncol Rep, 2004,11:647-54.)其中曲鹏，李劲涛的研究也表明HPV感染可能是食管鳞癌的病毒学诱因，结果显示标本HPV感染率为82.6%，其中HPV16型感染率34.8%,HPV18型感染率34.8%。(安阳地区不同食管鳞癌标本HPV感染率的比较研究，曲鹏，李劲涛)
[0004]人乳头瘤病毒(Human papillomavirus, HPV)是一种在自然界广泛存在的嗜上皮性病毒，属于乳多空病毒 科的乳头瘤病毒属的无包膜闭环双链DNA病毒。其基因组分为E区，L区和URR区，E区中编码的E6和E7是HPV的主要致癌蛋白，主要通过与抑癌蛋白结合使其降解或引起转录因子释放引起细胞无限增殖并向恶性转化。因为E6，E7蛋白在细胞周期中的重要作用，因此治疗性疫苗的研究多集中在E6，E7基因。但是也正是由于E6，E7整合宿主基因组并能诱导癌变，安全性不能得到保证。
[0005]HPV基因组L区的LI作为HPV的主要衣壳蛋白能够单独或与次要衣壳蛋白L2共同在体外自行组装成VLPs。已经上市并广为接种的两种针对HPV预防性疫苗，Merck公司的 HPV6、11、16、18 四价 VLP Gardasil 疫苗和 GSK 公司研制的 HPV16、18 双价 VLP Cervarix疫苗，都是由HPV LI蛋白组装成的VLPs。其作用机理是以VLP三作为靶抗原诱导机体产生特异性中和抗体达到预防相应型别HPV的感染。
[0006]DNA疫苗是指将编码某种蛋白质抗原的重组真核表达载体直接注射到动物体内，使外源基因在活体内表达，产生的抗原激活机体的免疫系统，从而诱导特异性的体液免疫和细胞免疫应答。DNA疫苗容易制备，稳定性好，并且不会产生针对DNA载体的中和抗体，可以重复免疫，有研究证明，编码HPV16，18型别E6，E7蛋白的DNA疫苗在临床实验中对宫颈上皮内瘤变患者具有明显的治疗效果。(GARCIA F，PETRY K U，MUDERSPACH L，etal.ZYClOla for treatment of high-grade cervical intraepithelial neoplasia:arandomized controlled trial[J].0bstetrics&Gynecology.2004, 103(2):317)
[0007]LI基因无致癌性，且LI编码的蛋白能诱导产生较高的体液免疫和细胞免疫效果，因此可以开发用于食管癌和宫颈癌防治的基于HPV16，18的DNA疫苗。
【发明内容】
[0008]本发明提供了一种密码子优化型的编码HPV16，18主要衣壳蛋白LI的基因序列以及一种含有上述优化型基因的重组DNA疫苗。
[0009]一种密码子优化型的编码人乳头瘤病毒16，18型(HPV16，18)主要衣壳蛋白LI的基因，该基因具有SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列。
[0010]一种含有上述优化型基因的重组DNA疫苗携带有上述的基因。[0011]一种含有上述优化型基因的重组DNA疫苗通过以下步骤实现:
[0012](I)通过用哺乳动物高频使用的密码子取代HPV16，18L1基因序列的密码子，得到密码子优化型HPV16，18L1基因；
[0013](2)将步骤(1)得到的密码子优化型HPV16，18L1基因克隆入VR-1020质粒，得到携带密码子优化型HPV16，18L1基因序列的重组DNA疫苗；
[0014](3)检测重组DNA疫苗的体外表达并使用Qiagene endofree大提试剂盒提取重组DNA质粒，采用初免-加强策略肌注Balb/c小鼠，检测免疫效果。
[0015]本发明提供了一种密码子优化型的编码人乳头瘤病毒16，18型(HPV16，18)主要衣壳蛋白LI的基因(mod.HPV16，18L1 )，该基因是在不改变HPV16，18主要衣壳蛋白LI氨基酸序列的条件下，用哺乳动物高频使用的密码子取代HPV16，18L1基因序列的密码子得到的。
[0016]本发明提供了一种密码子优化型HPV16，18L1基因重组DNA疫苗。所述优化的编码乳头瘤病毒16，18型(HPV16，18)主要衣壳蛋白LI的基因(mod.HPV16，18L1)的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，并将其构建至DNA载体上得到重组DAN疫苗。将优化后的HPV16,18L1基因重组DNA疫苗转染细胞进行蛋白表达，结果发现:优化后的HPV16，18L1基因(mod.HPV16，18Ll)能够高效地表达蛋白。
[0017]在一个优选的实施方案中，其中所述的DNA载体VR-1012质粒。
[0018]在一个优选的实施方案中，其中所述的体外表达细胞是HEK293细胞。
[0019]另一方面，本发明还提供了所述优化型的编码乳头瘤病毒16，18型(即￥16，18)主要衣壳蛋白LI的基因在制备用于防治HPV引起的疾病的药物或疫苗组合物中的用途，其中所述HPV优选为HPV16，18型。
[0020]另一方面，本发明还提供了本发明所述的重组HPV16，18L1DNA疫苗在制备用于预防和/或治疗HPV引起的疾病如宫颈癌、食管癌及头颈癌的药物或疫苗组合物中的用途。
【具体实施方式】
[0021]材料和方法
[0022]大肠杆菌DH5a购自天根生化科技(北京)有限公司，DNA A-Tailing Kit、pMD16，18-T载体购自宝生物工程(大连)有限公司。HEK293细胞由中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所贾润清老师提供。含pVR-HPV16，18L1质粒的甘油菌以及含密码子优化型HPV16，18L1基因的质粒pMK-RQ由周玉柏老师提供。限制性内切酶Bgl II和Sal I购自NewEnglandBiology公司，T4DNA连接酶、DNA Marker购自宝生物工程(大连)有限公司。普通DNA纯化试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒、pfu DNA聚合酶、dNTP均购自天根生化科技(北京)有限公司。质粒提取试剂盒(Midi)、去内毒素质粒提取试剂盒(Max1、Mega)购自QIAGEN公司。预染蛋白Marker购自Fermentas公司。脂质体转染试剂Lipofectamine2000购自Invitrogen 公司。DMEM 培养基、OptiMEM I 培养基、胎牛血清(Fetal bovine serum, FBS)>青链霉素双抗购自Gibco公司。小鼠抗HPV16,18L1单抗购自Abcam公司，小鼠抗β -actin单抗购自北京中杉金桥生物技术公司。羊抗小鼠IgG抗体(Ant1-MOUSE IgG(H&L) (GOAT)Antibody IRDye700DX)购自Rockland公司。其它分析纯试剂由本实验室提供。脂质体转染试剂Lipofectamine2000购自Invitrogen公司。QuickShuttle转染试剂购自北京康碧泉生物科技有限公司。DMEM培养基、RPM1-1640培养基、Quick Spot小鼠IFN- y ELI SPOT预包被试剂盒、EZ-SepTMM0uSelX易得小鼠淋巴细胞分离液购自深圳达科为生物技术有限公司。其它分析纯试剂由本实验室提供。实验中设计的多肽由北京中科亚光生物科技有限公司合成。实验所需引物由上海英骏生物技术有限公司合成。
[0023]本发明所涉及的分子生物学和免疫学等相关技术如核酸操作技术，蛋白质定性和定量分析等在科学文献中都已有充分描述(如参见J.萨姆布鲁克E.F.弗里奇T.曼尼要蒂斯，分子克隆实验指南(第二版))。
[0024]实施例1重组VR-HPV16，18L1DNA质粒的构建
[0025]1.1PCR 扩增 HPV16，18Ll_pVR 基因片段
[0026]1.1.1以含密码子优化的HPV18L1基因的ρΜΚ-RQ为模板，以合成序列为引物进行PCR扩增HPV16，18Ll-pVR基因片段。PCR完成后取I μ L反应溶液进行DNA凝胶(1%)电泳检测。检测得到较好结果后回收PCR产物。
[0027]1.1.2HPV16L1基因序列的构建:以含HPV16L1基因的PUC-HPV16L1质粒为模板，以合成序列为引物进行PCR扩增，PCR反应体系是:模板质粒I μ 1，上下游引物各I μ 1，IOXPfu BufferlOy 1，dNTP8 μ 1，Pfu2 μ 1，ddH2077 μ 1，总体系 100 μ I。经过 30 个循环(94°C变性30s，58°C退火30s，72°C延伸30s)获得HPV16L1基因序列，PCR反应产物通过切胶回收进行纯化。
[0028]1.2HPV18Ll-pVR基因片段与T载体的连接将PCR扩增得到的HPV16，18Ll_pVR基因片段连接到PMD16，18-T载体上以保存并确保较高的酶切效率。由于pfu酶不能在扩增产物的3’末端加上A，需要首先使用DNA A-Tailing Kit把PCR产物3’末端加A。按说明书取适量的PCR产物，加入 IOXA-Tailing Buffer5 μ L, dNTP4 μ L, A-TaiIing Enzyme0.5 μ L,补水至50 μ L，置于PCR仪72°C反应20分钟，然后冰上静置I~2分钟。然后取适量的上述3’末端加A的PCR产物，加入pMD16，18-TVectorl μ L，补水至5 μ L，然后加入5 μ L SolutionI，16°C反应2小时。
[0029]1.3T载体连接产物的转化将1.2中全部的连接产物(10 μ L)加入至50 μ L DH5 α感受态细胞中，冰中放置30分钟。42°C加热90秒后，再在冰中放置2~3分钟。然后加入400 μ L LB培养基，37°C振荡培养45分钟。取100 μ L已转化的感受态细胞，用弯头玻棒轻轻涂到含有X-Gal、IPTG、Amp的LB琼脂平板培养基上。平板上液体被吸收后置于37°C恒温箱培养12~16h。[0030]1.4小提并双酶切重组T载体和pVR质粒挑取平板上的白色菌落,接种到4mLAmp抗性的LB培养基中，37°C剧烈振荡培养过夜。按小提试剂盒说明书步骤小提质粒，然后使用限制性内切酶Bgl II和Sal I对重组T载体和pVR质粒进行双酶切(HPV18型别)。对于HPV16型别使用Bgl I和Sal I对表达载体VR-1012进行双酶切。酶切体系:VR_1012载体质粒 20 μ 1，BSA0.5 μ 1,10Xbuffer45y 1，内切酶 Bgl 12 μ 1，Sal 12 μ 1，ddH2020.5 μ 1，总的酶切体系50μ 1，37°C消化3-4h。用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的条带。取IuL回收的DNA进行1%琼脂糖凝胶电泳检测回收效果。
[0031]1.5HPV16，18L1片段和pVR质粒的连接转化对于HPV18型别，连接体系为:适量的 2.2.L 4 中酶切回收的 HPV18L1 片段和 pVR 质粒，10XT4Ligase buffer2 μ L, T4 连接酶1.5 μ L，补水至20 μ L。16°C连接过夜。对于HPV16型别连接体系为HPV16L17 μ 1，VR-10121y 1，10Χ连接bufferly 1，Τ4连接酶1μ I。16°C连接过夜。将全部的连接产物(2(^0加入至5(^1^0册0感受态细胞中，冰中放置30分钟。42°C加热90秒后，再在冰中放置2~3分钟。然后加入400 μ L LB培养基，37°C振荡培养45分钟。取100 μ L已转化的感受态细胞，用弯头玻棒轻轻涂到含有Kana的LB琼脂平板培养基上。平板上液体被吸收后置于37°C恒温箱培养12~16h。
[0032]1.6小提并鉴定重组质粒挑取平板上的单菌落接种到4mL Kana抗性的LB培养基中，37°C剧烈振荡培养过夜。按小提试剂盒说明书步骤小提质粒，然后使用限制性内切酶Bgl I和SalI对HPV16型别DNA-HPV16L1和使用限制性内切酶Bgl II和Sal I对提取的重组型DNA-HPV18LI质粒，双酶切鉴定。初步鉴定正确后送北京华大基因测序。测序结果正确的重组PVR质粒命名为pVR-HPV16Ll和pVR_HPV18Ll。
[0033]实施例2pVR_HPV16，18L1体外表达的检测
[0034]2.1HEK293细胞的培养培养HEK293细胞所用的培养基为含10%FBS和1%双抗的DMEM培养基，培养条件为37°C、5%C02恒温培养箱。
`[0035]2.2中提的质粒转染细胞
[0036](I)转染前一天，胰酶消化293细胞并计数，将细胞转至六孔板，控制密度使其在转染日密度接近90%。细胞铺板在2mL含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中。
[0037](2)对于每孔细胞，使用250 μ L OPT1-MEM I培养基稀释4 μ g质粒(pVR_HPV16，18L1)。Lipofectamine2000 试剂用前混匀，用 250 μ LOPT1-MEM I 培养基稀释 10 μ LLipofectamine2000。轻柔混匀，室温静置5分钟，然后同稀释的质粒混合，再室温静置20mino
[0038](3)直接将复合物(500 μ L)逐滴加入到每孔中，前后(或左右)摇动培养板，轻轻混匀。放入37°C、5%C02恒温培养箱。4~6小时后换液为正常生长的培养基。
[0039]2.3ffestern Blot 检测 HPV16，18L1 蛋白
[0040](I)转染48h后，弃去培养基，用PBS洗一遍细胞，每孔细胞加入80 μ L的细胞裂解液(50mM Tris-HCl (pH8.0), 150mM NaCl, l%Triton X-100,100 μ g/mL PMSF(临用前加入))，用移液器吹打或用细胞刮刮下细胞，裂解后的细胞收集到1.5mL Eppendorf管中，12000r/min 离心 lOmin。
[0041](2)取上清加1/4体积的5X电泳上样缓冲液，沸水中煮5~lOmin，取20yL进行SDS-PAGE电泳(积层胶为5%，分离胶为10%)，110V恒压电泳；电泳结束后，采用半干转法将蛋白转至硝酸纤维素(NC)膜上；将NC膜置于含有5%脱脂奶粉的PBS中37°C慢慢摇动封闭Ih ;弃封闭液，加入1:1000的小鼠抗HPV16，18L1单克隆抗体(8.F.324) 4°C冰箱过夜；以含有0.05%Tween-20的PBS洗膜3次，每次IOmin ;加入1:5000稀释的羊抗小鼠IgG抗体(Ant1-MOUSE IgG(H&L) (GOAT)Antibody IRDye700DX)室温摇动孵育 45min ;用含有
0.05%Tween-20的PBS洗膜3次，每次IOmin ;将膜置于PBST中，然后用Odyssey远红外影像分析仪检测HPV16，18L1蛋白，(结果参见图1，2)。
[0042]实施例3重组DNA疫苗pVR_HPV16，18L1免疫小鼠实验
[0043]3.1免疫小鼠的准备及免疫计划
[0044]从商业途径获得的20只4~6周龄的SPF级的健康雌BALB/CH_2Kd小鼠随机分为3组，每组10只，在第O和3周大腿肌肉注射免疫两次，末次加强免疫后一周检测免疫反应。具体免疫内容和剂量见表1。
[0045]表1小鼠免疫分组和剂量
【权利要求】
1.一种密码子优化型的编码人乳头瘤病毒16，18型主要衣壳蛋白LI的基因，该基因具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
2.一种重组DNA质粒，该重组质粒携带有权利要求1所述的基因。
3.制备权利要求2所述重组HPV16，18L1DNA疫苗的方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)通过用哺乳动物高频使用的密码子取代HPV16，18L1基因序列的密码子，得到密码子优化型HPV16，18L1基因； (2)将步骤(1)得到的密码子优化型HPV16，18L1基因克隆入载体DNA质粒，得到携带密码子优化型HPV16，18L1基因序列的重组DNA质粒。
4.根据权利要求3的方法，其中所述的载体DNA质粒是质粒VR-1012。
5.根据权利要求1所述基因在制备用于防治HPV引起的疾病的药物或疫苗组合物中的用途。
6.根据权利要求5 所述用途，HPV 型选自 HPV6、11、16、18、30、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59 或 68 型。
7.根据权利要求2所述的重组DNA疫苗在制备用于预防和/或治疗HPV引起的疾病如食管癌的药物或疫苗组合物中的用途。
8.根据权利要求2所述 的重组DNA疫苗在制备用于预防和/或治疗HPV引起的其他疾病如宫颈癌、头颈癌的药物或疫苗组合物中的用途。
【文档编号】A61P31/20GK103820472SQ201410035942
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2014年1月25日 优先权日:2014年1月25日
【发明者】周玉柏, 曾毅, 方军, 刘海庭, 沈思嗣, 李劲涛, 李泽琳 申请人:北京工业大学