一种用于移植修复周围神经缺损的组织工程生物材料的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于移植修复周围神经缺损的组织工程生物材料，它是先行按化学萃取方法制备去细胞异体神经支架，再利用目标受体在早期清创手术收集的脂肪组织培养自体脂肪干细胞，再使用外源性许旺细胞源性神经营养因子体外诱导构建组织工程周围神经备用。本发明经化学萃取去细胞的异体神经支架无免疫原性，具有最接近生物体神经的网架结构，并有良好的生物相容性，同时利用许旺细胞源性神经营养因子在体外可控诱导干细胞，结合理想支架分化为类许旺细胞后，再移植到体内发挥作用。
【专利说明】一种用于移植修复周围神经缺损的组织工程生物材料
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，具体是以组织工程学方法制备的生物材料。这种组织工程生物材料用于植入人体，修复人体周围神经缺损。
【背景技术】
[0002]周围神经是相对于中枢神经而言，指脑和脊髓以外的所有神经。临床医疗中遇到的周围神经损伤或缺失一般发生在躯体部位，导致患者感觉和运动功能障碍。周围神经损伤的患者常需要多次手术进行治疗。一期手术进行清创、骨骼复位固定等处理，延期进行神经修复。目前临床上常用且有效的周围神经修复方法是自体神经移植，其做法是在权衡利弊后“拆了东墙补西墙”，因此受到严重限制。应用组织工程学方法制备人体移植材料技术的出现为修复周围神经带来了新的希望。应用组织工程学方法构建可以移植于人体的周围神经生物材料，需具备三个基本条件:种子细胞、支架材料和细胞因子。目前在这三方面都存在一些尚未突破的技术难点:
1.关于种子细胞。构建组织工程周围神经可用的种子细胞有许旺细胞(Schwanncells, SCs)和干细胞。自体许旺细胞应用效果好，但需摘取自体正常的周围神经，造成患者被切取神经处新的人为损伤，得失相当，不宜多用。可用的干细胞包括骨髓间充质干细胞(bone marrow stem cells, BMSCs)和神经干细胞(neural stem cells, NSCs)。其中，制备骨髓间充质干细胞需要抽取骨髓，病人痛苦大，所能抽取的骨髓数量常常嫌少，体外扩增时间长。神经干细胞存在的主要问题是，诱导后的类许旺细胞在体内是不是长期表达许旺细胞特异性标志及其稳定性。还有，异源性神经干细胞有免疫原性及伦理学问题，自体来源的神经干细胞增加较大的手术创伤。
[0003]2.关于神经支架。神经支架作为引导周围神经再生的载体，其内部超微结构及免疫原性是周围神经损伤修复`的关键。理想的天然支架材料为自体神经，但供体缺乏和致残副作用是“老大难”问题。新鲜异体神经因为免疫排斥无法应用，多种物理、化学方法处理异源性神经，都不能彻底消除其免疫原性。相对效果良好的是Mariann Sondell等利用TritonX-100清洁剂和脱氧胆酸钠的方法[Sondell M, Lundborg G, Kanje M.Regeneration ofthe rat sciatic nerve into allografts acellular through chemical extraction.Brain Res.1998，795 (1_2): 44-54.]采用这种方法处理的异体神经移植修复坐骨神经缺损，免疫原性极低。但由于许旺细胞是移植后轴突向远端迁移的关键，此方法同时去除了许旺细胞，无法增殖牵引形成Bungner’ s带，因此有再生神经传导冲动功能不足的缺点。
[0004]3.关于细胞因子。诱导干细胞分化的细胞因子为各种神经营养因子，它们是神经系统最重要的生物活性因子。但是神经营养因子的半衰期短，很难在体内长期发挥作用，无法与神经再生需要的长时间匹配。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的技术问题是，针对当前医疗实践中在修复周围神经缺损方面的需要和现有技术的缺点、不足，设计一种生物【技术领域】的组织工程方法，按该方法制备的生物组织工程材料可以植入人体，修复周围神经缺损。本发明所称“组织工程生物材料”因其本身是按组织工程方法制备的用于移植的神经，故亦称“组织工程神经”。
[0006]本发明用于移植修复周围神经缺损的组织工程生物材料是按以下工艺步骤制作的:
步骤一一一化学萃取制备去细胞异体神经支架
去细胞异体神经来源于遗体捐献者，均经过患者生前的授权及患者直系家属的同意，并通过医院伦理委员会的许可，符合医学伦理学的要求。选择遗体捐献者生前无乙型病毒性肝炎、丙型病毒性肝炎、艾滋病、梅毒等传染性疾病。在病人死亡后一小时内切取尸体周围神经。将截取的周围神经置入PBS液4 °C保存8-12小时，然后取出，无菌修整周围神经，包括仔细剪除周围神经上附带的脂肪、筋膜及血管等结构，保留完整的神经外膜，在26-28°C环境温度下按以下工序对周围神经材料进行化学萃取去抗原处理:
⑴无菌蒸馏水中浸泡10-14小时，使细胞和髓鞘在低渗液体中膨胀；
⑵在5%Triton X-100溶液中振荡10-14小时，使细胞和髓鞘完全破裂，降解和脱出部分细胞崩解碎片；
⑶再次在无菌蒸馏水中浸泡3小时，进一步脱出细胞碎片；
⑷在5%脱氧胆酸钠溶液中振荡10-14小时 ，进一步破坏细胞和髓鞘，并且消化、降解和脱出细胞碎片。
[0007]经以上处理后周围神经材料置入PBS液缓冲液(PH=7.2) 4°C暂时保存。
[0008]本步骤中，尸体神经的取材优选股神经和坐骨神经。特别适用的神经干材料宜在直径长度 80-100_。
[0009]作为优化，本步骤制备去细胞异体神经支架的“无菌蒸馏水中浸泡一5%TritonX-100溶液振荡一无菌蒸馏水中浸泡一5%脱氧胆酸钠溶液振荡”四步程序重复进行，每重复一次，会进一步清除周围神经材料中的抗原物质，降低其免疫原性。优选的重复轮次为2次，包括最初的一次，共3次重复进行该四步程序操作。
[0010]步骤二-培养自体脂肪干细胞(adipose derived stem cells, ADSCs)作种子
细胞
发生周围神经损伤的患者是应用本发明组织工程学生物材料，进行周围神经移植修复的目标人体。所以发生周围神经损伤，通常是创伤造成。当代医学对创伤的处理，必然进行早期清创处理，在进行早期清创手术时必然有脂肪组织被清除。本发明技术方案是常规收集保留患者在清创手术中被清除的残碎组织作制备脂肪干细胞的材料。具体做法是，选取其中无病变的浅层脂肪组织，清除血管、包膜等结缔组织，PBS液反复冲洗，剪碎成Imm3大小组织块。PBS液冲洗后，0.1%胶原酶37°C培养箱中消化I小时，过滤后离心，重悬于DMEM/F12 (1:1)进行培养，过滤。细胞计数后I X 105/ml接种于25cm2培养瓶内培养。待细胞融合后，用0.25%胰蛋白酶消化贴壁细胞进行传代。利用直接免疫荧光标记法及流式细胞术检测脂肪干细胞相对特异分子E-cadherin、⑶105、⑶44、⑶29，对分选确定为脂肪干细胞继续培养，传代。
[0011]步骤三一细胞因子诱导的组织工程生物材料体外构建
于普通6孔板中，将步骤二培养扩增的自体脂肪干细胞放置于步骤一制备的去细胞异体神经支架上，细胞浓度为2X 105/ml，放置于5%C02、37°C培养箱中，进行培养，融合。12小时后翻转去细胞异体神经支架，更换脂肪干细胞悬液，再次置于5%C02、37°C培养箱进行培养，融合。然后在含有外源性许旺细胞源性神经营养因子(Schwann cell derivedneurotrophic factor, SDNF)的复合诱导液中诱导培养,复合诱导液含有H-DMEM培养基、10%FBS、100ng/ml SDNF、10-5Μ 全反式视黄酸、200ng/ml Heregulin-β。诱导过程为 26-30天，每48-72小时更换一次上述复合诱导液。所述许旺细胞源性神经营养因子采用市售品，规格为5ml/500ml或10ug。上述步骤使得其在体外形成组织工程化材料，用于修复周围神经缺损。组织工程神经体外构建完成后，如果预计在2-3天内植入目的病人则将制备完成的组织工程神经放置于5%C02、37°C培养箱备用。如拟接受移植的对象实施植入手术的时间不确定或手术日期在4天以上，则将制备完成的组织工程神经放置于冻存液中，依次经过40C 30分钟，-200C 2小时，-80°C可保存至I个月。此期间可随时取出解冻应用。
[0012]本发明经化学萃取去细胞的异体神经支架无免疫原性，具有最接近生物体神经的网架结构，并有良好的生物相容性。自体脂肪干细胞作种子细胞无免疫原性、不涉及异体移植或非治疗目的引起额外损伤的伦理学问题的优势。本发明的关键技术创新在于利用许旺细胞源性神经营养因子在体外可控诱导干细胞，结合理想支架复合体分化为类许旺细胞后，再移植到体内发挥作用。本发明将支架、种子细胞、细胞因子三方面很好的结合起来发挥组织工程化周围神经的再生作用，以解决诱导分化时间长、表型不确定、程序复杂、花费大等问题，在保持组织工程神经形态连续性以促进功能恢复的同时，来满足临床治疗需要。
【具体实施方式】
[0013]以下以犬为实验对象具体说明本发明。
[0014]具体技术方法包括 以下工艺步骤:
一.制备去细胞异体神经
以死亡I小时内犬的坐骨神经为材料，取材后将神经置入PBS液4°C保存10小时,然后取出，无菌修整周围神经，然后在26-28°C的环境下将神经作去抗原处理:
1.无菌蒸馏水中，浸泡12小时；
2.在5%TritonX-100溶液中振荡12小时，降解和脱出部分细胞崩解碎片；
3.再次在无菌蒸馏水中浸泡3小时，进一步脱出细胞碎片；
4.在5%脱氧胆酸钠溶液中振荡12小时；
5.将经工序4处理的周围神经材料再次置于无菌蒸馏水中浸泡，两次重复工序1-4的过程。“无菌蒸馏水浸泡一5%Triton X-100溶液振荡一无菌蒸馏水中浸泡一5%脱氧胆酸钠溶液振荡”四个工序循环进行共3次。将经以上加工处理的周围神经材料置入PBS缓冲液(PH=7.2)4°C暂时保存。
[0015]本实验经实验动物伦理委员会许可，在别项科学研究所用的实验犬处死后I小时内，一次性取材周围神经2条，部位为坐骨神经，切取的每条神经规格直径在7mm，长度为IOOmm0
[0016]二.分离、培养自体脂肪干细胞
I)在对肢体受创伤、二期需修复神经缺损的目标犬初次行清创手术时，切取伤口附近相当于清创手术切除的浅层脂肪组织，清除血管、包膜等结缔组织，PBS反复冲洗，剪碎成Imm3大小组织块。PBS冲洗后，0.1%胶原酶37°C培养箱中消化I小时，过滤后离心，重悬于DMEM/F12 (1:1)进行培养脂肪干细胞，过滤。
[0017]2)细胞计数后IX 105/ml接种于25cm2培养瓶内培养。待细胞融合后，用0.25%胰蛋白酶消化贴壁细胞进行传代。利用直接免疫荧光标记法及流式细胞术检测脂肪干细胞相对特异性分子E-cadherin、⑶105、⑶44、⑶29等，对分选确定为脂肪干细胞继续培养，传代。取生长状态良好的第3代细胞于37°C培养箱暂存待用。
[0018]三.体外构建外源性许旺细胞源性神经营养因子诱导的组织工程周围神经
I)将处理过的犬的去细胞异体神经放入普通6孔板中，加入先前培养的第3代目标犬脂肪干细胞细胞悬液(细胞浓度为I X105/ml )，进行培养，融合。12小时后翻转去细胞神经，更换脂肪干细胞细胞悬液，重新进行浸泡12小时，然后更换孔。
[0019]2)将脂肪干细胞的细胞悬液与去细胞异体神经结合，再于普通六孔板中加入从生物制剂公司购买的含有许旺细胞源性神经营养因子的复合诱导液进行诱导，每24-48小时更换培养液。复合诱导液含有H-DMEM培养基、10%FBS、100ng/ml SDNF、I(T5M全反式视黄酸、200 ng/ml Heregulin-β。诱导过程为26-30天，每48h_72h更换一次上述复合诱导液。组织工程神经体外构建完成后，如预计在2-3天内完成目的犬的体内移植修复，则放置于5%C02、37°C培养箱。如拟接受移植的对象修复时间不确定或修复时间在4天以上，则将组织工程周围神经放置于冻存液中，依次经过4°C 30分钟，_20°C 2小时，_80°C可保存至I个月。此期间可随时取出解冻应用。所述冻存液成分为，10% 二甲基亚枫、10%胎牛血清、80%DMEM/F12。
[0020]治疗效果验证报告:将本发明所构建的组织工程神经移植到目的对象的体内，修复周围神经缺损。在移植后的24-36周，对大体功能的恢复进行评估:主要检测指标包括神经电生理检测移植神经段复合动作电位的神经传导速度、动作电位最大振幅、产生动作电位的最小阈强度等；步态分析得出修复后的坐`骨神经功能指数，评价功能恢复情况；综合以上检测验证手段，评价得出构建的组织工程神经在体内修复犬坐骨神经缺损的能力优秀，基本等同于自体神经移植的标准。
【权利要求】
1.一种用于移植修复周围神经缺损的组织工程生物材料，它是按以下方法制备的: 步骤一一化学萃取制备去细胞异体神经支架:在死亡不超过一小时的尸体切取周围神经，置入PBS液4°C保存8-12小时，然后取出，剪除周围神经干上附带的脂肪、筋膜及血管等结构，保留完整的神经外膜，在26-28°C环境温度下按以下步骤进行化学萃取去抗原处理: ⑴无菌蒸馏水中浸泡10-14小时； ⑵在5%Triton X-100溶液中振荡10-14小时； ⑶再次在无菌蒸馏水中浸泡3小时； ⑷在5%脱氧胆酸钠溶液中振荡10-14小时； 步骤二——培养自体脂肪干细胞作种子细胞:收集患者在清创手术中被清除的残碎组织，选取其中无严重病变的浅层脂肪组织，清除血管、包膜等结缔组织，PBS液反复冲洗，剪碎成Imm3大小组织块，PBS液冲洗后，0.1%胶原酶37°C培养箱中消化I小时，过滤后离心，重悬于DMEM/F12 (1:1)进行培养，过滤；细胞计数后I X 105/ml接种于25cm2培养瓶内培养；待细胞融合后，用0.25%胰蛋白酶消化贴壁细胞进行传代，利用直接免疫荧光标记法及流式细胞术检测脂肪干细胞相对特异分子E-cadherin、⑶105、⑶44、⑶29，对分选确定为脂肪干细胞继续培养，传代； 步骤三——细胞因子诱导的组织工程生物材料体外构建:于普通6孔板中，将步骤二培养扩增的自体脂肪干细胞放置于步骤一制备的去细胞异体神经支架上，细胞浓度为2X105/ml，放置于5%C02、37°C培养箱中进行培养，融合；12小时后翻转去细胞异体神经支架，更换脂肪干细胞悬液，再次置于5%`C02、37°C培养箱进行培养，融合；然后在含有外源性许旺细胞源性神经营养因子的复合诱导液中诱导培养，每48-72小时更换一次复合诱导液，经26-30天完成诱导过程，即为可用于移植修复周围神经缺损的组织工程生物材料。
2.根据权利要求1所述的用于移植修复周围神经缺损的组织工程生物材料，其特征在于，尸体周围神经的取材优选股神经和坐骨神经。
3.根据权利要求2所述的用于移植修复周围神经缺损的组织工程生物材料，其特征在于，周围神经取材规格为直径长度80_100mm。
4.根据权利要求1所述的用于移植修复周围神经缺损的组织工程生物材料，其特征在于，步骤一制备去细胞异体神经支架的“无菌蒸馏水中浸泡一5%Triton X-100溶液振荡一无菌蒸馏水中浸泡一5%脱氧胆酸钠溶液振荡”四步程序重复进行共3次。
5.根据权利要求1所述的用于移植修复周围神经缺损的组织工程生物材料，其特征在于，步骤三所用复合诱导液含有H-DMEM培养基、10%FBS、100ng/ml SDNF, 10-5Μ全反式视黄酸、200ng/ml Heregulin- β ?
6.根据权利要求1所述的用于移植修复周围神经缺损的组织工程生物材料，其特征在于，步骤三用作细胞因子的许旺细胞源性神经营养因子规格为5ml/500ml或10ug。
7.根据权利要求1所述的用于移植修复周围神经缺损的组织工程生物材料，其特征在于，经步骤三培养完成的组织工程生物材料放置冻存液中依次经过4°C 30分钟，-20°C 2小时，-80°C，保存备用。
8.根据权利要求7所述的用于移植修复周围神经缺损的组织工程生物材料，其特征在于，所述冻存液成分为:10% 二甲基亚枫、10%胎牛血清、80%DMEM/F12。
【文档编号】A61L27/38GK103751845SQ201410043457
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2014年1月30日 优先权日:2014年1月30日
【发明者】李威, 阮狄克, 白雪东 申请人:中国人民解放军海军总医院