一种短肽抑制剂及其用途
【专利摘要】本发明涉及一种短肽抑制剂及其用途。所述短肽抑制剂的序列中包含SEQ?ID?NO:1所示的氨基酸序列。本发明的短肽抑制剂与β-淀粉样多肽的结合能力较强、自身细胞毒性较低且其溶解性好，能够降低β-淀粉样多肽对神经细胞的毒害作用。因此本发明的短肽抑制剂能够用于抑制β-淀粉样多肽聚集和/或对细胞毒害作用，以及用于治疗和/或预防与β-淀粉样多肽有关的疾病。
【专利说明】一种短肽抑制剂及其用途
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医学【技术领域】，涉及一种短肽抑制剂，尤其涉及一种抑制(6-淀粉样多肽聚集的短肽抑制剂及其用途。
【背景技术】
[0002]淀粉样多肽的错误折叠和异常聚集与许多退行性疾病的发病有着密切的关系，如阿尔茨海默症、帕金森氏症、亨廷顿氏症、前额颞退行病变、脊索侧索硬化症、II型糖尿病、牛海绵状脑病、克罗伊茨费尔特-雅各布氏病等多种疾病。其中，阿尔茨海默症(Alzheimer’s disease, AD)发病率最高。据中国阿尔茨海默病协会2011年的公布调查结果显示，全球有约3650万人患有痴呆症，平均生存期只有5.9年，是威胁老人健康的“四大杀手”之一。在中国65岁以上的老人患病率为6.6%，而在85岁以上的老人中的发病率高达30%以上。作为全球人口第一大国和老龄化社会的现状，退行性疾病造成严重的社会和家庭负担，成为我国必须面对的重大社会问题。AD是以进行性记忆力减退和认知功能障碍为主要特征的老年期常见神经系统变性疾病。在众多的AD致病学说中，淀粉样蛋白级联假说一直占有AD发病机制的主要地位。该假说认为:脑内淀粉样蛋白前体(amyloid proteinprecursor, APP)的异常代谢使得P -淀粉样多肽(beta-amyloid, )产量增多、降解减少，引起AP的大量聚积。过量的AP聚积会形成寡聚体、原纤维和纤维等聚集体，进而形成淀粉样斑块，产生神经细胞毒性(可参考Roberson, E.D.等人Science2006，314，781; Spillantini, M.G.等人 Science2006, 314，777;Klein, W.L.等人，Neurochemistry International2002, 41, 345; Lambert, M.P.; Klein, ff.L.等人，Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the United States of Americal998,95,6448.;Selkoe, D.J., Nature2003, 426, 900.)。
[0003]以^为靶点的AD治疗药物成为临床研究的主要方向之一。目前，针对A3的治疗方法主要有抑制AP生成和抑制AP聚集等方法。而治疗方式主要有通过加入(I)小分子抑制剂(如刚果红类、硫磺素T类、多酚类等)；和(2)引入多肽类调节剂(如KLVFF)来抑制淀粉样多肽的聚集和其神经毒性。对于小分子类抑制剂，较高浓度的刚果红能够抑制纤维的形成，硫磺素T则与纤维有很强的结合力，二者均可用于体内AP的标记和抑制其聚集；而多酚类分子表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)也被证明对A 3有显著地聚集抑制和解聚作用。对于短肽抑制剂，KLVFF五肽片段常被用于识别AP相应区域并与A^发生特异性相互作用(可参考Tjernberg, L.0.等人，Journal of Biological Chemistryl996, 271，8545;Chafekar，S.M.等人，ChemBiochem2007, 8，1857 ；Findeis, M.A.等人,Biochemistry 1999, 38, 6791 ；Gibson, T.J.等人,Biochemistry2005, 44, 8898)。
[0004]尽管刚果红类、硫磺素T类、多酚类和KLVFF衍生物类短肽抑制剂的研究受到了很大重视，但其应用也受到限制。比如刚果红类、硫磺素T类和五肽KLVFF的溶解性较差，细胞毒性较高且结合能力也不高，这些都直接地导致了这些抑制剂在实际使用中受到了很大的限制。因此，目前需要发展一种溶解性好，自身细胞毒性较低并且与AP的结合能力较强的抑制剂。
【发明内容】
[0005]针对现有技术的缺陷，本发明人经过大量试验和艰辛的劳动发现了一种短肽抑制剂，其对β-淀粉样多肽聚集及其引起的细胞毒害作用具有显著的抑制作用，可用作治疗和/或预防与β-淀粉样多肽有关的疾病的药物活性成分。因此，本发明的目的在于提供一种短肽抑制剂及其用途。
[0006]为实现本发明的目的，本发明采用以下技术方案:
[0007]在第一方面，本发明提供一种短肽抑制剂，其序列中包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
[0008]优选地，所述短肽抑制剂的序列为SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQID NO: 14,SEQ ID NO: 15或SEQ ID NO: 16所示的氨基酸序列，优选为SEQ ID NO:1所示的
氨基酸序列。
[0009]本发明的短肽抑制剂能够用于抑制β -淀粉样多肽聚集和/或对细胞毒害作用。其中，所述对细胞毒害作用一般是由β_淀粉样多肽的错误折叠和/或聚集造成的。优选地，所述淀粉样多肽为 SEQ ID NO: 2,SEQ ID NO: 3,SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5,SEQ IDNO:6, SEQ ID Ν0:7或SEQ ID NO:8中的I种或至少2种所示的氨基酸序列。
[0010]本发明的短肽抑制剂还能够用于治疗和/或预防与β -淀粉样多肽有关的疾病。所述疾病包括但不限于阿尔 茨海默症、帕金森氏症、亨廷顿氏症、前额颞退行病变、脊索侧索硬化症、II型糖尿病、牛海绵状脑病或克罗伊茨费尔特-雅各布氏病。
[0011]在第二方面，本发明提供如第一方面所述的短肽抑制剂在制备用于抑制β -淀粉样多肽聚集和/或对细胞毒害作用的药物中的用途。
[0012]其中，所述对细胞毒害作用一般是由β -淀粉样多肽的错误折叠和/或聚集造成的。优选地,所述 β-淀粉样多肽为 SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID Ν0:5、SEQ ID NO:6, SEQ ID Ν0:7或SEQ ID NO:8中的I种或至少2种所示的氨基酸序列。
[0013]本发明还提供如第一方面所述的短肽抑制剂在制备用于治疗和/或预防与β_淀粉样多肽有关的疾病的药物中的用途。
[0014]所述疾病包括但不限于阿尔茨海默症、帕金森氏症、亨廷顿氏症、前额颞退行病变、脊索侧索硬化症、II型糖尿病、牛海绵状脑病或克罗伊茨费尔特-雅各布氏病。
[0015]相比现有技术中的小分子抑制剂或多肽类调节剂，本发明的短肽抑制剂与Αβ的结合能力较强，通过表面等离基元共振技术得到的本发明的短肽抑制剂与A β的结合动力学常数中的结合常数ka达到120 (摩尔/升)1秒 '解离常数kd为10_8秒―1数量级、平衡解离常数Kd为10,摩尔/升数量级，明显优于对照短肽；利用光散射技术和ThT荧光技术检测到本发明的短肽抑制剂对β -淀粉样多肽的聚集抑制效果明显，并且优于同类短肽抑制剂；神经细胞毒性实验显示本发明的短肽抑制剂能够降低Αβ对神经细胞的毒害作用。此外，本发明的短肽抑制剂自身细胞毒性较低且其溶解性好。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1 是氮末端片段 Αβ 1-20、Αβ 1-25、Αβ 1-28 与反序列 Aβ 20-1、Aβ 25-1 和A ^ 28-1与标记分子共组装体的扫描隧道显微镜图像和进行长度测量统计分析得到的稳定组装序列。
[0017]图2是短肽抑制剂GYEVHH和对比序列GYGVGG与P -淀粉样多肽A ^ 1-42结合的表面等离基元共振检测的结果。其中图2A是12.5iiM、25iiM和50yM的八0 1_42分别与GYEVHH的结合过程；2b-2d是对比序列GYGVGG与A @ 1-42分别在12.5 y M、25 y M和50 y M下的的结合过程；2e是通过表面等离激元共振技术得到的结合常数Ka、解离常数Kd和平衡解离常数Kd。并通过表面等离激元共振得到的结果证明短肽抑制剂GYEVHH与AP 1-42的结合作用主要是主链间的氢键和侧链间的电荷相互作用。
[0018]图3是短肽抑制剂对AP 1-42聚集体形貌调控的光散射结果、ThT荧光结果和原子力显微镜图像。其中，图3A与3B分别为短肽抑制剂对P -淀粉样多肽的抑制作用的光散射和 ThT 荧光结果；图 3C-3H 分别为 AP 1-42, 1-28, AP 33-42 和 AP 1-42+GYEVHH、
l-28+GYEVHH、AP 33-42+GYEVHH摩尔比为1:1的原子力显微镜图像，图中的I微米表示X和Y坐标轴的比例尺，20纳米表示Z坐标轴的比例尺。
[0019]图4为短肽抑制剂对P -淀粉样多肽神经毒性的抑制效果。其中，图4A为10 ii M、20iiM和40 ii M不同浓度的AP 1-42与浓度比为10: 1、2: 1、1: 1、1:2和1:4的短肽抑制剂GYEVHH的神经细胞毒性测试结果；图4B为AP 1-42浓度保持在IOyM与浓度比为10:1、10: 2、10: 5、10:10、10:20和10:40的短肽抑制剂GYEVHH的神经细胞毒性测试结果及GYEVHH神经抑制效果与KLVFF的抑制效果的对比。
[0020]图5为短肽抑制剂自身的神经细胞毒性测试结果。
【具体实施方式】
[0021]为了有助于理解本发明，下面定义了一些术语。本文定义的术语具有本发明相关领域的普通技术人员通常所理解的含义。
[0022]除非另外说明，本文中的“抑制剂”指的是可以抑制P -淀粉样多肽的聚集和/或毒性的短肽。
[0023]除非另外说明，本文中的“短肽”指的是可以抑制P -淀粉样多肽的聚集和/或毒性的多肽片段。
[0024]除非另外说明，本文中的“ P -淀粉样多肽”指的是全长的P -淀粉样多肽以及其不同长度的(6-淀粉样多肽的片段。
[0025]除非另外说明，本文中的“聚集体”指的是(6-淀粉样多肽自聚集形成的单组分聚集体；“共聚集体”指的是P-淀粉样多肽与抑制剂分子或标记分子共聚集形成的多组分聚集体。
[0026]除非另外说明，在本文中，“1^”是指“11!1101/1”，“1111”是指“臟01/1”。
[0027]除非另外说明，本文中的“反序列”是指与其对应序列的氨基酸顺序相反的序列，比如反序列AP 20-1是指与AP 1-20的氨基酸序列顺序相反的序列。
[0028]本发明中，任何多肽、短肽或氨基酸序列都可以通过人工合成获得，人工合成多肽的技术属于现有技术，本领域技术人员可以根据其具备的知识和技能自己合成，也可以委托相应公司合成。
[0029]本发明的短肽抑制剂可以溶解到缓冲液中制备混合溶液，可以使短肽抑制剂的终浓度为10-100 μ M，优选为50 μ Μ。所述缓冲液可以是ρΗ6.8-7.5的磷酸盐缓冲液，优选ΡΗ7.2的磷酸盐缓冲液。
[0030]本发明中，淀粉样多肽为全长淀粉样多肽Αβ及其不同长度的片段，
[0031]优选地，所述淀粉样多肽A β选自β-淀粉样多肽Αβ 1_42(Αβ 1-42)、β-淀粉样多肽A β 1-40(Αβ 1-40)、β-淀粉样多肽A β 1_28(Αβ 1-28)、β -淀粉样多肽A β 1-25(Α β 1-25)、β-淀粉样多肽 A β 1-20 (Α β 1-20)、β -淀粉样多肽 A β 33-42 (Α β 33-42)、β-淀粉样多肽Αβ 9-20 (Αβ 9-20)及其片段中的一种或多种。最优选地，所述β _淀粉样多肽为全长淀粉样多肽A β 1-42 (Α β 1-42)。
[0032]本发明涉及的多肽及其序列总结如表1所示:
[0033]表1本发明涉及的多肽及其序列汇总表
[0034]
【权利要求】
1.一种短肽抑制剂，其序列中包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的短肽抑制剂，其特征在于，其序列为SEQID NO: 1、SEQ IDNO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15 或 SEQ ID NO: 16 所示的氨基酸序列，优选为SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的短肽抑制剂，其特征在于，所述短肽抑制剂用于抑制β-淀粉样多肽聚集和/或对细胞毒害作用； 优选地，所述对细胞毒害作用是由β-淀粉样多肽的错误折叠和/或聚集造成的； 优选地,所述 β-淀粉样多肽为 SEQ ID NO:2,SEQ ID NO: 3,SEQ ID N0:4、SEQ ID NO: 5,SEQ ID NO:6, SEQ ID N0:7或SEQ ID NO:8中的I种或至少2种所示的氨基酸序列。
4.根据权利要求1或2所述的短肽抑制剂，其特征在于，所述短肽抑制剂用于治疗和/或预防与β_淀粉样多肽有关的疾病。
5.根据权利要求4所述的短肽抑制剂，其特征在于，所述疾病选自阿尔茨海默症、帕金森氏症、亨廷顿氏症、前额颞退行病变、脊索侧索硬化症、II型糖尿病、牛海绵状脑病或克罗伊茨费尔特-雅各布氏病。
6.如权利要求1或2所述的短肽抑制剂在制备用于抑制β-淀粉样多肽聚集和/或对细胞毒害作用的药物中的用途。
7.根据权利要求6所 述的用途，其特征在于，所述对细胞毒害作用是由β-淀粉样多肽的错误折叠和/或聚集造成的。
8.根据权利要求6或7所述的用途，其特征在于，所述β-淀粉样多肽为SEQID Ν0:2、SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5,SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7 或 SEQ ID N0:8 中的I种或至少2种所示的氨基酸序列。
9.如权利要求1或2所述的短肽抑制剂在制备用于治疗和/或预防与β-淀粉样多肽有关的疾病的药物中的用途。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述疾病选自阿尔茨海默症、帕金森氏症、亨廷顿氏症、前额颞退行病变、脊索侧索硬化症、II型糖尿病、牛海绵状脑病或克罗伊茨费尔特-雅各布氏病。
【文档编号】A61K38/16GK103788178SQ201410051685
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2014年2月14日 优先权日:2014年2月14日
【发明者】徐萌, 白林灵, 谢含仪, 杨延莲, 王琛 申请人:国家纳米科学中心