Cntf在角膜缘干细胞增殖和角膜上皮损伤修复中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明的目的是提供一种睫状神经营养因子在促进角膜缘干细胞增殖和促进角膜上皮损伤修复中的应用，具体涉及睫状神经营养因子及其衍生物在制备药物及药物组合物中的用途，可用于眼表角膜和结膜上皮干细胞的培养、糖尿病角膜病变的治疗、神经性角膜炎的治疗、角膜缘干细胞缺乏症的治疗。
【专利说明】CNTF在角膜缘干细胞增殖和角膜上皮损伤修复中的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于眼科疾病治疗【技术领域】，具体涉及一种睫状神经营养因子(CNTF)在促进角膜缘干细胞增殖和促进角膜上皮损伤修复中的应用。
【背景技术】
[0002]角膜的透明及功能的完整取决于角膜各层组织的结构和代谢的正常，而位于最外层的角膜上皮组织无疑对此起着相当重要的作用。角膜上皮是防御外界致病因子侵犯的物理屏障，其完整性的维持依赖于上皮细胞的细胞间，细胞与基底膜之间的紧密连接和锚定连接以及上皮细胞不断自我更新。
[0003]角膜上皮层受损可影响细胞间的连接，引起细胞膜的通透性和选择性发生变化，从而影响其屏障功能，导致角膜易受外界致病因子的侵害引起炎症导致角膜混浊，甚至引起失明。角膜损伤后的再上皮化是损伤修复的一个最基本的过程，上皮化可以迅速重建上皮屏障，这对于保持角膜的结构完整及正常功能非常重要。角膜上皮细胞的自我更新源于角膜缘干细胞的不断增生分化，表现为增生的基底细胞的不断向心、向上移动至翼状细胞层进行分化且形成细胞与细胞间及细胞与基质间的紧密连接，从而取代不断脱落的表皮细胞层。简而言之，上皮细胞的不断更新依赖于基底细胞的不断增生、分化、移行与表层细胞的不断脱落之间的动态平衡。各种物理损伤、化学损伤、机械损伤、病原微生物、内分泌及免疫性因素均可导致角膜上皮损伤。如糖尿病性角膜病变，有研究表明:47%-64%的糖尿病患者可能会出现原发性角膜病变，其临床特征主要表现为角膜敏感度下降、上皮愈合延迟、神经营养性角膜溃疡等症状。糖尿病患者在进行白内障或视网膜手术后可能出现角膜上皮再生延迟，甚至出现反复剥脱 现象。
[0004]角膜上皮损伤后的愈合是一个非常复杂的过程，有许多细胞参与，各种细胞又分泌多种细胞因子，这些细胞之间、因子之间、细胞和因子之间存在着错综复杂的关系，涉及到细胞运动、粘附、增殖和分化等各个方面，构成一个复杂的网络调控体系。角膜上皮损伤后的愈合过程非常复杂，有许多因素参与调节:①源于基底细胞及角膜缘干细胞的不断增殖、分化的上皮细胞的自我更新对上皮细胞损伤后的迅速再上皮化、重建上皮屏障，从而保持角膜的结构完整及正常功能非常重要；②在角膜上皮愈合过程中，由细胞表达的不同的细胞外基质分子及细胞表面受体，对由细胞骨架介导的细胞粘附和运动方面起关键性作用；③许多生长因子如EGF、KGF、HGF、TGF、PDGF等)通过自分泌或/和旁分泌途径参与调节角膜上皮细胞的增殖及迁移，维持角膜结构和功能的正常；④位于细胞表面的细胞粘附分子(如整合素)以受体-配体的形式发挥作用，在角膜创伤愈合中起重要作用；⑤另外，其他一些因素如神经性因素等也参与调节角膜上皮细胞的屏障功能及创伤愈合。
[0005]不论何种原因引起的角膜上皮缺损，能否迅速完整地修复，是恢复角膜上皮细胞的屏障功能、促进创伤愈合、保持良好视力的关键。因此全面了解角膜上皮细胞屏障功能及创伤愈合的调节因素，对临床上治疗角膜上皮细胞屏障功能障碍及促进创伤愈合来讲是非常重要的。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种睫状神经营养因子在促进角膜缘干细胞增殖和促进角膜上皮损伤修复中的应用，具体涉及睫状神经营养因子及其衍生物在制备药物及药物组合物中的用途，可用于眼表角膜和结膜上皮干细胞的培养、糖尿病角膜病变的治疗、神经性角膜炎的治疗、角膜缘干细胞缺乏症的治疗。
[0007]本发明首先提供一种睫状神经营养因子的新用途，即在制备治疗角膜缘干细胞增殖和促进角膜上皮损伤修复制品中的应用；
[0008]所述的制品为滴眼液，其中包含有药理有效浓度的睫状神经营养因子；
[0009]所述的制品还可以是注射液；
[0010]所述的睫状神经营养因子，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1;
[0011]为了提高睫状神经营养因子在治疗角膜缘干细胞增殖和促进角膜上皮损伤修复中的效果，发明人对睫状神经营养因子的氨基酸序列进行了改造，改造后的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。
[0012]本发明发现CNTF不仅能促进角膜缘干细胞增殖和克隆形成能力，还能促进正常小鼠和糖尿病小鼠的角膜上皮的损伤修复，可用于眼表角膜和结膜上皮干细胞的培养、糖尿病角膜病变的治疗 、神经性角膜炎的治疗、角膜缘干细胞缺乏症的治疗。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1:在TKE2的培养基中添加不同浓度的CNTF对细胞克隆形成能力的影响，培养液中添加10ng/ml和20ng/ml CNTF能有效促进TKE2细胞克隆的形成能力。
[0014]图2 =CNTF处理后的细胞计数结果。培养液中添加CNTF能有效促进TKE2细胞克隆的增殖，*ρ〈0.05，**Ρ〈0.01。
[0015]图3 =CNTF对ΤΚΕ2细胞标记物Ρ63表达的影响。培养液中添加10ng/ml的CNTF能有效促进TKE2细胞P63的表达。
[0016]图4 =CNTF对TKE2细胞标记物ABCG2表达的影响。培养液中添加10ng/ml的CNTF能有效促进TKE2细胞ABCG2的表达。
[0017]图5 =CNTF对TKE2细胞标记物Bmi I表达的影响。培养液中添加10ng/ml的CNTF能有效促进TKE2细胞Bmil的表达。
[0018]图6 =CNTF对TKE2细胞标记物Λ ΝΡ63表达的影响。培养液中添加10ng/ml的CNTF能有效促进TKE2细胞ΛΝΡ63的表达。
[0019]图7 =CNTF对TKE2细胞标记物ki67表达的影响。培养液中添加10ng/ml的CNTF能有效促进TKE2细胞ki67的表达。
[0020]图8 =CNTF对正常小鼠角膜上皮损伤修复的影响，结膜下注射50ngCNTF能有效促进角膜上皮的损伤修复。
[0021]图9 =CNTF对STZ诱导的糖尿病小鼠角膜上皮损伤修复的影响，结膜下注射50ngCNTF能有效促进糖尿病小鼠角膜上皮的损伤修复。
【具体实施方式】[0022]本发明在小鼠角膜上皮干细胞系TKE2的培养基KSFM中添加一定剂量的CNTF(例如IO-1OOng/μ I)能够有效地促进角膜缘干细胞的增殖。同时，在正常C57BL/6小鼠和STZ诱导的糖尿病C57BL/6小鼠中，建立角膜上皮刮除损伤模型后，结膜下注射一定剂量的CNTF (例如50ng)，能够有效地促进角膜上皮损伤修复，从而促成了本发明。
[0023]CNTF最初是从鸡的眼组织睫状节中提取出来，因对睫状节神经元有营养作用并可维持鸡副交感神经节的存活而得名。CNTF是由一个约200个氨基酸残基组成的酸性蛋白质，分子量为20~24kD，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1，在第17位有一个CyS，分子内无二硫键，无分泌信号，无N-糖基化位点和信号及肽。研究发现，CNTF具有多种功能，在神经系统，肌肉系统，肥胖症及其相关疾病的发生发展过程中发挥重要作用。
[0024]实施例1:添加不同浓度的CNTF对TKE2细胞的影响
[0025]1.应用 TKE2 细胞的培养液(Keratinocyte-SFM 加 BPE (50 μ g/mL)和 rEGF(5ng/mL):GIBC0, 10724-011)常规培养TKE2细胞，将1000个细胞接种至30mm培养皿中，分别向各皿中添加不同浓度的CNTF(0、5、10、20和50ng/ml)，然后于5%C02和37摄氏度的条件下培养，每3天更换新培养基，同时添加上述浓度的CNTF因子，培养9天后固定细胞后使用结晶紫染色。CNTF处理后的细胞克隆生长情况见图1。如图1所示，培养液中添加10ng/ml或20ng/ml的CNTF能有效促进TKE2细胞克隆的形成能力。
[0026]2.应用 TKE2 细胞的培养液(Keratinocyte-SFM 加 BPE (50 μ g/mL)和 rEGF(5ng/mL):GIBC0, 10724-011)常规培养TKE2细胞，将4 X IO4个细胞接种至60mm培养皿中，分别向各皿中添加不同浓度的CNTF(O、5、10和20ng/ml)，然后于5%C02和37摄氏度的条件下培养，每3天更换新培养基，同时添加上述浓度的CNTF因子，培养6天后利用细胞计数器进行细胞计数，细胞数量统计见图2。如图2所示，含10和20ng/ml CNTF培养液培养的TKE2细胞较空白对照培养的TKE2细胞数量增加了 2-2.5倍(*P〈0.01)。由此，证明了添加10_20ng/ml的CNTF能促进TKE2细胞的增殖。
[0027]3.应用 TKE2 细胞的培养液(Keratinocyte-SFM 加 BPE (50 μ g/mL)和 rEGF(5ng/mL):GIBC0, 10724-011)常规培养TKE2细胞，将10个细胞接种至96孔板中，分别向各皿中添加不同浓度的CNTF(O和10ng/ml)，然后于5%C02和37摄氏度的条件下培养，每3天更换新培养基，同时添加上述浓度的CNTF因子，培养9天后固定细胞，通过免疫荧光方法检测CNTF对TKE2细胞干细胞标记和增殖相关标记(P63，ABCG2, Bmil, ΔΝΡ63, ki67)的影响。如图3-7所示，培养液中添加10ng/ml的CNTF能有效促进TKE2细胞干细胞标记和增殖相关标记的表达。
[0028]实施例2:外源性添加CNTF对角膜上皮损伤修复的影响
[0029]1.CNTF对正常小鼠角膜上皮损伤修复的影响。
[0030]将12只C57BL/6小鼠(6_8周龄)随机分为对照组和实验组，使用3mm环钻和上皮刮刀刮除小鼠右眼角膜中央3mm区域内的上皮，同时对照组小鼠右眼结膜下注射7μ IPBS,实验组小鼠右眼结膜下注射50ng CNTF (溶解于7 μ I PBS)，于建模后0、24、48和72h分别使用荧光素钠染色及裂隙灯下照相，观察各组小鼠的上皮损伤修复的情况，代表性裂隙灯观察照片见图8。如图8所示，结膜下注射50ng CNTF能有效促进角膜上皮的损伤修复。
[0031]2.CNTF对STZ诱导的糖尿病小鼠角膜上皮损伤修复的影响[0032]将12只STZ诱导的C57BL/6糖尿病小鼠随机分为对照组和实验组，使用3mm环钻和上皮刮刀刮除小鼠右眼角膜中央3mm区域内的上皮，同时对照组小鼠右眼结膜下注射7μ I PBS，实验组小鼠右眼结膜下注射50ng CNTF(溶解于7μ1 PBS)，于建模后0、24、48和72h分别使用荧光素钠染色及裂隙灯下照相，观察各组小鼠的上皮损伤修复的情况，代表性裂隙灯观察照片见图9。如图9所示，结膜下注射50ng CNTF能有效促进糖尿病小鼠角膜上皮的损伤修复。
[0033]实施例3:睫状神经营养因子的改造及效果检测
[0034]一、为了提高睫状神经营养因子在治疗角膜缘干细胞增殖和促进角膜上皮损伤修复中的效果，对睫状神经营养因子的氨基酸序列进行了改造，具体改造步骤如下:
[0035]以人CNTF cDNA为模板，通过PCR扩增CNTF全长蛋白序列中第13-180位(CNTF-截短)共168个氨基酸的编码序列，在引物序列的两端分别为人工引入的EcoR I和Xho I酶切位点。上下游引物序列分别为:
[0036]AGACACGAATTCCGTCGGGACCTCTGTAGCCG ；
[0037]AGACTCGAGAGAAATGAAACGAAGGTCATGGA。用 EcoRI 和 XhoI 分别双酶切空载体PGEX-4T-1和PCR扩增产物，将CNTF-截短以正确读框与pGEX_4T_l载体连接，获得GST与CNTF-截短融合蛋白表达质粒pGEX-CNTF-截短。获得的重组表达载体分别应用酶切和测序的方法进行鉴定，结果显示酶切片段的大小正确，并且测序结果显示与参考序列完全相符，根据测序结果和读码框位置可知，翻译后的氨基酸序列为SEQ ID N0:2。
[0038]将构建的GST融合蛋白表达质粒转化到大肠杆菌BL-21中，挑取单克隆菌株接种到3ml LB培养液中，37 °C、250rpm振荡过夜；再按3%。接种量转接，37°C培养至菌液A值达到0.6~0.8后，加入IPTG至终浓度为500mol/L,继续振荡培养2h ;然后4°C、3000rpm离心30min收集菌体，按40:1的比例加入细菌裂解液重悬菌体，超声破碎细菌，离心收集上清液；应用 Glutathione Sepharose4B 纯化柱(购自 Amersham Biosciences 公司)纯化GST-CNTF-截短融合蛋白；将GST-CNTF-截短融合蛋白用Thrombin凝血酶切掉之后，再过一次纯化柱，收集穿透液了，然后通过透析和冻干，得到CNTF-截短蛋白，然后使用PBS缓冲液重新溶解为IOOng/ μ I的储液，冻存于_80°C备用。并检测改造后的CNTF(CNTF-截短蛋白)在治疗角膜缘干细胞增殖和促进角膜上皮损伤修复中的效果。
[0039]二、CNTF-截短蛋白对TKE2细胞的影响
[0040]1.应用 TKE2 细胞的培养液(Keratinocyte-SFM 加 BPE (50 μ g/mL)和 rEGF(5ng/mL):GIBC0, 10724-011)常规培养TKE2细胞，将4X IO4个细胞接种至60mm培养皿中，分别向两皿中添加CNTF(10ng/ml)和CNTF-截短(10ng/ml)，然后于5%C02和37°C的条件下培养，每3天更换新培养基，同时添加上述浓度的CNTF和CNTF-截短因子，培养6天后利用细胞计数器进行细胞计数，细胞数量统计显示，含CNTF-截短因子培养液培养的TKE2细胞较含CNTF培养的TKE2细胞数量增加了 1.3倍(？〈0.05)。由此可见，与添加CNTF因子相比，添加CNTF-截短因子能更有效地促进TKE2细胞的增殖。
[0041]2.应用 TKE2 细胞的培养液(Keratinocyte-SFM 加 ΒΡΕ(50 μ g/mL)和 rEGF(5ng/mL):GIBC0, 10724-011)常规培养TKE2细胞，将10个细胞接种至96孔板中，分别向两皿中添加CNTF (10ng /ml)和CNTF-截短(10ng/ml)，然后于5%C02和37°C的条件下培养，每3天更换新培养基，同时添加上述浓度的CNTF和CNTF-截短因子，培养9天后固定细胞，通过免疫荧光方法检测和CNTF-截短对TKE2细胞干细胞标记和增殖相关标记(P63，ABCG2，Bmil,ΔΝΡ63, ki67)的影响。结果显示，培养液中添加10ng/ml的CNTF-截短能更有效地促进TKE2细胞干细胞标记和增殖相关标记的表达。
[0042]三、外源性添加CNTF对角膜上皮损伤修复的影响
[0043]1.CNTF对正常小鼠角膜上皮损伤修复的影响
[0044]将12只C57BL/6小鼠(6_8周龄)随机分为对照组和实验组，使用3mm环钻和上皮刮刀刮除小鼠右眼角膜中央3mm区域内的上皮，同时对照组小鼠右眼结膜下注射50ng〇见^(溶解于7口1 PBS)，实验组小鼠右眼结膜下注射50ng CNTF-截短(溶解于7 μ I PBS)，于建模后0、24、48和72h分别使用荧光素钠染色及裂隙灯下照相，观察各组小鼠的上皮损伤修复的情况，结果表明结膜下注射50ng CNTF-截短能有效促进角膜上皮的损伤修复。
[0045]2.CNTF对STZ诱导的糖尿病小鼠角膜上皮损伤修复的影响
[0046]将12只STZ诱导的C57BL/6糖尿病小鼠随机分为对照组和实验组，使用3mm环钻和上皮刮刀刮除小鼠右眼角膜中央3mm区域内的上皮，同时对照组小鼠右眼结膜下注射50ng CNTF (溶解于7 μ I PBS)，实验组小鼠右眼结膜下注射50ng CNTF-截短(溶解于7 μ IPBS)，于建模后0、24、48和72h分别使用荧光素钠染色及裂隙灯下照相，观察各组小鼠的上皮损伤修复的情况，结果表明结膜下注射50ng CNTF-截短能有效促进糖尿病小鼠角膜上皮的损伤修复。
【权利要求】
1.一种睫状神经营养因子的用途，其特征在于，是在制备在制备治疗角膜缘干细胞增殖和促进角膜上皮损伤修复制品中的应用。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于所述的睫状神经营养因子，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于所述的睫状神经营养因子的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。
4.如权利要求1所述的用途，其特征在于所述的制品为包含有药理有效浓度的睫状神经营养因子的滴眼液或注射液。
5.如权利要求4所述的用途，其特征在于所述的药理有效浓度为10-100ng/ml。
6.一种治疗角膜缘干细胞增殖和促进角膜上皮损伤修复的制品，其特征在于，所述的制品为包含有药理有 效浓度的睫状神经营养因子的药物。
【文档编号】A61K38/18GK103800894SQ201410075767
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2014年3月3日 优先权日:2014年3月3日
【发明者】周庆军, 陈鹏, 谢立信, 张阳阳, 狄国虎 申请人:山东省眼科研究所