一种构建先天性肝内胆管发育不良综合征动物模型的方法
【专利摘要】本发明公开了一种构建先天性肝内胆管发育不良综合征动物模型的方法，解决现有技术较为复杂、费用高、效率低的问题。本发明包括以下步骤：（1）配制γ-分泌酶抑制剂玉米油溶液和γ-分泌酶抑制剂磷酸盐缓冲液溶液；（2）将成年雌雄大鼠合笼，从雌鼠怀孕开始计时，在雌性孕鼠胚胎14天时，向每个羊膜腔注射溶液甲；同时，向孕鼠尾静脉注射溶液乙；（3）常规饲养孕鼠至其生产，胎鼠即为先天性肝内胆管发育不良综合征动物模型。本发明有利于进行先天性肝内胆管发育不良综合征的研究，尤其是病理生理机制研究以及药物的研发。
【专利说明】一种构建先天性肝内胆管发育不良综合征动物模型的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种疾病的动物模型构建方法，具体来说，是一种构建先天性肝内胆管发育不良综合征动物模型的方法。
【背景技术】
[0002]先天性疾病就是一出生就有的病。母亲在怀孕期间接触环境有害因素，如农药、有机溶剂、重金属等化学品，或过量暴露在各种射线下，或服用某些药物，或染上某些病菌，甚至一些习惯爱好，如桑拿(蒸气浴)和饮食癖好，都可能引起胎儿先天异常，但不属于遗传疾病。先天性胆管发育不良综合征涉及的脏器包括肝脏、心脏、骨骼、眼睛和颜面等，国外报道该病在新生儿的发病率约为1/70000，因此其病理生理机制的研究尤为重要，成功建立该病的动物模型可以为该病的预防和治疗提供研究基础。基因敲除动物是目前广泛被采纳的方法。但是在目前大多数实验室中，很难有条件建立这种动物模型，另外这种方法也因为其技术复杂、费用高、效率低，因此并不是建立这种动物模型的最好方法。此外若使用其他方法诱导，会因为很多药物无法通过血管胎盘屏障而使药物作用降低，使诱导效率下降。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于提供一种构建先天性肝内胆管发育不良综合征动物模型的方法，解决现有技术较为复杂、费用高、效率低的问题。
[0004]本发明通过下述技术方案实现:
一种构建先天性肝内胆管发育不良综合征动物模型的方法，包括以下步骤:
(1)将Y-分泌酶抑制剂溶解于玉米油中，配制成浓度为10mg/ml的溶液甲(也就是指Y -分泌酶抑制剂在溶液甲中的浓度是10mg/ml ;例如:1ml的溶液甲中含有1mg Y -分泌酶抑制剂)；将Y-分泌酶抑制剂溶解于二甲基亚砜中，再用磷酸盐缓冲液(磷酸盐缓冲液采用浓度为0.01M的磷酸盐缓冲液，具体浓度则是0.01mol/L)稀释成浓度为5mg/ml的溶液乙(也就是指Y-分泌酶抑制剂在溶液乙中的浓度为5mg/ml ;例如Iml的溶液乙中含有5mg Y -分泌酶抑制剂)；
(2)将成年雌雄大鼠合笼，从雌鼠怀孕开始计时，在雌性孕鼠胚胎14天时，向每个羊膜腔注射溶液甲；同时，向孕鼠尾静脉注射溶液乙；
(3 )常规饲养孕鼠至其生产，胎鼠即为先天性肝内胆管发育不良综合征动物模型。
[0005]进一步地，溶液甲和溶液乙的注入量均是根据孕鼠实际体重确定，溶液甲是按照5mg/kg的剂量注射到每个羊膜腔内，溶液乙是按照lmg/kg的剂量注射到孕鼠尾静脉内。其中“5mg/kg”是指孕鼠体重假如是lkg，那么需要注射5mg的Y -分泌酶抑制剂，那个溶液甲实际量则为0.5ml，故而“5mg/kg”中的5mg量是指的Y -分泌酶抑制剂的量，而不是溶液甲的量；“lmg/kg”是指孕鼠体重假如是1kg，那么需要注射Img的Y-分泌酶抑制剂，那么溶液乙实际量则为0.2ml,故而“lmg/kg”中的Img量是指Y -分泌酶抑制剂的量,而不是溶液乙的量。[0006]再进一步地，所述步骤(2)具体的方法为:将成年雌雄鼠装入同一个笼中使雌鼠怀孕，再从雌鼠怀孕开始计时，在雌性孕鼠胚胎14天时，在超声引导下穿刺孕鼠羊膜腔，向每个羊膜腔内注射溶液甲；同时，在超声引导下穿刺孕鼠尾静脉，注射溶液乙。
[0007]另外，本发明的Y -分泌酶抑制剂为DAPT、LY-450139、MK-0752、E2012、BMS-708163、PF-3084014、GS1-953 中的一种。
[0008]本发明具有以下优点及有益效果:
本发明有利于进行先天性肝内胆管发育不良综合征的研究，尤其是病理生理机制研究以及药物的研发；且本发明相对现有技术来说，易于操作，费用低、效率高，适合推广应用。
【专利附图】
【附图说明】
[0009]图1为Jaggedl免疫组化染色结果比较图。
[0010]图2为胎鼠血清胆红素浓度结果比较图。
[0011]图3为肺动脉根部内径比较图。
【具体实施方式】
[0012]下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的实施方式并不限于此。实施例
[0013]一种 构建先天性肝内胆管发育不良综合征动物模型的方法，包括以下步骤:
(1)将Y-分泌酶抑制剂溶解于玉米油中，配制成浓度为10mg/ml的溶液甲；将Y-分泌酶抑制剂溶解于二甲基亚砜中，再用磷酸盐缓冲液稀释成浓度为5mg/ml的溶液乙；
(2)将成年雌雄鼠装入同一个笼中使雌鼠怀孕，再从雌鼠怀孕开始计时，在雌性孕鼠胚胎14天时，在超声引导下穿刺孕鼠羊膜腔，向每个羊膜腔内注射溶液甲；同时，在超声引导下穿刺孕鼠尾静脉，注射溶液乙；
(3)术后常规饲养孕鼠至其生产，胎鼠即为先天性肝内胆管发育不良综合征动物模型。
[0014]其中，溶液甲和溶液乙的注入量均是根据孕鼠实际体重确定，溶液甲是按照5mg/kg的剂量注射到每个羊膜腔内，溶液乙是按照lmg/kg的剂量注射到孕鼠尾静脉内。
[0015]本发明之所以将Y-分泌酶抑制剂溶于玉米油中，是为了增加脂溶性，有利于药物在体内的吸收、运转。本发明利用超声引导能精确定位到每个羊膜腔进行准确注射，减少药物在体内代谢所导致的降解；此外，同时辅以尾静脉小剂量给药，在控制孕鼠体内Y-分泌酶抑制剂的浓度，减少孕鼠的死亡率的同时，不减弱对胎鼠先天性肝内胆管发育不良模型建立的效果。另外，由于胚胎14天为肝干细胞向胆管上皮细胞分化的开始阶段，在此阶段阻断Notch信号通路才能有效的抑制胆管上皮细胞的生成，最终导致胎鼠发生先天性肝内胆管发育不良综合征，故而本发明选择在胚胎14天进行药物注射。
[0016]对本发明构建的动物模型(胎鼠)的肝脏、心脏、血清等组织标本处理方法如下:
1、免疫组织化学方法检测Jaggedl的表达(检测结果如图1):
(I)使用蜡块包埋机常规包埋肝组织，包埋完成后使用石蜡切片机对蜡块组织进行切片，石蜡切片厚度为I μ m。
[0017](2)脱蜡/脱水:A.将石蜡切片放入二甲苯中5min，取出后也能够蒸馏水漂洗(5min，2次)，上述操作共反复进行3次；B.将二甲苯处理过的组织切片放入无水乙醇中lOmin，取出后用蒸馏水漂洗(5min，2次)，上述操作共反复进行2次；C.将无水乙醇处理过的组织切片放入95%乙醇中lOmin，取出后用蒸馏水漂洗(5min，2次)，上述操作反复进行2次。
[0018](3)抗原修复:将完成脱蜡/脱水的组织切片放入煮沸的柠檬酸抗原修复液中，保持抗原修复液处于达到沸点的临界状态(不使液体沸腾)lOmin，取出组织切片在室温下冷却 30min。
[0019](4)用PBS (磷酸盐缓冲液)漂洗抗原修复后的组织切片(5min，3次)，将组织切片浸入 3%H202 中 1min。
[0020](5)用PBS (磷酸盐缓冲液)漂洗组织切片(5min，3次)，将组织切片使用封闭液在室温下封闭Ih。
[0021](6)弃去封闭液，用抗体稀释液按照小鼠抗Jaggedl抗体(1:50,博奥森，北京)的比例稀释一抗，将稀释后的一抗添加到组织切片上，将组织切片放入湿盒，4°C孵育过夜(20 ~24h)。
[0022](7)弃去组织切片上孵育的一抗，用PBS (磷酸盐缓冲液)漂洗组织切片(5min，3次)，分别加入免疫组化试剂盒(中杉，北京)中的与一抗来源种属相对应的二抗，室温孵育30mino
[0023](8)弃去组织切片上孵育的二抗，用PBS (磷酸盐缓冲液)漂洗组织切片(5min，3次)，加入免疫组化试剂盒的三抗，室温孵育15min。
[0024](9)弃去组织切片上孵育的三抗，使用DAB显色试剂盒(中衫，中国)进行DAB显色(2~4min)，显色完成后用蒸馏水漂洗组织切片。
[0025](10)使用苏木素对组织切片进行衬染，衬染完成后用蒸馏水漂洗组织切片(5min，3次)。
[0026](11)脱水:A.将组织切片放入95%乙醇中lOmin，取出后用蒸馏水漂洗(10s，2次)，上述操作反复进行2次；B.将95%乙醇处理过的组织切片放入无水乙醇中lOmin，取出后用蒸馏水漂洗(10s，2次)，上述操作共反复进行2次；C.将无水乙醇处理过的组织切片放入二甲苯中5min，取出后用蒸馏水漂洗(10s，2次)，上述操作共反复进行2次。
[0027](12)将完成脱水的组织切片用中性树脂进行封片，封片后室温晾干24h后置于显微镜下进行观察和拍照。
[0028]从图1中可看出，模型组肝内胆道系统明显多于对照组(本申请中的所有对照组均是指给孕鼠羊膜注射等体积不含有Y -分泌酶抑制剂的玉米油，同时在尾静脉内注射等体积不含有Y -分泌酶抑制剂的磷酸盐缓冲液，从而获得的胎鼠)，同时Jaggedl缺失会导致先天性肝内胆管发育不良，对Jaggedl进行免疫组织化学染色，结果显示模型组的细胞膜上的Jaggedl表达(棕色颗粒)显著低于对照组，病理符合肝内胆管发育不良。其中棕色是免疫组织化学染出来的。
[0029]2、两组胎鼠血清胆红素浓度结果比较(检测结果如图2):
(I)胎鼠乙醚常规麻醉后。固定于手术台，碘酊消毒腹部皮肤，75%脱碘后，保持无菌条件下一次打开胎鼠腹腔，在留取肝脏、心脏标本前，先用头皮针穿刺腹主动脉，抽取全血5ml ；(2)将全血在4°C、4000转/分下离心10min，分层后吸取上层血清，全自动生化分析仪(C0BAs400，罗氏公司，德国)检测血清中总胆红素、直接胆红素、间接胆红素。
[0030]从图2中可看出，本发明构建的模型组胎鼠出生后即有胆汁淤积症状，符合肝内胆管发育不良的临床表现。
[0031]3、游标卡尺测量肺动脉内径(检测结果如图3):游标卡尺测量肺动脉与心脏连接处(即肺动脉根部)内径。
[0032]从图3中可看出，本发明构建的模型组胎鼠肺动脉根部内径显著小于对照组，模型组肺动脉根部显著缩窄，符合先天性肝内胆管发育不良的心血管表现。
[0033]按照上述实施例，便可很好地实现本发明。值得说明的是，基于上述设计的前提下，为解决同样的技术问题，即使在本发明上做出的一些无实质性的改动或润色，所采用的技术方案的实质仍然与 本发明一样，故其也应当在本发明的保护范围内。
【权利要求】
1.一种构建先天性肝内胆管发育不良综合征动物模型的方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)将Y-分泌酶抑制剂溶解于玉米油中，配制成浓度为10mg/ml的溶液甲；将Y-分泌酶抑制剂溶解于二甲基亚砜中，再用磷酸盐缓冲液稀释成浓度为5mg/ml的溶液乙； (2)将成年雌雄大鼠合笼，从雌鼠怀孕开始计时，在雌性孕鼠胚胎14天时，向每个羊膜腔注射溶液甲；同时，向孕鼠尾静脉注射溶液乙； (3 )常规饲养孕鼠至其生产，胎鼠即为先天性肝内胆管发育不良综合征动物模型。
2.根据权利要求1所述的一种构建先天性肝内胆管发育不良综合征动物模型的方法，其特征在于，溶液甲和溶液乙的注入量均是根据孕鼠实际体重确定，溶液甲是按照5mg/kg的剂量注射到每个羊膜腔内，溶液乙是按照lmg/kg的剂量注射到孕鼠尾静脉内。
3.根据权利要求2所述的一种构建先天性肝内胆管发育不良综合征动物模型的方法，其特征在于，所述步骤(2)具体的方法为:将成年雌雄鼠装入同一个笼中使雌鼠怀孕，再从雌鼠怀孕开始计时，在雌性孕鼠胚胎14天时，在超声引导下穿刺孕鼠羊膜腔，向每个羊膜腔内注射溶液甲；同 时，在超声引导下穿刺孕鼠尾静脉，注射溶液乙。
【文档编号】A61K9/08GK104027810SQ201410303382
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2014年6月30日 优先权日:2014年6月30日
【发明者】王涛, 汤礼军, 罗皓, 许川, 汪涛, 闫洪涛, 梁鸿寅, 黄竹, 马利红 申请人:王涛