一种自组装多肽—凋亡素基因复合纳米颗粒及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种自组装多肽—凋亡素基因复合纳米颗粒及其制备方法和应用。本发明所述的自组装多肽—凋亡素基因复合纳米颗粒是由自组装多肽作为载体，通过自身的酸性氨基酸和碱性氨基酸所带的电荷与携带凋亡素基因的质粒分子之间形成离子键结合，质粒分子牢固粘附于自组装多肽表面，形成复合纳米颗粒。该复合纳米颗粒呈纤维状，长度为100～200nm，直径为10～20nm。该纳米颗粒表面富含精氨酸，能与细胞膜表面精氨酸受体识别结合并被细胞摄取，在细胞内表达其所携带的基因，所表达的凋亡素蛋白能特异性诱导肿瘤细胞凋亡而对正常细胞无毒。本发明的复合纳米颗粒是一种新型的抗肿瘤基因治疗生物制剂，具有广阔的应用前景。
【专利说明】-种自组装多肽一凋亡素基因复合纳米颗粒及其制备方法 和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因治疗【技术领域】，具体涉及一种能特异性诱导肿瘤细胞凋亡而对正 常细胞无毒的自组装多肽一凋亡素基因复合纳米颗粒及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 凋亡素（Apoptin)亦称 VP3,是源自鸡贫血病毒（chicken anemia virus，CAV)的 一种小分子蛋白，分子量13. 6 kDa，由121个氨基酸组成，富含脯氨酸、碱性氨基酸和高比 例的丝/苏氨酸残基。凋亡素与其他任何动物或病毒蛋白没有序列同源性。凋亡素能特异 性诱导肿瘤细胞和具有转化表型的细胞凋亡而对正常细胞无毒性作用。迄今，已有的研究 报道表明，凋亡素能够特异性的诱导15种以上不同组织来源的人肿瘤细胞类型共70余种 肿瘤细胞系凋亡，由此可见凋亡素具有广谱的肿瘤细胞诱导凋亡效应。是一种非常有应用 前景的抗肿瘤生物制剂。
[0003] 以往在凋亡素应用的探索中有以腺病毒为载体的质粒投送、将凋亡素质粒与唾液 酸糖蛋白通过多聚赖氨酸链接靶向导入肝脏肿瘤、以灭活禽痘病毒为凋亡素质粒载体、以 透膜肽TAT或PTD4与凋亡素蛋白融合，或在此基础上对凋亡素的氨基酸序列进行突变、改 造展开应用研究、也有以噬菌体纳米生物颗粒（Phage Nanobioparticle)作为凋亡素投送 载体的研究。这些研究为凋亡素的临床应用做出了有益的探索，但还是面临一系列难题即： ①以改造的生物载体投送凋亡素质粒或凋亡素基因，制备过程繁琐、其投送效率低，诱导肿 瘤细胞凋亡效果不理想；②以改造后的病毒作为基因载体其安全性有待进一步评估；③以 透膜肽融合凋亡素蛋白质投送，凋亡素蛋白质制备难度大、成本高、难以获取大量可溶性蛋 白质，由于凋亡素蛋白源自病毒其在溶液中易聚集沉淀，并且凋亡素蛋白质进入体内也会 使宿主产生相应抗体，大大降低其诱导肿瘤细胞凋亡的效应。
[0004] 目前，纳米技术的发展为肿瘤的生物治疗提供了全新的技术平台。纳米技术是指 在1~100 nm尺度范围内研究原子、分子的结构及其相互作用并加以应用的技术。近年来， 纳米给药技术越来越多的被应用到了抗肿瘤研究中。随着研究的深入，现已认识到，应用纳 米技术可改善药物剂型的理化特性，并且提高了药物的靶向性、增高实体瘤内部血药浓度、 缓释性等优点，是当前肿瘤诊断和治疗的研究热点之一，主要集中在发展携带抗肿瘤药物 或作为肿瘤成像试剂的纳米颗粒载体。
[0005] 随着纳米生物技术的飞速发展，一种新型的非病毒载体系统：纳米基因载体系统 的出现为肿瘤的基因治疗注入了新的活力。它与病毒载体相比有如下的优点：低免疫原性； 高容量性；可对插入其中的物质成分有很好的保护作用。也有学者利用纳米技术在体内投 送 Small Interfering RNA (Si RNA)进行了探索。
[0006] 最近，一种新型原位水溶胶纳米投送材料被开发出来，该系统基于自组装多肽 (self-assembling peptide),它能够在生理条件下自发组装交联成直径1(T20 nm纳米纤 维水凝胶，在含有离子的水溶液中形成稳定的β -折叠结构，无免疫原性，组装交联过程中 无需经过紫外或化学修饰，其序列中富含精氨酸残基，易于与细胞膜表面精氨酸受体结合 转运至细胞内，可用于蛋白质、小分子RNA、疏水性化疗药物紫杉醇的包装投送。但大分子 量的重组质粒DNA与自组装多肽的包装和相关研究尚无报道，以往向细胞内投送重组质粒 DNA常用的方法有：脂质体介导转染、低温磷酸钙转染、DEAE葡聚糖介导转染、电穿孔、显微 注射等，上述方法各自有其优缺点。但都存一个共性：对细胞有损伤。
[0007] 为此，研制开发一种自组装多肽一凋亡素基因复合纳米颗粒及其制备方法和应 用。
【发明内容】
[0008] 本发明第一目的在于提供一种自组装多肽一凋亡素基因复合纳米颗粒；第二目的 在于提供一种自组装多肽一凋亡素基因复合纳米颗粒的制备方法；第三目的在于提供一种 自组装多肽一凋亡素基因复合纳米颗粒在抗肿瘤治疗中的应用。
[0009] 本发明第一目的这样实现的，所述的自组装多肽一凋亡素基因复合纳米颗粒，是 以自组装多肽作为载体，通过自身的酸性氨基酸和碱性氨基酸所带的电荷与携带凋亡素基 因的质粒分子之间形成离子键结合，质粒分子牢固粘附于自组装多肽表面，形成复合纳米 颗粒。
[0010] 本发明第二目的这样实现的，所述的自组装多肽一凋亡素基因复合纳米颗粒的制 备方法，包括如下步骤： (1) 合成自组装多肽； (2) 构建含凋亡素基因的质粒； (3) 配制自组装多肽溶液； (4) 在多肽溶液中加入步骤（2)构建的质粒溶液，充分作用后得到纳米颗粒悬浊液； (5) 纳米颗粒检测。
[0011] 本发明第三目的这样实现的，所述的自组装多肽一凋亡素基因复合纳米颗粒在抗 肿瘤治疗中的应用。
[0012] 与现有技术相比，本发明的有益效果为： (1) 本发明首次以合适的自组装多肽与大分子重组质粒DAN间的量质比，制备自组装 多肽包装凋亡素编码重组质粒（pcDNA3-别)，形成一种纤维状复合纳米颗粒，其化 学本质为自组装多肽与质粒DNA形成的复合生物大分子，长度度约100?200nm，直径约 10?20nm不等； (2) 本发明所述的复合纳米颗粒能被细胞摄取，不损伤细胞，能被细胞高效率摄取，摄 取率大于95%，在细胞内表达其所携带基因，所表达的凋亡素蛋白能特异性诱导肿瘤细胞凋 亡而对正常细胞无毒。由于凋亡素不损伤正常细胞，可克服以往肿瘤基因治疗中治疗基因 靶向性不足的缺点，此复合纳米颗粒是一种新型的抗肿瘤基因治疗生物制剂。
【专利附图】
【附图说明】
[0013] 图 1 为 pcDNA3-/i4-a/7〇/7ii/7 质粒分子结构图； 图2为自组装多肽溶液与自组装多肽一pcDNA3-别-卻复合纳米颗粒悬浊液； 图3为未包装pcDNA3-/^-a/7〇/?ii与自组装多肽一pcDNA3-/^-a/7〇/?ii/7复合纳米颗粒 琼脂糖凝胶电泳； 图中，I-DNA marker ;2-未包装pcDNA3-ffl-<3/70/7ii/? ;3-自组装多肤一^>c\Mk?>-HA-apoptin 复 合纳米颗粒； 图4为自组装多肽一pcDNA3-别-卻复合纳米颗粒透射电镜图片； 图5为免疫荧光技术检测凋亡素基因在肾脏透明细胞癌7860内表达(放大倍数： 10X20)； 图中，A-自组装多肽处理，细胞无凋亡素蛋白表达；B-荧光染料DAPI显示细胞核； C-未包装的pcDNA3-别-卻质粒处理，细胞无凋亡素蛋白表达；D-荧光染料DAPI显 示细胞核；E-自组装多肽一pcDNA3-/^-a/7〇/?ii/7复合纳米颗粒携带的pcDNA3-/^-a/7〇/?ii/7 质粒能在肾脏透明细胞癌7860细胞内表达；F-荧光染料DAPI显示细胞核； 图6为免疫荧光技术检测凋亡素基因在肾脏透明细胞癌7860细胞株和肾小管近端上 皮细胞HK2细胞株(正常细胞）内表达定位(放大倍数：10X50); 图中，A-自组装多肽一pcDNA3-/^-a/7〇/?ii/7复合纳米颗粒携带的pcDNA3-/i4-a/7〇/7ii/7 质粒在正常内表达，荧光显示凋亡素蛋白；B-荧光染料DAPI显示细胞核；C-A，B重叠拼 合显示正常细胞轮廓及细胞核，在正常细胞内表达出的凋亡素蛋白主要分布于细胞质中； D-自组装多肽一pcDNA3-/^-a/7〇/?ii/7复合纳米颗粒携带的pcDNA3-/^-a/7〇/?ii/7质粒在肿 瘤细胞内表达，突光显示凋亡素蛋白；E-突光染料DAPI显示细胞核；F- D, E重叠拼合显示 正常细胞轮廓及细胞核，在肿瘤细胞内表达出的凋亡素蛋白主要分布于细胞核内； 图7为光镜检测肾脏透明细胞癌7860细胞株和肾小管近端上皮细胞HK2细胞株(正常 细胞）经纳米颗粒处理后增殖状况(放大倍数：10 X 20); 图8为光镜检测肾脏透明细胞癌7860细胞(放大倍数：10 X 40)。
【具体实施方式】
[0014] 下面结合附图对本发明作进一步说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于 本发明教导所作的任何变换，均落入本发明保护范围。
[0015] 本发明所述的自组装多肽一凋亡素（Apoptin)基因复合纳米颗粒是以自组装多肽 作为载体，通过自身的酸性氨基酸和碱性氨基酸所带的电荷与携带凋亡素基因的质粒分子 之间形成离子键结合，质粒分子牢固粘附于自组装多肽表面，形成复合纳米颗粒。该复合纳 米颗粒呈纤维状，长度为100?200nm，直径为10?20nm。
[0016] 本发明所述的自组装多肽的序列如SEQ ID No. 1所示。所述的含有凋亡素基因的 质粒为pcDNA3-/^-a/7〇/7ii/?质粒，其结构如图1所示。
[0017] 本发明所述的自组装多肽一凋亡素基因复合纳米颗粒的制备方法，包括如下步 骤： (1) 根据序列SEQ No. 1，合成自组装多肽； (2) 构建pcDNA3-/^-a/7〇/?ii/7质粒：以pcDNA3为载体，设计、定制合成引 物，以 pcDNA3-a/7〇/?ii/7 为模板，扩增 目的基因片段，构建 pcDNA3-/^-a/7〇/7ii/? 质粒;引物序列如下： 上游引物（下划线为汉3? HI酶切位点）：
【权利要求】
1. 一种自组装多肽一凋亡素基因复合纳米颗粒，其特征在于以所述的自组装多肽作为 载体，通过自身的酸性氨基酸和碱性氨基酸所带的电荷与携带凋亡素基因的质粒分子之间 形成离子键结合，质粒分子牢固粘附于自组装多肽表面，形成复合纳米颗粒。
2. 根据权利要求1所述的自组装多肽一凋亡素基因复合纳米颗粒，其特征在于所述复 合纳米颗粒呈纤维状，长度为100?200nm，直径为10?20nm。
3. 根据权利要求1所述的自组装多肽一凋亡素基因复合纳米颗粒，其特征在于所述自 组装多肽的序列如SEQ ID No. 1所示。
4. 根据权利要求1所述的自组装多肽一凋亡素基因复合纳米颗粒，其特征在于所述的 携带凋亡素基因的质粒为pcDNA3-/^-a/7〇/7ii/?质粒。
5. -种权利要求1?4任一所述的自组装多肽一凋亡素基因复合纳米颗粒的制备方 法，其特征在于包括如下步骤 ： (1) 合成自组装多肽； (2) 构建含凋亡素基因的质粒； (3) 配制自组装多肽溶液； (4) 在多肽溶液中加入步骤（2)构建的质粒溶液，充分作用后得到纳米颗粒悬浊液； (5) 纳米颗粒检测。
6. 根据权利要求5所述的自组装多肽一凋亡素基因复合纳米颗粒的制备方法，其特征 在于步骤（3)所述的自组装多肽溶液的质量浓度为5. 26 mg/mL，配制的具体过程为：超净 工作台内操作，将白色粉末状多肽溶解于无菌PBS缓冲溶液，然后置于冰水浴中，并使用超 声波助溶，超声波功率为4 W/mL，每次工作3 s，停止5 s，助溶总持续时间为20 min。
7. 根据权利要求5所述的自组装多肽一凋亡素基因复合纳米颗粒的制备方法，其特征 在于步骤（4)所述的质粒溶液的质量浓度为2 μ g/μ L，质粒与自组装多肽的质量比为1 : 45 ?1 :55。
8. 根据权利要求5所述的自组装多肽一凋亡素基因复合纳米颗粒的制备方法，其特征 在于步骤（4)所述的充分作用为在向多肽溶液中加入质粒后，盖紧盖子，颠倒混匀，混匀后 盖口和盖子再用封口胶密封，置摇床150 r/min，12h。
9. 根据权利要求5所述的自组装多肽一凋亡素基因复合纳米颗粒的制备方法，其特征 在于步骤（5)所述的纳米颗粒检测的方法为琼脂糖凝胶电泳检测和/或透射电子显微镜检 测。
10. -种权利要求1?4任一所述的自组装多肽一凋亡素基因复合纳米颗粒在抗肿瘤 治疗中的应用。
【文档编号】A61K47/48GK104288776SQ201410303298
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年6月30日 优先权日:2014年6月30日
【发明者】狄勇, 彭传梅 申请人:昆明医科大学