一种分泌表达pedv核心抗原coe蛋白重组乳酸乳球菌及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于动物生物医药工程领域，具体公开了一种分泌表达PEDV核心抗原COE蛋白重组乳酸乳球菌及其制备方法和应用。本发明通过设计多条引物，采用重叠延伸PCR的方法将信号肽等序列连接到PEDV核心抗原COE的基因上，并将其连接到乳酸乳球菌表达载体pNZ8048，电转化入乳酸乳球菌NZ9000细胞内获得重组菌。将重组菌以乳链菌肽诱导获得表达，诱导后的全培养物直接作为口服疫苗能够刺激小鼠并引起较强的细胞免疫应答，该重组乳酸乳球菌可以作为一种具有良好产业前景的新型口服疫苗产品，对减轻PEDV对养猪业的危害起到积极的作用，对促进养猪业健康发展具有重要的实践意义。
【专利说明】-种分泌表达PEDV核心抗原COE蛋白重组乳酸乳球菌及其 制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及动物生物医药工程领域，更具体地，涉及一种分泌表达猪流行性腹泻 病毒核心抗原C0E蛋白重组乳酸乳球菌及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 猪流行性腹泻病毒（Porcine Epidemic Diarrhea, PED)是世界性的猪传染病之 一，1978年在英国首次被报道，随后在包括我国在内的世界多个地区爆发流行，对各国养猪 业造成重大损失。PED在亚洲的爆发引起极高的死亡率，有研究显示日本1993?1994年爆 发PED时，5个猪场仔猪死亡数就超过一万，死亡率在30%?60% ;据报道从2010年2月到 2011年11月，我国爆发PED引起的仔猪死亡数在五万以上，死亡率高达90%?100%。2013 年，美国也首次报道了 PEDV的存在，2014年持续爆发与流行。
[0003] PEDV在被发现后直至今日，不但没有被有效控制，反而成了影响全世界养猪业的 重大病毒，造成巨大的经济损失。目前对于PED的预防主要是接种疫苗，虽然国内PEDV的 灭活苗及弱毒活疫苗得到了广泛的推广和应用，在一定程度上减少了 PED的发病率，但仍 无法完全控制。从目前国内外对PEDV的研究结果及应用效果看，仔猪主要通过初乳获得母 源slgA，产生对冠状病毒性腹泻的被动免疫保护，血清中的循环抗体IgG不能提供保护，也 就是经非肠道免疫不能产生母源免疫。针对PEDV的快速变异和肠道粘膜免疫特点，不断研 制安全的，可口服的新型疫苗来提高疫苗的免疫效果显得尤为重要。
[0004] PEDV的部分保护性抗原基因（C0E基因）编码的部分S糖蛋白具有抗原性，能够诱 导机体产生中和抗体。由于血清抗体的免疫效果不理想，肠道粘膜免疫产生的分泌型抗体 (slgA)是抵抗PEDV感染的有效抗体。因此，选择安全无毒，能够在肠道中存活并能表达和 传递抗原物质的载体系统，有效地刺激粘膜免疫系统产生粘膜免疫应答对本病的防治具有 重要意义。
[0005] 乳酸乳球菌(Laciococci/s 是乳球菌属中最重要和最典型的一个种，在食 品工业中应用广泛，被公认为安全的（generally-regarded-as_safe，GRAS)食品级微生物。 以乳酸乳球菌作为宿主菌表达异源蛋白和酶，逐渐成为食品工业、生物制药和疫苗研究的 执占。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中针对PEDV疫苗免疫效果不佳的缺 陷，提供一种分泌表达PEDV核心抗原C0E蛋白重组乳酸乳球菌的制备方法。
[0007] 本发明的第二个目的是提供上述方法制备得到的分泌表达PEDV核心抗原C0E蛋 白重组乳酸乳球菌。
[0008] 本发明的第三个目的是提供所述重组乳酸菌作为口服疫苗在预防猪流行性腹泻 中的应用。
[0009] 本发明的第四个目的是提供一种预防猪流行性腹泻口服疫苗。
[0010] 本发明的第五个目的是提供上述预防猪流行性腹泻口服疫苗的制备方法。
[0011] 为了实现上述目的，本发明的技术方案为设计多条引物，采用重叠延伸PCR的方 法将信号肽等序列连接到经密码子优化的C0E基因上，以Usp45信号肽实现C0E蛋白的分 泌表达，以增强序列（LEISSTCDA)及其插入位置实现表达量的增加。
[0012] 本发明是通过以下技术方案予以实现的： 提供一种分泌表达猪流行性腹泻病毒核心抗原C0E蛋白重组乳酸乳球菌的制备方法， 其特征在于，包括以下步骤： 51. 人工合成经密码子优化后的C0E基因，设计多条引物，采用重叠延伸PCR的方法将 Usp45信号肽序列连接到C0E基因上； 52. 将S1获得的C0E基因连接至pNZ8048并筛选得到重组质粒pNZ8048-C0E ;采用电 转化法将PNZ8048-C0E重组质粒导入乳酸乳球菌Z. hciisNZgOOO中，获得重组乳酸乳球菌 L. 7acii5NZ9000/pNZ8048-C0E ； S1所述经密码子优化后的COE基因序列如SEQ IDN0:1所示，各引物序列如SEQ ID NO: 2?9所示；所述筛选重组质粒的引物序列如SEQ ID NO :10?11所示。
[0013] 重叠延伸 PCR 技术（gene splicing by overlap extension PCR，简称 S0E PCR) 由于采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成了重叠链，从而在随后的扩增反应中通过 重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来。此技术利用PCR技术能够在体外进 行有效的基因重组，而且不需要内切酶消化和连接酶处理，可利用这一技术很快获得其它 依靠限制性内切酶消化的方法难以得到的产物。在PEDV疫苗的现有技术中，还未发现利用 重叠延伸PCR技术，并通过经优化的目的基因及增强序列等获得乳酸乳球菌的表达体系。 重叠延伸PCR技术成功的关键是重叠互补引物的设计，发明人在重叠延伸PCR的技术原理 上，通过大量的实验研究和条件摸索，获得了上述可用于高效扩增的多条引物。
[0014] 优选地，S1所述重叠延伸PCR的反应程序为：98°C预变性5min ;98°C变性10s， 55°C退火10s，72°C延伸5s，30个循环；72°C后延伸10min。
[0015] 优选地，S2所述电转化法为：取Z. hciis NZ9000感受态细胞，加入pNZ8048-C0E 重组质粒，混匀并转入电转化杯，电击后加入恢复培养基，冰浴后静置培养，平板筛选高拷 贝转化子。
[0016] 乳酸菌表达系统具有以下优点：紧密型表达系统，受控严格，非诱导条件下几乎不 表达；乳酸乳球菌的胞外蛋白酶很少，通过信号肽介导的胞外分泌表达可以一定程度上消 除胞内蛋白酶的降解，增加目标肽的稳定性和产量。
[0017] 作为一种优选方式，上述分泌表达猪流行性腹泻病毒核心抗原C0E蛋白重组乳酸 乳球菌的制备方法包括如下步骤： S1.分泌型重组质粒PNZ8048-C0E的构建 S11.相关基因序列的密码子偏好性优化与合成：将C0E基因、Usp45序列及其它修 饰DNA序列均经过密码子优化，同时选择增强序列的插入位置，设计多条引物Afc〇I-Uspl、 Usp2、Usp3、Usp4、Usp5、Usp6-C0E-F、C0E-F、C0E-His-历ii/III-R，同时还设计了用于重组质 粒的PCR检测和测序的引物pNZ 1及pNZ2，优化合成的Afco I-Usp 1、Usp2、Usp3、Usp4、Usp5、 Usp6-C0E-F、C0E-F、C0E-His-历·fli/III-I^pNZUpNZZ 引物序列分别如 SEQ ID NO :2 ?11 所 示； 512. 无上游修饰的COE基因片段的PCR扩增：以含优化合成的COE基因的质粒为模板 进行PCR扩增； 513. C0E基因完整修饰片段的重叠延伸PCR扩增过程：以S12中回收的PCR产物为模 板，加入高保真 DNA 聚合酶 2XPrime STAR Mix 25yL，引物 AfcoI-Uspl、Usp2、Usp3、Usp4、 Usp5、Usp6-C0E-F、COE-His-历·fli/III-R 各 1 μ L，模板 0· 5 μ L，用 ddH20 补至 50 μ L，PCR 反 应程序为：98°C预变性5min ;98°C变性10s，55°C退火10s，72°C延伸58,30个循环；72°〇后 延伸lOmin ; 514. 重组质粒pNZ8048-C0E的构建：将S13中回收的PCR产物用Afcol、班/--/ΙΙΙ进 行双酶切处理，以同样的方法对ΡΝΖ8048空质粒进行双酶切，通过连接酶将连接产物转化 万.co/i MC1061感受态细胞，检测获取阳性质粒，即为获得了重组质粒pNZ8048-C0E ; S2.含C0E基因的分泌型重组乳酸乳球菌的构建 S21.乳酸乳球菌电转化感受态细胞的制备：将冻存的Z. hcii^NZgOOO乳酸乳球菌 进行复苏，取3〇μ? Z. hciis NZ9000感受态细胞，冰浴上融解，加入1PL pNZ8048-C0E重 组质粒，轻轻混匀；将以上混合物转入冰预冷的电击杯，迅速给予一个单脉冲，参数设置为 2kV，25PF，200 Ω，电击后立即轻柔加入lmL冰预冷的恢复培养基G-M17MC，将菌液全部吸入 一灭菌离心管，盖紧管盖，冰浴5min后30°C静置培养1?1. 5h ;将菌液涂布并挑取单个菌 落筛选鉴定得到阳性重组表达菌命名为A hcii^NZgOOO/pNZSCMS-COE ; 优选地，S11所述增强序列的插入位置为Usp45信号肽之后，目的基因 COE之前，处 于中间，位置关系为：(PnisA :: 5PUsp45 :: LEISSTCDA :: C0E)，其中PnisA为启动子， "LEISSTCDA"为增强序列的氨基酸序列。
[0018] 提供上述方法制备得到的重组质粒PNZ8048-C0E和重组乳酸菌乳球菌 Ζ. 7<^?Υ·5ΝΖ9000/ρΝΖ8048-α)Ε。
[0019] 提供上述重组乳酸乳球菌Z .hciisNZgOOO/pNZSCMS-COE在制备预防猪流行性腹 泻口服疫苗中的应用。
[0020] 提供一种预防猪流行性腹泻口服疫苗的制备方法，包括如下步骤：将重组乳酸乳 球菌Z jaciisNZgOOO/pNZSCMS-COE接种于G-M17C液体培养基，静置培养过夜，取过夜培 养物以一定比例接种于G-M17液体培养基，继续培养至细菌进入对数生长期，加入诱导剂 Nisin至终浓度为1?2 ng/mL，诱导一定时间，诱导后的全培养物直接作为口服疫苗。
[0021] 优选地，所述静置培养的温度为30°C。
[0022] 优选地，所述一定比例接种为将Z jac --Ζ9000/ρΝΖ8048_(：0Ε重组表达菌以 1:100的比例接种于G-M17C液体培养基。
[0023] 优选地，所述对数生长期为所述细菌培养液的0D值为0. 4?0. 6。
[0024] 优选地，所述诱导一定时间为3?6 h。
[0025] 作为一种优选方式，上述预防猪流行性腹泻口服疫苗的制备方法，包括如下步骤： 将Ζ .^^?Υ·5ΝΖ9000/ρΝΖ8048-α)Ε重组表达菌以1:100的比例接种于G-M17C液体培养基， 30°C静置培养过夜；将过夜培养物以1:50的比例接种于10mL G-M17C液体培养基，继续培 养约2. 5h至细菌进入对数生长期（0D_=0. 4?0. 6);分为诱导组和不诱导组，诱导组加入 lyg/mL的诱导剂（Nisin)至终浓度为1或2 ng/mL，诱导3?6 h后终止培养，采用梯度 稀释涂板法测定重组菌的浓度达1012 CFU/mL数量级，诱导后的全培养物可直接作为口服疫 苗。
[0026] 提供上述方法制备得到的预防猪流行性腹泻的口服疫苗。
[0027] 优选地，上述口服疫苗可采用灌胃或饲喂的方式使用。
[0028] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果： 本发明提供了一种分泌表达猪流行性腹泻病毒核心抗原COE蛋白重组乳酸乳球菌的 制备方法。即采用Z. hciisNZgOOO/pNZSCMS乳酸菌表达系统，并添加 Usp45信号肽和增强 序列等来进行PEDV核心抗原基因 C0E基因的分泌表达，诱导物Nisin是由乳酸菌产生的一 类抗生物肽，具有高效、安全、无毒的特性，加上乳酸菌作为益生菌的益生特性，使得此乳酸 菌表达系统成为一个食品级表达系统，可以连同菌体一起服用。
[0029] 将制备得到的乳酸乳球菌用于表达核心抗原C0E蛋白制备针对PED的疫苗，与市 场已有疫苗相比，在肠黏膜IgA抗体产生与维持上有优势，诱导后的全培养物直接作为口 服疫苗能够刺激小鼠并引起较强的细胞免疫应答，该重组乳酸乳球菌可以作为一种具有良 好产业前景的新型口服疫苗产品，对减轻PEDV对养猪业的危害起到积极的作用，对促进养 猪业健康发展具有重要的实践意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0030] 图1为无上游修饰的C0E基因片段的PCR扩增结果；Μ为DL2000 DNA Marker ;1 为无上游修饰的C0E基因片段的PCR扩增； 图2为C0E基因完整修饰片段的重叠延伸PCR扩增结果；Μ为DL2000 DNA Marker ;1 为阴性对照；2为C0E基因完整修饰片段的重叠延伸PCR扩增； 图3为重组大肠杆菌凡co/i MC1061/pNZ8048-C0E的PCR鉴定结果；Μ为DL2000 DNA Marker ;1为阴性对照；2为重组大肠杆菌凡co/i MC1061/pNZ8048-C0E的PCR鉴定； 图4为重组质粒pNZ8048-C0E的双酶切鉴定结果；Ml为DL5000 DNA Marker;M2为 DL2000 DNA Marker ;1为重组质粒pNZ8048-C0E的双酶切鉴定； 图5为重组乳酸乳球菌Z NZ9000/pNZ8048-C0E的PCR鉴定结果；Μ为DL2000 DNA Marker ;1为阴性对照；2为重组乳酸乳球菌NZ9000/pNZ8048-C0E的PCR鉴 定； 图6为重组乳酸乳球菌培养上清中蛋白的免疫印迹结果；1为无诱导剂的重组菌培养 上清的免疫印迹结果；2为终浓度为Ing/mL诱导剂的重组菌培养上清的免疫印迹结果；3 为终浓度为2ng/mL诱导剂的重组菌培养上清的免疫印迹结果； 图7试验小鼠肠道中特异性IgA抗体水平；NS为生理盐水对照组简写；PEDV+TGEV 为商品化的二联弱毒苗组简写；NZ9000-C0E为本试验构建的重组乳酸乳球菌Z. hcik NZ9000/pNZ8048-C0E 口服疫苗组的简写。
【具体实施方式】
[0031] 下面结合说明书附图和具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明 本发明而不用于限制本发明的范围。下例实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照 本领域常规条件或按照制造厂商建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科 学用语与本领域技术人员熟悉的意义相同。
[0032] 实施例1含C0E基因的分泌型重组乳酸乳球菌的构建 S1.分泌型重组质粒pNZ8048-C0E的构建 S11.相关基因序列的密码子偏好性优化与合成：根据目的基因 PEDV C0E基因的序列 和表达载体PNZ8048的特点，以及为达到高效分泌表达的目的而增加的信号肽序列5PUsp45 和增强序列[(氨基酸序列为：LEISSTCDA，插入位置为Usp45信号肽之后，目的基因 COE之 前，处于中间，位置关系为：（PnisA :: 5PUsp45 :: LEISSTCDA :: C0E ])，及为便于检测 添加的His (组氨酸）标签序列，对整个预期的表达序列在专门的网站(http://Renomes. urv. es/OPTIMIZER)上进行乳酸菌表达密码子偏好性优化，将COE基因420bp的密码子 优化序列采用人工合成的方法送公司进行合成。采用重叠延伸PCR的方法进行信号肽和 增强序列的连接，设计多条引物 Afcol-Uspl、Usp2、Usp3、Usp4、Usp5、Usp6-C0E-F、C0E-F、 COE-His-班/^III-R，其中COE-F为从COE基因第一位开始的部分DNA序列，是为了方便重 叠延伸PCR进行修饰而设计的；COE-His-班为含有6XHis标签和班/--/ΙΠ 酶切位 点的下游引物，在历>/111的5'端加上3个保护碱基CCC，3'端加上反向互补的终止密码 子CTA，再接6XHis标签序列;Afcol-Uspl为含有与pNZ8048融合表达的酶切位点Afcol和 信号肽Usp45的5'端最初一段序列的上游引物，Afcol为含有起始密码子ATG的融合表达 酶切位点，在其5'端加上4个保护碱基CATG，3'端加上两个调整读码框的碱基AA ;Usp2~5 为信号肽中间段的重叠延伸拼接引物；Usp6-C0E-F为信号肽末段与COE基因起始段拼接处 的引物。同时还设计了用于重组质粒的PCR检测和测序的引物pNZ 1及pNZ2，是以pNZ8048 空质粒的MCS上游和下游70?90bp左右的区域为依据设计的。优化合成的C0E基因序列 如 SEQ ID N0 :1 所示；优化合成的 AfcoI-Uspl、Usp2、Usp3、Usp4、Usp5、Usp6-C0E-F、C0E-F、 COE-His-历·/7?/III-R、pNZl、pNZ2引物序列分别如SEQIDNO:2?ll所示。
[0033] S12.无上游修饰的C0E基因片段的PCR扩增：以含优化合成的C0E基因的质粒为 模板，加入高保真0嫩聚合酶？1^11165了41?1&--代111丨1(2\)25 4 1^，1(^]\1的引物〇^-卩、 COE-His-历各 1 μ L，模板 0· 5 μ L，用 ddH20 补至 50 μ L，PCR 反应程序为：98°C预变 性511^11;981：变性1〇8,551：退火1〇8,721：延伸58,30个循环；721：后延伸1〇1^11。？0?反 应完成，将产物进行1. 5%琼脂糖凝胶观察与回收，可见大小约450bp的扩增条带，与预期结 果一致(如图1)，回收的产物将作为重叠延伸PCR的模板用于获得添加了信号肽等修饰序 列的完整片段。
[0034] S13. C0E基因完整修饰片段的重叠延伸PCR扩增过程：以S12中回收的PCR产 物为模板，加入高保真DNA聚合酶PrimeSTAR Max Premix (2X) 25以1^，1(^]?的引物 价〇1州8?1、化？2川8?3、化？4川8?5、化？6-〇^-卩、〇^-把8-班/^111-1?各1以1^，模板0.5 4 1^， 用ddH20补至50 μ L，PCR反应程序为：98°C预变性5min ;98°C变性10s，55°C退火10s，72°C 延伸5s，30个循环；72°C后延伸10min。PCR反应完成，将产物进行1. 5%琼脂糖凝胶观察与 回收，可见大小约580bp的扩增条带，与预期结果一致(如图2)。
[0035] S14.重组质粒pNZ8048-C0E的构建：将S13中回收的PCR产物用Afcol、历 进行双酶切处理，胶回收大小约570bp的条带；以同样的方法对pNZ8048空质粒进行双酶 切，胶回收大小约3300bp的条带。分别取4μ L双酶切后胶回收的C0E基因完整修饰片段 和lyL双酶切后胶回收的ρΝΖ8048空质粒，加入5yL的DNA Ligation Kit高效连接酶 Solution I，混匀后置于4°C条件下连接过夜，将连接产物转化凡MC1061感受态细胞， 在含有10 μ g/mL氯霉素（Chloramphenicol, Cm)的LB琼脂培养板中，37°C培养两天，然 后挑取单个菌落，分别接种于含有10 μ g/mL Cm的LB液体培养基中，37°C 220rpm振摇培 养3h以上，取菌液进行PCR鉴定。PCR鉴定以待检菌液为模板，加入DNA聚合酶2XEsTaq MasterMix 10yL，引物 ρΝΖ1、ρΝΖ2 各 0.5yL，模板 0.5yL，用 ddH20 补至 20yL，PCR 反应 程序为：941：预变性51^11;941：变性3〇8,551：退火3〇8,721：延伸458,30个循环 ；72 1：后 延伸lOmin。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，可见大小约730bp的扩增条带，与预 期结果一致(如图3)。对检测阳性的菌液用质粒DNA抽提试剂盒进行质粒抽提，并进行双酶 切鉴定和序列测定，双酶切后电泳出现约570bp和3300bp两条目的条带，并且测序鉴定结 果与预期一致(如图4)，即为获得了重组质粒pNZ8048-C0E。
[0036] S2.含C0E基因的分泌型重组乳酸乳球菌的构建 S21.乳酸乳球菌电转化感受态细胞的制备：将冻存的Z. hciis NZ9000乳酸乳球菌 划G-SGM17板复苏，挑取单个菌落在G-SGM17液体培养基中30°C培养过夜，以1:100的比例 接入50 mL新的G-SGM17液体培养基30°C培养，监测0D6QQ至0. 2?0. 3,迅速置冰上冷却， 4°C 6000Xg离心20 min，弃上清；用50 mL预冷的0. 5M蔗糖、10%甘油溶液重悬菌体，4°C 6000Xg离心20 min，弃上清；用25 mL预冷的0. 5M蔗糖、10%甘油、50mM EDTA溶液重悬菌 体，4°C 6000Xg离心15 min，弃上清；再用15 mL预冷的0. 5M蔗糖、10%甘油溶液重悬菌 体，4°C 6000Xg离心15 min，弃上清；最后用500 μ?预冷的0. 5M蔗糖、10%甘油溶液重悬 菌体，即为乳酸乳球菌感受态细胞，40 μ?每管分装，-80°C保存备用。
[0037] S22.乳酸乳球菌的电击转化及转化子的PCR鉴定：取3〇μ? Z. hciis NZ9000感 受态细胞，冰浴上融解，加入1KL PNZ8048-C0E重组质粒，轻轻混匀；将以上混合物转入冰 预冷的2mm电激杯，迅速给予一个单脉冲，参数设置为2kV，25PF，200 Ω，电击后立即轻柔加 入lmL冰预冷的恢复培养基G-M17MC，将菌液全部吸入一灭菌离心管，盖紧管盖，冰浴5min 后30°C静置培养1?1. 5h ;将菌液分为10μ?、100μ?、900μ?均匀涂布于G-M17C平板，30°C 静置培养1?2天。挑取单个菌落，分别接种于G-M17C液体培养基中，30°C静置培养5h 以上，取菌液进行PCR鉴定，具体操作过程如S14所述，只是模板换成待检重组乳酸乳球菌 菌液，PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，可见约730bp的扩增条带，阳性重组表达菌 命名为 Ζ·^^?Υ·5ΝΖ9000/ρΝΖ8048-〇)Ε (如图 5)。
[0038] S3.含C0E基因的分泌型重组乳酸乳球菌体外诱导表达过程：将Z jaciisNZgOOO/ PNZ8048-C0E重组表达菌以1:100的比例接种于G-M17C液体培养基，30°C静置培养过夜； 将过夜培养物以1:50的比例接种于10mL G-M17C液体培养基，继续培养约2. 5h至细菌进 入对数生长期（0D_=0. 4?0. 6);分为诱导组和不诱导组，诱导组加入1 μ g/mL的诱导剂 (Nisin)至终浓度为1或2 ng/mL，诱导3 h后终止培养，4°C lOOOOrpm离心5min，收集培 养上清，经SDS-PAGE电泳并进行Western Blot分析，结果显示，与未诱导组相比，诱导组培 养上清中检测到17. 38KDa的目的条带(如图6)，表明目的基因已经得到分泌表达且具有免 疫活性。
[0039] 对比例1含C0E基因的分泌型重组乳酸乳球菌的构建 以实施例1所述方法构建含C0E基因的分泌型重组乳酸乳球菌，唯一不同的是所用的 C0E基因为未经密码子优化的C0E基因片段。
[0040] 不同的物种有其偏好性的密码子，本试验根据前人的研究结果，选取了 z. lactis MG1363来源的NZ9000表达菌，并研究了经密码子优化和未经密码子优化的COE基因所构 建的乳酸乳球菌表达C0E蛋白的效率，经检测发现，未经密码子优化的C0E基因所构建的乳 酸乳球菌表达的C0E蛋白表达量低于0. 001ug/mL，而优化过的目的基因 C0E在乳酸乳球菌 NZ9000中获得表达，表达产物占菌体总蛋白的2. 19%。浓度达到0. 62 ug/mL。
[0041] 实施例2乳酸乳球菌在制备PEDV疫苗中的应用 将实施例1制备得到的A hcii^NZgOOO/pNZSCMS-COE重组乳酸乳球菌制成一种预防 猪流行性腹泻的口服疫苗，并研究该疫苗的免疫效果，包括如下步骤： 31.Ζ.^^?Υ·5ΝΖ9000/ρΝΖ8048-α)Ε重组乳酸乳球菌口服疫苗的制备：将 Z. hcii^NZgOOO/pNZSCMS-COE重组表达菌以1:100的比例接种于G-M17C液体培养基，30°C 静置培养过夜，将过夜培养物以1:50的比例接种于10mL G-M17液体培养基，继续培养约 2. 5h至细菌进入对数生长期，加入1 μ g/mL的诱导剂（Nisin)至终浓度为2 ng/mL，诱导6 h后终止培养，此时的全培养物直接作为口服疫苗使用，采用梯度稀释涂板法测定重组菌的 浓度达1〇12 CFU/mL数量级。
[0042] S2.Z jacii^NZgOOO/pNZSCMS-COE重组乳酸乳球菌作为口服疫苗的使用方法：为 初步研究重组菌的免疫效果，将84只6周龄的雌性BALB/c小鼠随机分为3组饲养，每组28 只，第1组为生理盐水对照，第2组免疫重组乳酸菌全培养物悬液（即口服疫苗)，第3组免 疫TGEV/PEDV二联弱毒苗。预饲一周后，采用灌胃的方式分别于第1天、第14天进行口服免 疫，每次连续免疫两天，剂量为160 μ L/只。分别于免疫前及初次免疫后第7、14、21、28、35、 42、49、56天进行样品采集，每次每组采集3只小鼠，包括外周血血清和肠道样品，并且在首 次免疫后第21d、第35d还分别采集了外周抗凝血，分离了脾脏细胞，用于不同指标的检测。
[0043] 以C0E蛋白作为ELISA包被抗原，检测发现，重组乳酸菌组试验小鼠肠道中特 异性IgA抗体水平在第56天达到峰值，高于另外两组，如图7,显示Ζ. /<3----Ζ9000/ PNZ8048-C0E重组菌可以作为诱导肠道局部粘膜免疫的候选疫苗。第35d的外周血⑶8+ Τ 细胞比例显著高于NS组，高于TGEV/PEDV二联弱毒苗组，脾细胞C0E刺激下T淋巴细胞中 ⑶8+细胞比例也最高；第21d脾细胞C0E蛋白刺激培养上清中的IFNY浓度显著高于NS 组，高于TGEV/PEDV二联弱毒苗组；第35d的IFN γ、IL-6浓度显著高于NS组，高于TGEV/ PEDV二联弱毒苗组，显示Ζ .^^?Υ·5ΝΖ9000/ρΝΖ8048-α)Ε重组菌对于提高机体的细胞免疫 应答也有一定的作用。这些结果初步证实该重组乳酸菌具有作为口服疫苗的潜力，为开发 新型口服疫苗预防PED提供了一定的理论基础。 SEQUENCE LISTING 〈110>华南农业大学 〈120> -种分泌表达PEDV核心抗原COE蛋白重组乳酸乳球菌及其制备方法和应用 <130> <160> 11 <170> Patentln version 3.3 <210> 1 <211> 420 <212> DNA 〈213>优化合成的C0E基因序列 <400> 1 gttactcttc catcatttaa tgatcattca tttgttaata ttactgtttc agctgctttt 60 ggtggtcatt caggtgctaa tcttattgct tcagatacta ctattaatgg tttttcatca 120 ttttgtgttg atactcgtca atttactatt actctttttt ataatgttac taattcatat 180 ggttatgttt caaaatcaca agattcaaat tgtccattta ctcttcaatc agttaatgat 240 tatctttcat tttcaaaatt ttgtgtttca acttcacttc ttgctggtgc ttgtactatt 300 gatctttttg gttatccaga atttggttca ggtgttaaat ttacttcact ttattttcaa 360 tttactaaag gtgaacttat tactggtact ccaaaaccac ttcaaggtgt tactgatgtt 420 〈210〉 2 〈211〉 42 〈212〉 DNA 〈213〉引物 Ncol-Uspl 序列 〈400> 2 catgccatgg aaaagaagaa aattatttca gctattctta tg 42 〈210〉 3 〈211〉 41 〈212〉 DNA 〈213〉引物Usp2序列 〈400〉 3 agctgaaaga ataacagttg acataagaat agctgaaata a 41 〈210〉 4 〈211〉 41 〈212〉 DNA 〈213〉引物Usp3序列 〈400〉 4 caactgttat tctttcagct gctgctccac tttcaggtgt t 41 〈210〉 5 〈211〉 44 〈212〉 DNA 〈213〉引物Usp4序列 〈400〉 5 atctgaatta gtatcagcat aaacacctga aagtggagca gcag 44 〈210〉 6 〈211〉 43 〈212〉 DNA 〈213〉引物Usp5序列 〈400〉 6 atgctgatac taattcagat cttgaaattt catcaacttg tga 43 <210> 7 <211> 44 <212> DNA 〈213> 引物 Usp6-C0E-F 序列 <400> 7 ttaaatgatg gaagagtaac agcatcacaa gttgatgaaa tttc 44 〈210〉 8 〈211〉 35 〈212〉 DNA 〈213〉引物COE-F序列 〈400〉 8 gttactcttc catcatttaa tgatcattca tttgt 35 〈210〉 9 〈211〉 44 〈212〉 DNA 〈213〉引物 COE-His-HindIII-R 序列 〈400〉 9 cccaagcttc tagtggtggt ggtggtggtg aacgtccgtg acac 44 〈210〉 10 〈211〉 25 〈212〉 DNA 〈213〉引物pNZl序列 〈400〉 10 taaacggctc tgattaaatt ctgaa 25 〈210〉 11 〈211〉 22 <212> DNA 〈213> 引物pNZ2序列 <400> 11 gtgctgtaat ttgtttaatt gc 22
【权利要求】
1. 一种分泌表达猪流行性腹泻病毒核心抗原COE蛋白重组乳酸乳球菌的制备方法，其 特征在于，包括以下步骤：
51. 人工合成经密码子优化后的C0E基因，设计多条引物，采用重叠延伸PCR的方法将 Usp45信号肽序列连接到C0E基因上；
52. 将S1获得的C0E基因连接至pNZ8048并筛选得到重组质粒pNZ8048-C0E ;采用电 转化法将PNZ8048-C0E重组质粒导入乳酸乳球菌Z. hciisNZgOOO中，获得重组乳酸乳球菌 L. 7acii5NZ9000/pNZ8048-C0E ； S1所述经密码子优化后的COE基因序列如SEQ IDN0:1所示，各引物序列如SEQ ID NO: 2?9所示；所述筛选重组质粒的引物序列如SEQ ID NO :10?11所示。
2. 根据权利要求1所述重组乳酸乳球菌的制备方法，其特征在于，S1所述重叠延伸 ?〇?的反应程序为：981：预变性51^11;981：变性1〇8,551：退火1〇8,721：延伸58,30个循环 ； 72°C后延伸 lOmin。
3. 根据权利要求1所述重组乳酸乳球菌的制备方法，其特征在于，S2所述电转化法为： 取Z. hciis NZ9000感受态细胞，加入pNZ8048-C0E重组质粒，混匀并转入电转化杯，电击 后加入恢复培养基，冰浴后静置培养，平板筛选高拷贝转化子。
4. 权利要求1至3任一项所述方法制备得到的重组质粒pNZ8048-C0E和重组乳酸菌乳 球菌 Z jac --·5ΝΖ9000/ρΝΖ8048-〇)Ε。
5. 权利要求4所述重组乳酸乳球菌Z. hcii^NZgOOO/pNZSCMS-COE在制备预防猪流行 性腹泻口服疫苗中的应用。
6. -种预防猪流行性腹泻口服疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将重组 乳酸乳球菌Z .hciisNZgOOO/pNZSCMS-COE接种于G-M17C液体培养基，静置培养过夜，取过 夜培养物以一定比例接种于G-M17液体培养基，继续培养至细菌进入对数生长期，加入诱 导剂Nisin至终浓度为1?2 ng/mL，诱导一定时间，诱导后的全培养物直接作为口服疫苗。
7. 权利要求6所述方法制备得到的预防猪流行性腹泻的口服疫苗。
【文档编号】A61P31/14GK104120142SQ201410303777
【公开日】2014年10月29日 申请日期:2014年6月30日 优先权日:2014年6月30日
【发明者】马静云, 李智丽, 曾喜多, 魏钟艳, 孙宝丽, 谢青梅, 毕英佐 申请人:华南农业大学