具有抗肿瘤活性的PD-L1 IgV亲和肽及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于生物制药【技术领域】，具体涉及一种具有抗肿瘤活性的靶向PD-L1?IgV的亲和肽产品及其制备和应用。该亲和肽特异性结合于PD-L1?IgV区，其氨基酸序列为ANGSRLV，分子量为715.4。该亲和肽可通过Fomc固相多肽合成法人工合成制备，可在制备抗结肠癌（CT26）药物中作为主要活性成分发挥作用。本发明通过利用噬菌体展示肽库筛选技术，以PD-L1?IgV为靶点进行高通量的筛选，人工合成了具有抗肿瘤活性的亲和肽。发明人进一步证明了本发明所提供的亲和肽具有较好的抗肿瘤活性，能明显抑制小鼠体内肿瘤的增长，从而为基于PD-L1的药物研究和开发提供新的思路和理论基础。
【专利说明】具有抗肿瘤活性的PD-L1 I gV亲和肽及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物制药【技术领域】，具体涉及一种具有抗肿瘤活性多肽产品的筛选、 制备及应用，更具体的，本发明涉及一种具有抗肿瘤活性的靶向ro-Li igv的亲和肽产品及 其制备和应用。
【背景技术】
[0002] 近年来，肿瘤的防控形势非常严峻。随着临床诊断、手术治疗、化疗和放疗等水平 的提高，使得一部分病人能够得到早发现、早治疗，并且获得较好的预后，但是，寻找新的治 疗手段和治疗药物一直是全球范围内的研究热点。与传统的治疗方法相比，肿瘤免疫治疗 能够激活或者诱导肿瘤患者建立起对肿瘤抗原的特异性免疫应答，清除原发的肿瘤细胞， 并且建立免疫记忆，阻止肿瘤的复发和转移。
[0003] 在肿瘤免疫治疗过程中，负性共刺激分子主要介导免疫耐受和逃逸，而前人在肿 瘤免疫治疗过程中遇到的最大挑战就是由于肿瘤免疫耐受和逃逸所导致的疗效不佳。因 此，探讨通过抑制负性共刺激分子所介导的信号通路以打破机体已经建立的对肿瘤细胞的 免疫耐受具有重要的理论意义和应用价值。
[0004] T细胞的激活需两个来自细胞外的信号刺激，即淋巴细胞活化的双信号作用。细胞 活化的第一信号主要来自细胞抗原识别受体（TCR )与MHC分子抗原肽复合物的特异性结 合，此过程为抗原识别。细胞活化的第二信号又称共刺激信号，是由抗原递呈细胞（APC)和 细胞表面的粘附分子对提供。这些粘附分子被称为共刺激分子，是一类细胞膜表面分子，可 为T、B细胞的活化提供辅助信号，从而调节细胞的增殖、活化及分化。根据产生的效应不 同，可将共刺激分子分为正性共刺激分子和负性共刺激分子。正性共刺激分子包括CD28、 IC0S、4-1BB等分子，而负性共刺激分子则包括CTLA-4、PD-1、--Μ-3等分子。
[0005] Η)-1 /PD-L1作为B7/⑶28家族成员，已被证实通过抑制T细胞的活化和增殖来 负调控免疫应答，并在调节免疫耐受、肿瘤免疫逃逸中发挥重要作用。因而利用H)-L1的阻 断剂作为肿瘤免疫治疗药物或佐剂具有很好的应用前景和安全性，而现有技术中，尚缺少 较好的ro-Li的阻断剂产品。
【发明内容】
[0006] 本发明目的在于提供一种具有较好抗肿瘤活性的靶向ro-Ll IgV的亲和肽产品， 可以特异性利用ro-Li蛋白IgV区（PD-L1 IgV)作为结合靶点，从而最终阻断ro-1 /PD-L1 的活化，解除对T细胞的活化和增殖的抑制作用，从而发挥抗肿瘤作用。
[0007] 具体而言，本发明采用的技术方案如下： 一种具有抗肿瘤活性靶向ro-Ll Igv亲和肽，特异性结合于ro-Ll Igv区，其氨基酸序 列为：Ala-Asn-Gly-Ser-Arg-Leu-Val,即 A-N-G-S-R-L-V，分子量为 715. 4。
[0008] 所述具有抗肿瘤活性靶向H)-L1 IgV亲和肽，添加药学上可接受的载体或/和添 加剂后，在制备抗结肠癌（CT26)药物中作为主要活性成分发挥作用。
[0009] 所述具有抗肿瘤活性靶向ro-Ll IgV亲和肽，通过Fomc固相多肽合成法人工合成 制备。
[0010] 在对靶点进行高通量筛选亲和肽过程中，发明人采用了库容量大、操作简便的噬 菌体展示肽库技术进行了筛选。噬菌体展示肽库技术是将外源蛋白或多肽序列插入在M13 喔囷体衣壳蛋白P III的N末端，通过蛋白的融合表达将插入的随机多肤序列展不在喔囷体 表面。由于展示多肽位于P III的N末端，这些小肽通常能够保持较为独立的空间结构，从而 能够模拟配体与特异性受体靶标相互作用。
[0011] 本发明通过利用噬菌体展示肽库筛选技术，以ro-Ll IgV为靶点进行高通量的筛 选，人工合成了具有抗肿瘤活性的亲和肽。发明人进一步通过小鼠体内荷瘤实验，证明了本 发明所提供的靶向ro-Li igv亲和肽具有较好的抗肿瘤活性，能明显抑制小鼠体内肿瘤的 增长，从而为基于ro-Li的药物研究和开发提供新的思路和理论基础。
【专利附图】
【附图说明】
[0012] 图1是ELISA鉴定亲和肽噬菌体单克隆与ro-Ll的亲和力结果图； 图2是亲和肽的质谱鉴定图； 图3是亲和肽对荷CT26结肠癌小鼠体重变化的影响结果图； 图4是亲和肽对荷CT26结肠癌小鼠瘤体积变化的影响结果图； 图5是亲和肽对荷CT26结肠癌小鼠移植瘤的瘤重图。
【具体实施方式】
[0013] 下面结合实施例对本发明做进一步的解释说明。
[0014] 实施例1 本发明所提供的具有抗肿瘤活性靶向ro-Li igv亲和肽，特异性结合 于ro-Li igv区，是利用噬菌体展示肽库技术筛选得到的，其氨基酸序列为： Ala-Asn-Gly-Ser-Arg-Leu-Val,即 A-N-G-S-R-L-V，分子量为 715. 4。
[0015] 由于单抗药物的成本高昂，且不能大规模生产，因此，我们选用由原核表达纯化的 PD-L1 IgV区蛋白作为靶点，通过噬菌体展示技术来筛选得到能与ro-Ll IgV特异性结合的 多肽，用以阻断ro-1/PD-Ll信号通路。为便于本领域技术人员实施本发明，对其筛选过程 简要说明如下： 筛选过程中所用培养基和主要溶液的配制说明如下： LB液体培养基：称取胰蛋白胨10 g，酵母粉5 g，氯化钠5 g，加超纯水定容至1 L， 121 °C高压蒸汽灭菌20 min，冷却后室温贮存备用。
[0016] LB固体培养基：1 L LB液体培养基中加入15 g琼脂粉，加热使琼脂粉充分溶解， 搅拌均匀并分装为1〇〇 mL/瓶，121°C灭菌20 min，冷却至室温后贮存备用。
[0017] LB/IPTG/Xgal平板：将100 mL LB固体培养基用微波炉加热溶解，冷却至60°C左 右时，加入75 μ L IPTG/Xgal，小心混匀，避免产生气泡，倾倒入六孔板。平板于4°C冰箱避 光贮存备用。IPTG/Xgal按以下配方制备：称取0.5 g IPTG和0.2g Xgal溶于5 mL DMF (N，N-二甲基甲酰胺）中，混匀后分装为300 μ L小份，于-20°C避光贮存。
[0018] 上层琼脂：称取胰蛋白胨10 g，酵母粉5 g，氯化钠5 g，MgCl2 · 6H20 1 g，琼脂糖 7 g，加超纯水定容至1L，微波炉煮沸3次，使琼脂糖充分溶解，冷却至60°C左右，分装成60 mL的小份，121°C高压蒸汽灭菌20 min，冷却后室温存放备用。
[0019] LB-Tet (四环素）平板：微波炉加热溶解100mL LB固体培养基，冷却至60°C左右 时，加入100 μ L Tet贮液，混匀后倾倒六平板，待冷却凝固后4°C避光贮存，一周内使用完。 四环素（Tet)贮液按以下配方制备：称取200 mg盐酸四环素，溶于10 mL的无水乙醇中，分 装为300 μ L小份，于-20°C避光贮存。
[0020] 包被液-0· 1 M NaHC03缓冲液（pH 8. 6):称取NaHC03 0· 84g用80mL三蒸水溶解 后用似0!1调？!1至8.6，定容至10〇1^，1211：高压蒸汽灭菌2〇1^11，冷却后41：存放备用。
[0021] 封闭液-0· 1M NaHC03 (pH8. 6)、5 mg/mL BSA :称取 NaHC03 0· 84 g、BSA 0· 5 g 用 80mL三蒸水溶解后用NaOH调pH至8. 6,定容至100mL，过滤除菌，分装为5 mL小份，4°C贮 存备用。
[0022] 洗脱液-0· 2 Μ 甘氨酸-HC1 缓冲液（pH 2. 2)、1 mg/mL BSA :量取 50mL (λ 2M 甘氨 酸溶液和44 mL 0. 2Μ HC1溶液，加入200 mg BSA，加水定容至200 mL，过滤除菌，4°C备用。
[0023] 中和液-1M Tris-HCl缓冲液（pH 9. 1):称取12. 114 g Tris碱，适量超纯水溶解， HC1调pH至9. 1，定容、过滤除菌，分装备用。
[0024] TBS缓冲液-50 mM Tris-HCL(PH7. 5)、150mM NaCl :按以下步骤制备，第一步先称 取6. 055 g Trisbase，用少量双蒸水（30(T500ml)溶解，再用浓HC1将pH调至7. 5，最后加 双蒸水至1000 ml，此步骤制备得Tris缓冲液（50 mM，PH7. 5);第二步称取NaCl 8. 766g， 先以少量双蒸水溶解NaCl，再加入第一步所制备的Tris缓冲液（50 mM，pH7. 5)100ml，最后 加双蒸水至l〇〇〇ml，充分摇匀，高压灭菌即得。
[0025] 洗涤液（TBST) :0· 1% (v/v) Tween-20 TBS，TBS 即前述 TBS 缓冲液。
[0026] PEG/NaCl :称取 PEG-8000 20 g，NaCl 14. 61 g，加超纯水定容至 100 mL，121°C 高 压蒸汽灭菌30 min，冷却至室温，4°C贮存备用。
[0027] TMB储存液：称取10 mg TMB溶于1 mL DMS0,4°C避光保存备用。
[0028] TMB底物缓冲液-磷酸-柠檬酸缓冲液（pH 5. 0):按以下步骤制备：首先制备0. 1 M/L柠檬酸液，即称取柠檬酸（C6H807 *H20)19. 2g，加水至1000 mL，为甲液；然后制备0. 2 M/L磷酸氢二钠液体，即称取磷酸氢二钠（Na2HP04)71. 7 g，加水至1000 mL，为乙液；最后取 甲液24. 3 mL，乙液25. 7 mL，加水定容至100 mL，即为TMB底物缓冲液-磷酸-柠檬酸缓冲 液（pH 5.0)。
[0029] TMB底物显色液：取100 μ L TMB贮存液于溶于上述10 mL TMB底物缓冲液-磷 酸-柠檬酸缓冲液（pH 5.0)中，再加入体积分数为30% H202 10 μ L，混匀即可，需要注意的 是ΤΜΒ底物显色液需现配现用。
[0030] 终止液：为浓度为2 M/L的硫酸液。
[0031] 筛选步骤： (1) 包被：将原核表达并纯化的ro-Li蛋白的Igv区，经过尿素浓度梯度复性后得到目 的蛋白ro-LlIgV(溶于0· 1M pH 8. 6的NaHC03溶液)。用目的蛋白包被96孔板，15 μ g/ 孔（150μ?，100μ g/mL)，密闭湿盒4°C孵育过夜； (2) 封闭：弃去包被液，用枪头吸出剩余残液并迅速加满封闭液，密闭湿盒4°C孵育3 h ； (3) 洗涤：TBST洗涤6次，每次不少于2 min，注意无菌操作，动作要快以免微孔板干 燥； (4) 结合：快速加入预先用TBST稀释至滴度为2X1011的文库的噬菌体100 μ L/孔，室 温温和摇动lh ;在这个过程中，与靶蛋白具有亲和力的噬菌体会结合在蛋白上； (5) 洗涤：TBST洗涤10次，洗去未结合的噬菌体； (6) 洗脱：每孔加入100 μ L洗脱液，室温温和摇动20min ; (7) 中和：用移液枪小心吸出洗脱的噬菌体，转移至预先已加好15 μ L中和液的灭菌 离心管中，温和吹打混匀； (8) 扩增：把第一轮筛选得到的噬菌体与大肠杆菌ER2738加入LB液体培养基（Tet+) 中共同培养，进行扩增和纯化，得到次级肽库； (9) 滴度测定：分别对各轮筛选得到的噬菌体以及扩增后的次级肽库在LB/IPTG/Xgal 平板上进行噬菌体滴度测定，并进行回收率计算，噬菌体回收率=[洗脱噬菌体数/投入噬 菌体数]X 100% ; (10) 重复筛选：将扩增得到的噬菌体投入下一轮筛选，重复上述筛选过程。经5轮亲 和筛选，即可使得含目的多肽的噬菌体得到高度富集； (11) 测序：挑取第五轮筛选后的滴度测定平板上的噬菌斑进行扩增，取200 μ L新鲜 扩增的噬菌体贮存液送往金唯智测序公司进行全自动测序，测序引物为-96 gill测序引物： 5' -CCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3'。
[0032] 多肽序列分析：根据DNA测序结果推导其所编码的氨基酸序列，得到拮抗肽的氨 基酸序列。
[0033] 筛选结果： (1)分别对各轮筛选得到的噬菌体洗脱液进行滴度测定，并计算投入噬菌体回收率，结 果见下表。
【权利要求】
1. 一种具有抗肿瘤活性靶向ro-Li Igv亲和肽，其特征在于，该亲和肽特异性结合于 FO-Ll IgV 区，其氛基酸序列为：Ala-Asn-Gly-Ser-Arg-Leu-Val,即 A-N-G-S-R-L-V，分子 量为715. 4。
2. 权利要求1所述具有抗肿瘤活性靶向H)-L1 IgV亲和肽在制备抗结肠癌药物的应 用。
3. 权利要求1所述具有抗肿瘤活性靶向ro-Ll IgV亲和肽的制备方法，其特征在于，通 过Fomc固相多肽合成法制备。
【文档编号】A61K38/08GK104098651SQ201410303775
【公开日】2014年10月15日 申请日期:2014年6月30日 优先权日:2014年6月30日
【发明者】高艳锋, 刘蓓媛, 祁元明, 李国栋, 李雯雯, 陈鲤翔, 赵园园, 周秀曼 申请人:郑州大学