一种具有降糖功效的苦藤药物组合物及其制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种苦藤药物组合物及其制备方法，按质量百分比由以下原材料组成：灵芝含量5-30％，苦藤含量70-95％。将灵芝菌种在无菌条件下接入液体种子培养基培养，得到灵芝液体种子，同时将新鲜苦藤茎部烘干粉碎，并装于多个发酵瓶中高压灭菌，得到苦藤药性基质，将灵芝液体种子接种于瓶中的苦藤药性基质中，放在恒温发酵室培养，使菌丝长满全瓶，在长满菌丝后继续培养，得到最终的苦藤药物组合物。本发明的有益效果是证实了一种具有降糖效果的苦藤总二萜化合物(Rumphioside?Ac-D与Borapetoside?B)，在含量高的情况下仍很好的控制了苦藤的毒性的。
【专利说明】一种具有降糖功效的苦藤药物组合物及其制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于苦藤药物制作方法【技术领域】，涉及一种具有降糖效苦藤药物组合物 (Rumphioside Ac_D)与 Borapetoside B)及其制作方法。
【背景技术】
[0002] 皱波叶青牛胆（苦藤）學名：Tinospora crispa(L. )Miers科属：防己科 Menispermaceae.青牛膽屬Tinospora.別名：瘤莖藤、綠包藤、綠藤、小賴藤、發冷藤、千里 找根、金雞納藤、隔夜找娘、莖瘤藤。原產地：印度、斯里兰卡、缅甸、東南亞等地。
[0003] 近年来发现其对2型糖尿病具有显著性效果，但同时也表现一定程度的肝毒副作 用。如何降低苦藤的毒性已成为我们关注的焦点。目前常用除去毒性最强的根皮部分、控 制煎煮时间；中药不同配伍或复方联合联用等方法降低苦藤的毒性。通过活性单体生物转 化技术对苦藤进行解毒也取得了一定进展。虽然这些方法可以达到解毒的效果，但并不能 从根本上解决苦藤的毒性问题。
[0004] 至今，国内外学者已经从苦藤中分离出了二萜、三萜、生物碱和苷类等多种化合 物，苦藤中主要的降糖活性成分为二萜类化合物和生物碱类化合物。苦藤的毒性来源于其 复杂的化学成分及生理活性成分，毒副反应也主要来自于二萜类化合物，其次是生物碱，主 要损害肝脏。目前没有一种有效的苦藤药物制备方法能够很好地在控制苦藤毒性的情况下 保证最大量的有效成分（Rumphioside Ac_D与Borapetoside B)总二廠。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在提供一种苦藤药物组合物（Rumphioside Ac_D)与Borapetoside B)，解决了现有的苦藤药物组合物不能很好地在控制苦藤毒性的情况下尽可能多的含有总 二廠 （Rumphioside Ac_D 与 Borapetoside B)的含量。
[0006] 本发明的另一个目的是提供苦藤药物组合物的制作方法。
[0007] 本发明所采用的技术方案是赤芝发酵生产工艺，包括培养基和培养的条件。按质 量百分比由以下原材料组成：灵芝含量5-30 %，苦藤含量70-95 %。
[0008] 进一步，灵芝含量30%，苦藤含量70%。
[0009] 进一步，所述苦藤药物组合物或其提取物为有效药用成分（-Rumphioside Ac-D_) 与Borapetoside B，单独或与药学中可以接受的辅助成分共同组成具有降血糖和减肥功效 的药物。
[0010] 进一步，所述苦藤药物组合物或其提取物为活性成分，单独或与食品中可以接受 的其它成分共同组成具有降血糖和减肥功效的功能食品。
[0011] 一种苦藤药物组合物的制备方法，将灵芝菌种在无菌条件下接入液体种子培养基 培养，得到灵芝液体种子，同时将新鲜苦藤茎部烘干粉碎，并装于多个发酵瓶中高压灭菌， 得到苦藤药性基质，将灵芝液体种子接种于瓶中的苦藤药性基质中，放在恒温发酵室培养， 使菌丝长满全瓶，在长满菌丝后继续培养，得到最终的苦藤药物组合物。
[0012] 进一步，所述菌丝生长可分为四个阶段：（1)适应期（0-10d):菌丝生长较慢，菌丝 较纤弱；（2)旺盛期（ll-35d):菌丝活力较强，代谢旺盛，生长快；（3)下降期（35-50d):菌 丝生长速度急剧下降；（4)衰退期（50-70d):菌丝活力衰退，菌丝老龄化，开始分泌黄褐色 素。
[0013] 本发明的有益效果是总二萜含量高的情况下很好的控制了苦藤的毒性。
【专利附图】
【附图说明】
[0014] 图1为波叶青牛胆正丁醇部位液相色谱图；
[0015] 图2为波叶青牛胆正丁醇部总离子流图；
[0016] 图 3 为 Rumphioside Ac_D 的质谱图；
[0017] 图4为Rumphioside Ac_D的化学结构式；
[0018] 图 5 为 Borapetoside B 的质谱图；
[0019] 图6为Borapetoside B的化学结构；
[0020] 图7为波叶青牛胆发酵部分乙醇提取物对正常小鼠 ㈧和2型糖尿病小鼠⑶口 服糖耐量的影响（i ±S，η = 12)统计图。
【具体实施方式】
[0021] 1材料与方法
[0022] 1. 1 材料
[0023] 灵芝Ganoderma lucidum菌种，苦藤 Tinospora crispa(L. )Miers 生药材，由马来 西亚百年生态园GAP种植基地提供。
[0024] 1. 2 方法
[0025] 制备方法是以含水量为总重量30%?70%的植物苦藤为培养基，将灵芝的原种 接种在该培养基上，在适宜灵芝生长的条件下固体发酵后，收集包含灵芝菌丝体和培养基 成分在内的全部菌质混合物。
[0026] 1. 2. 1菌种：斜面菌种的活化：无菌条件下从灵芝母种斜面上切取0. 5cm2的菌块， 转接到PDA斜面培养基上，置于28 土 1°C，相对湿度60 %条件下培养7d，挑选菌丝健壮、洁 白、无污染、长满试管斜面的菌种，4 °C冰箱保存备用。
[0027] 液体菌种的制备：无菌条件下将活化的斜面菌种接入液体种子培养基（葡萄糖 2〇g/L，酵母粉 5g/L，KH2P041. 5g/L，MgS040. 75g/L，CaC032. 5g/L，VB10. lg/L)，28°C、120r/ min黑暗条件下培养7d，挑选液体澄清，菌球大小均匀者作为双向固体发酵的液体菌种备 用。秤7. 5g糙米粉+150ml水（二重複）置于250ml摇瓶中搅拌均匀，进行121°C，20分钟 灭菌，杀菌后将摇瓶置于无菌操作台冷却至室温后备用。每瓶接入l〇ml预活化的灵芝菌 液，在30°C，150rpm震盪培养箱培养两天接入液体种子培养基（葡萄糖20g/L，酵母粉5g/ L，KH2P041. 5g/L，MgS040. 75g/L，CaC032. 5g/L，VB10. lg/L)，28°C、120r/min 黑暗条件下培 养7d，挑选液体澄清，菌球大小均匀者作为双向固体发酵的液体菌种备用。
[0028] 1. 2. 2药性基质：将采集的新鲜苦藤，取其带皮的茎部，置于60°C电热鼓风干燥箱 烘干，用粉碎机粉碎，过筛，混匀，分装于发酵瓶中，121°C高压灭菌120min备用。
[0029] 1. 2. 3双向发酵：将灵芝液体种子定量接种于苦藤药性基质（即瓶中含有苦藤成 分的基质），于恒温发酵室培养，培养条件为温度25 - 28°C，黑暗条件，每天严密观察灵芝 的生长情况，记录半瓶期，全瓶期，旺盛度等。
[0030] 1. 2. 4菌质后处理：将灵芝菌质，其中的菌质是指灵芝在苦藤药性基质中生长成 为新的药用真菌（简称菌质），按不同发酵天数取样GO、G10、G15、G20、G25、G30、G40、G50、 G60、G70、G80、G90 (GO菌丝长满全瓶在温度适宜的情况下，一般48小时就可以看见菌丝萌 发。35天左右即可长满全瓶）。G10代表菌丝长满全瓶后10d，依次类推）。每个菌质组出 样后充分混匀，称量菌质湿重，电热鼓风干燥箱中60°C烘干（烘干至含水量为5% ±1%)， 称量菌质干重，计算灵芝对苦藤药性基质的转化率、消耗率，计算公式为：转化率=菌质干 重/基质总干重X 100%消耗率=1 一转化率，本试验通过发酵过程中菌质总二萜化合物 含量的HPLC动态变化监测（见图1)，结合菌质的急性毒性试验为灵芝固体发酵苦藤的减 毒持效研究提供理论依据。双向发酵是根据中药被某些真菌（大多为空气中曲霉、青霉等 杂菌）污染霉变（发酵）后引起中药药性药效变化的原理，用现代科学技术将药用真菌发 酵菌种与具有一定活性成分的植物药材作为药性基质构成发酵组合，在特定条件下进行发 酵，基质在提供真菌生长所需营养的同时又能被真菌的酶改变组织、成分，从而产生新的性 味功能的药性菌质（简称菌质），该药性菌质是人工制造的新药材。它主要用于增效、扩用、 解毒等方面。
[0031] 本发明研究了苦藤的生物技术处理，即采用为药用真菌新型（双向）固体发酵工 程所建立的"发酵组合三层优选法"，筛选出有效发酵菌种为灵芝。本文运用"发酵过程动态 比较法"进一步研究灵芝接种于苦藤药性基质上发酵不同时间所得菌质的总二萜含量（见 图2)、急性毒性和免疫功能的变化，建立了苦藤解毒持效双向固体发酵的发酵工艺，为进一 步进行苦藤生物技术解毒持效，提高降糖功效研究奠定基础。
[0032] 1. 2. 5不同发酵时间菌质总二萜的测定：称取苦藤生药、灭菌生药和不同发酵时 间的灵芝菌质粉末〇. 5g，95%乙醇超声提取3次，每次乙醇用量为40mL，时间为20min，合并 3次提取液，减压回收95 %乙醇的浸膏，加蒸馏水50mL溶解后，用乙酸乙酯萃取3次，每次 乙酸乙酯为30mL，合并乙酸乙酯萃取液减压回收至无气味得苦藤粗总二萜，甲醇溶解苦藤 粗总二萜并定容至50mL。精确吸取样品制备液7mL置于具塞试管，分别加入2. 5% 3, 5-二 硝基苯甲酸1.5mL和10% K0H1.5mL，摇匀，静置lOmin，以加样品制备液为对照，在波长 51 Onm测定总二廠的含量。
[0033] 1. 2. 6不同发酵时间菌质的急性毒性试验：按照常规试验方法测定GO、G10、G15、 G20、G25、G30、G40、G50、G60、G70、G80菌质的急性毒性。各药物组各取健康昆明种小鼠60 只（体重18 - 22g，购自江苏大学试验动物中心，早?各半，分笼饲养，随机分为6组，每组 10只，其中5个给药组，1个空白对照组（生理盐水），灌胃（i. g.)给药。根据预试验所获 得的0%和100%死亡剂量范围，按0. 4mL/10g给药体积，1:0. 75或1:0. 8剂间比，i. g.相 应剂量的灵芝菌质浸膏，Id给药2次，即Id内共给药0. 8mL/10g。给药前禁食16h，自由饮 水。首次给药后禁食4h并严密观察小鼠的一般情况和死亡数，每天观察1次，连续观察7d， 用半数致死量计算软件（Bliss法）计算小鼠 LD50。
[0034] 1. 2. 7不同发酵时间菌质的免疫功能试验：取昆明种小鼠54只，雌雄各半，随机分 成9组：蒸馏水组、地塞米松组、G30组、G35组、G40组、G50组、G60组、G70组、G80组，每 组6只。根据小鼠体重按0. 2mL/10g/d给药，各菌质组的浓度为其LD50的1/6,地塞米松 的浓度为0. 〇〇75g/kg，蒸馏水组按体重i. g.等量蒸馏水，连续i. g. 7d。小鼠给药第7天脱 颈处死，无菌条件下摘取脾脏，制备成2 X 106/mL浓度的脾细胞悬液。在96孔板上每孔加 100 μ L细胞悬液，分别加入ConA(10 μ g/mL)和LPS(20 μ g/mL)各100 μ L。每个样品设3 个重复孔。置 37°C、5% C02 培养 48h 后，每孔加入 10μ L5mg/mLMTT，37°C孵育 4h，1，000r/ min,离心lOmin，弃上清，再每孔加入150 μ L二甲基亚砜（DMSO)，振荡lOmin，使紫色结晶完 全溶解。用自动酶标仪以492nm波长测定0D值。
[0035] 2结果与分析
[0036] 2. 1灵芝在苦藤药性基质上的生长情况灵芝在苦藤药性基质中生长良好，菌丝 生长旺盛，菌丝体浓密呈白色，与苦藤药性基质无法分开。菌丝体长满半瓶的平均时间为 13. 6d，长满全瓶的平均时间为17. 68d。以长满全瓶的时间记为发酵的第0天，由不同发酵 时间灵芝对苦藤药性基质的消耗率和转化率结果，可知，灵芝发酵对苦藤基质的转化随发 酵时间延长，转化率逐渐减少；而随发酵时间延长，苦藤药性基质的消耗率逐渐变大。
[0037] 2. 2不同发酵时间菌质总二萜含量
[0038] 采用紫外分光度计法测定苦藤菌质在药用真菌发酵不同时间总二萜含量变化 (图2)结果表明，苦藤原药材经灵芝发酵后菌质中总二萜的含量变化呈明显规律，灵芝菌 丝长满瓶起至满瓶后30d的时间内，随发酵时间的延长，总二萜含量下降，在发酵30d时总 二廠含量最低，而在发酵35d时含量又上升，含量为0. 65%，之后含量比较平稳，但到70d 时又出现下降。菌质中的总二萜含量变化在发酵过程中呈现先降低后升高，然后含量保持 相对稳定的规律，这可能是因为在发酵的前期，灵芝菌丝代谢活动旺盛，对苦藤中的二萜类 化合物进行了分解；而随着发酵时间的延长，灵芝本身会产生的次生代谢产物可能和苦藤 中的某些成分反应生成了二萜类化合物；发酵后期，灵芝菌丝生命活动减弱，代谢缓慢，菌 质中的二萜含量保持了相对稳定。在整个发酵周期中，第30天菌质中的总二萜含量达到最 低。
[0039] 2. 3不同发酵时间菌质急性毒性试验应用灵芝对苦藤进行双向发酵后所得的菌质 急性毒性试验结果表明，苦藤的毒性得到了极大的降低。
[0040] 经灵芝发酵后所得菌质的LD50均高于苦藤生药和灭菌药材，在发酵的前30天，随 着发酵时间的延长，LD50是逐渐增高的，第30天达到最大值，为28. 46g/kg ;第30天后随着 时间的延长，菌质的LD50又逐渐降低，发酵第80天时，菌质的LD50降至17. 81g/kg。试验 结果表明双向性发酵可以达到降低苦藤毒性的目的，各菌质组的急性毒性较生药组降低， G20组、G30组的毒性较低，尤以G30组毒性最低，即发酵后第30天所得菌质毒性最低。
[0041] 2. 4T. crispa对正常小鼠以及糖尿病小鼠的糖耐量影响。
[0042] 为 了测定 T. crispa 发酵提取物（T. crispa fermentation extract-简称 TFE) 对糖耐量的影响，本试验以正常ICR小鼠和糖尿病小鼠为实验对象。在正常组中（如 图7所示），正常ICR小鼠在给予TFE和5 %羧甲基纤维素钠（CMC)溶液后的血糖分别 为6. 68±0. 64mmol/L和7. 91 ±0. 36mmol/L ;在灌胃葡萄糖溶液60min后，给予5 %羧甲 基纤维素钠溶液的小鼠血糖值达到20. 31±1.20mmol/L，而给予TFE的小鼠的血糖值为 16.53±0.65mmol/L，这表明，与给予5%羧甲基纤维素钠溶液小鼠血糖相比，TFE显著降 低了正常小鼠的血糖水平；在给予葡萄糖溶液120min和150min后，TFE小鼠的血糖水平 仍然比给予5%羧甲基纤维素钠溶液小鼠血糖低，且有显著性差异（P〈0.05)。在2型糖尿 病小鼠中，小鼠在给予TFE和5%羧甲基纤维素钠溶液后的血糖分别为13. 00±0. 91mmol/ L和15. 39± 1. 04mmol/L (如图4. 2. B所示），在灌胃葡萄糖60min后给予5%羧甲基 纤维素钠溶液的小鼠血糖值达到22. 59 ±0. 92mmol/L，而给予TFE的小鼠的血糖值为 18. 74±0. 75mmol/L，结果表明，与给予5%羧甲基纤维素钠溶液的2型糖尿病小鼠相比，口 服灌胃2g/kg葡萄糖水溶液60、120、150min后TFE显著降低了血浆葡萄糖水平。口服糖耐 量实验结果表明TFE显著提高了 2型糖尿病小鼠葡萄糖的利用率，改善其糖耐量水平。此外 与给予5% CMC的AUC相比，给予TFE显著降低了正常组和模型组的AUC，分别为：17. 93% 和 18. 69% (图 7)。
[0043] 2. 5试验方法
[0044] 2. 5. 1发酵后产物供试品溶液的制备与鉴定；
[0045] 取波叶青牛胆发酵后产物正丁醇部位干燥粉末适量甲醇溶解后用0. 45um微孔滤 膜滤过，备用。
[0046] 2. 5. 2HPLC分析T. crispa正丁醇部位条件的建立与优化；
[0047] 对波叶青牛胆正丁醇部位RP-HPLC分析方法，流动相条件为：乙腈：0.02%三氟 乙酸水溶液梯度洗脱（〇_5min，2% :98%?6% :94% ;5-20min，6% :94%?15% :85% ; 20-25min, 15% :85%;25-30min, 16% :84%;30-35min, 17% :83%;35-40min, 17% :83%? 20% :80%;43-53min，20% :80%?38% :62%;53-60min，38% :62%)。通过 LC-MS 分 析并比对文献其主要化学成分，为2个化合物，分别为：Rumphioside Ac_D和Borapetoside 8。（见图4,6)
[0048] 2. 5. 3液质联用分析；
[0049] 建立T. crispa发酵后产物正丁醇部位PR-HPLC分析方法后采用液质联用分析其 化学成分，并且根据质谱分子离子峰以及碎片峰推测化合物化学结构式。质谱参数：ESI离 子源，离子源温度350〇C，毛细管电压4. 5kv，正离子检出模式，氮气流速30L/min。扫描范 围：111/2100?1000。（见图3,5)。
【权利要求】
1. 一种苦藤药物组合物，其特征在于按质量百分比由以下原材料组成：灵芝含量 5-30%，苦藤含量 70-95%。
2. 按照权利要求1所述一种苦藤药物组合物，其特征在于灵芝含量30%，苦藤含量 70%。
3. 按照权利要求1所述一种苦藤药物组合物，其特征在于：所述苦藤药物组合物或其 提取物为有效药用成分Rumphioside Ac-D与Borapetoside B，单独或与药学中可以接受的 辅助成分共同组成具有降血糖和减肥功效的药物。
4. 按照权利要求1所述一种苦藤药物组合物，其特征在于：所述苦藤药物组合物或其 提取物为活性成分，单独或与食品中可以接受的其它成分共同组成具有降血糖和减肥功效 的功能食品。
5. 按照权利要求1所述一种苦藤药物组合物的制备方法，其特征在于：将灵芝菌种在 无菌条件下接入液体种子培养基培养，得到灵芝液体种子，同时将新鲜苦藤茎部烘干粉碎， 并装于多个发酵瓶中高压灭菌，得到苦藤药性基质，将灵芝液体种子接种于瓶中的苦藤药 性基质中，放在恒温发酵室培养，使菌丝长满全瓶，在长满菌丝后继续培养，得到最终的苦 藤药物组合物。
6. 按照权利要求5所述的一种苦藤药物组合物的制备方法，其特征在于：所述菌 丝生长可分为四个阶段：（1)适应期（〇-l〇d) :菌丝生长较慢，菌丝较纤弱；（2)旺盛期 (ll-35d):菌丝活力较强，代谢旺盛，生长快；（3)下降期（35-50d):菌丝生长速度急剧下 降；(4)衰退期（50-70d):菌丝活力衰退，菌丝老龄化，开始分泌黄褐色素。
【文档编号】A61P3/10GK104138417SQ201410334256
【公开日】2014年11月12日 申请日期:2014年7月14日 优先权日:2014年7月14日
【发明者】黄丹民, 汤建 申请人:黄丹民