Carabin在治疗心肌肥厚中的功能及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种Carabin在治疗心肌肥厚中的功能及应用，属于基因的功能与应用领域。本发明以心脏特异性Carabin转基因小鼠和非转基因为实验对象，通过主动脉弓缩窄手术模拟心肌肥厚疾病模型研究Carabin基因的表达与心肌肥厚之间的关系，结果表明Carabin基因过表达显著抑制了心肌肥厚及其纤维化，改善心功能，即Carabin基因具有能够保护心脏功能和抑制心肌肥厚的作用。基于Carabin基因的作用，Carabin可用于制备保护心脏功能和/或预防、缓解和/或治疗心肌肥厚的药物，为心肌肥厚的治疗提供了一条有效的新途径。
【专利说明】
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因的功能与应用领域，特别涉及一种Carabin (TBC1D10C)在治疗心 肌肥厚中的功能和应用，具体是在制备预防、缓解和/或治疗心肌肥厚药物中的应用。 Carab i η在治疗心肌肥厚中的功能及应用
【背景技术】
[0002] 据世界卫生组织报告，心血管疾病已成为威胁人类生命健康的全球性慢性非传染 性疾病之一。目前，慢性心力衰竭病死率迅速增长，毫无疑问地成为威胁人类生命的重要病 症之一。基础和临床研究证实心力衰竭往往是由心肌肥厚（Cardiac Hypertrophy)演变而 来的，研究表明，心肌肥厚是冠心病、高血压、心律失常、心脏瓣膜病及心肌病等多种心血管 疾病的共同病理生理过程，显著增加心力衰竭的发病率和病死率，且是多种心血管并发症 的独立危险因素。此外，随着左室肥厚的进展，心肌缺血、恶性室性心律失常、心力衰竭、心 源性猝死等心血管事件的发生率增加6-10倍。因此，阐明心肌肥厚发生发展的机制对防治 慢性心力衰竭等心血管疾病具有重要意义，研究其分子机制能为未来寻找防治心肌肥厚的 新靶点奠定理论基础，并产生深远的临床实践意义和广大的社会价值。
[0003] 心肌肥厚是指心脏在遗传、环境、多种生理及病理因素的作用下，为了适应心脏做 功增加而出现的心脏重量和体积增加，主要以心肌细胞体积增大和细胞外基质增多为特 征。心肌肥厚由多种因素调节，且是一种复杂的动态过程。研究表明持续的压力和/或容 量负荷过度，可增加室壁应力，导致心肌肥厚。大体可见心脏重量明显增加、心室结构改变； 细胞水平上可见，心肌细胞长度和/或宽度增大，肌节数量增加、排列紊乱，胶原含量增加， 纤维组织过度增生，细胞排列紊乱松散；分子水平上，转化生长因子-β、血管紧张素 II、内 皮素、儿茶酚胺等各种胞外刺激信号可激活信号转导，诱导胚胎型基因的表达，从而促使细 胞发生肥大表型变化，最终导致心肌细胞肥大。然而，现有的研究并不能完全诠释心肌肥厚 的发生机制。因此，寻找抑制心肌肥厚的特异性分子，对于进一步阐述心肌肥厚的发生发展 机制，具有重大的理论意义，可为临床防治心肌肥厚提供新靶点和新策略。
[0004] Carabin又称TBC1D10C，是TBC域家族成员10C，最开始在鼠和人系统性红斑狼 疮的B细胞通过转录体组鉴定，Carabin在细胞中的低表达，引起学者对Carabin在B细 胞中的蛋白功能的研究。有研究表明Carabin作为calcineurin (|丐调神经磷酸酶）的内 源性抑制剂，可以负性调节T细胞的功能，通过其羧基末端域与钙神经素相互作用，抑制 calcineurin的活化及Ras信号通路【1】；在B细胞中Carabin免疫缺陷会增加 BCR (B细 胞受体）-TLR9 (Toll样受体）共同刺激诱导的自身免疫，缺失Carabin的B细胞经TLR9 (Toll样受体9)激动剂CpG-DNA刺激后，会加速B细胞的早期响应，从而使小鼠更易得抗 dsDNA产物和狼疮肾耀斑【2】。已有研究表明calcineurin介导的通路是心肌肥厚发生、发 展的关键性途径【3,4,5】;Madhu Gupta等发现在心肌细胞中富集表达的microRNA-378通 过靶向Ras信号通路，参与抑制心肌肥厚的发生【6】。因此，Carabin可能在心肌肥厚中起 到重要作用，为心肌肥厚引起的心脏疾病的治疗研究提供的新的思路。
[0005]【参考文献】 1、 Pan F，Sun L，Kardian DB，et al. Feedback inhibition of calcineurin and Ras by a dual inhibitory protein Carabin. Nature. 2007 Jan 25;445(7126):433-6. 2、 Schickel JN，Pasquali JL，Soley A，et al. Carabin deficiency in B cells increases BCR-TLR9 costimulation-induced autoimmunity. EMBO Mol Med. 2012 Dec;4(12) :1261-75. 3、 Booz GW. Putting the brakes on cardiac hypertrophy ：exploiting the N〇-cGM P counter-regulatory system. Hypertension，2005,45 :341-346. 4、 Wilkins BJ，Molkentin JD. Calcineurin and cardiac hypertrophy ：where have we been? Where are we going? J physiol,2002,541 ：l-8. 2 5、 Frey N，Katus HA，Olson EN，et al.Hypertrophy of the heart :a new therapeutic target. Circulation，2004,109 :1580-1589. 6、 Nagalingam RS， Sundaresan NR, Gupta MP， et al. A cardiac enriched microRNA, miR-378 blocks cardiac hypertrophy by targeting Ras-signaling. J Biol Chem. 2013 Apr 19;288(16):11216-32〇
【发明内容】
[0006] 为解决上述现有技术的缺陷和不足，本发明的目的在于确定Carabin的表达和心 肌肥厚的相互关系，提供一种Carabin在筛选保护心脏功能和/或预防、缓解和/治疗心肌 肥厚的药物中的应用，提供一个用于保护心脏功能和/或预防、缓解和/或治疗心肌肥厚的 革巴基因 Carabin的新用途。
[0007] 本发明的目的通过下述技术方案实现： 本发明通过试验确定Carabin表达与心肌肥厚之间的关系： Carabin基因过表达显著抑制了心肌肥厚及其纤维化，改善心功能：本发明选用心脏 特异性Carabin转基因小鼠和非转基因小鼠进行试验，并将每种小鼠分成假手术组和手 术组，每组10只小鼠。手术组给予主动脉弓缩窄手术，假手术组不予主动脉弓缩窄，然后 通过对假手术组和手术组的各组小鼠进行心心脏心肌肥厚、纤维化及心功能的测定，研究 Carabin基因过表达对主动脉弓缩窄诱导的心肌肥厚的影响。结果表明过表达Carabin基 因显著抑制心肌肥厚及纤维化，保护心功能（图1、图2、图3、图4)。
[0008] 由以上结果可知Carabin基因过表达显著抑制了心肌肥厚、纤维化，保护心功能。 因此Carabin基因具有保护心功能和抑制心肌肥厚及纤维化的作用，特别是Carabin基因 能够抑制主动脉弓缩窄引起的心肌肥厚相关疾病发生的作用。
[0009] -种Carabin在心肌肥厚中的功能，主要体现在Carabin基因具有保护心功能和 抑制心肌肥厚的作用，特别是Carabin基因能够抑制主动脉弓缩窄引起的心肌肥厚发生的 作用。
[0010] 针对Carabin的上述功能，提供一种Carabin的应用，主要体现为Carabin在保护 心脏和治疗心肌肥厚中的应用，特别是Carabin在制备保护心脏功能和/或预防、缓解和/ 或治疗心肌肥厚的药物中的应用。
[0011] -种保护心脏功能的药物，包含Carabin。
[0012] 一种预防、缓解和/治疗心肌肥厚的药物，包含Carabin。
[0013] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果： (1)本发明发现Carabin基因的新功能，即Carabin基因具有能够保护心脏功能和抑制 心肌肥厚的作用。
[0014] (2)基于Carabin在保护心脏功能和抑制心肌肥厚疾病中的作用，其可以用于制 备保护心脏功能和/或预防、缓解和/或治疗心肌肥厚的药物。
【专利附图】
【附图说明】
[0015] 图1是NTG和TG小鼠 AB模型8周后HW/BW、LW/BW及HW/TL的统计柱状图，结 果显示 Carabin 过表达会抑制 HW/BW、LW/BW 及 HW/TL (* :p <0· 05 vs NTG Sham 组，# :p < 0· 05 vs NTG AB 组）。
[0016] 图2是NTG和TG小鼠 AB模型8周后心脏组织HE染色及心肌细胞横截面积统计 柱状图，结果显示Carabin过表达会抑制心肌细胞肥大（* :p < 0. 05 vs NTG Sham组，# :p < 0· 05 vs NTG AB 组）。
[0017] 图3是NTG和TG小鼠 AB模型8周后心脏组织天狼星红染色图，结果显示Carabin 过表达会抑制心脏的纤维化。
[0018] 图4是NTG和TG小鼠 AB模型4周后超声检测心功能结果统计柱状图，结果显示 Carabin过表达显著保护心功能；其中，LVEDD为左室舒张末期内径、LVESD为左室收缩末期 内径、EF为射血分数、FS为短轴缩短率（* :p < 0· 05 vs NTG Sham组，# :p < 0· 05 vs NTG AB 组）。
【具体实施方式】
[0019] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限 于此。
[0020] 实验用动物及饲养 实验动物：选用8-10周龄、体重在23. 5-27. 5g，雄性，心脏特异性Carabin转基因小鼠 (TG，心脏特异性Carabin转基因小鼠由武汉大学心血管病研究所李红良教授实验室构建） 及非转基因小鼠（NTG，同龄同窝对照非转基因小鼠）为实验对象。
[0021] 心脏特异性Carabin转基因小鼠的构建： 用引物（上游引物：GTTGTCGACGCCACCATGGCCCAGGCCCTGGGAGA ;下游引物： GCCAAGCTTAGAATCGGGTGTCCAGGAAA)扩增小鼠 Carabin 全长基因（NCBI，Gene ID: 108995, NM_178650)，把扩增的Carabin全长基因连接于心肌肌球蛋白重链（α-MHC)启 动子下游，将构建的序列通过显微注射构造成受精胚胎（C57BL/6J背景)，得到心脏特异 性Carabin转基因老鼠。（上述的转基因小鼠参照下述文献制备：Jiang DS, Bian ZY, Zhang Y, Zhang SM, Liu Y, Zhang R et al. Role of interferon regulatory factor 4 in the regulation of pathological cardiac hypertrophy. Hypertension 2013; 61:1193-1202.) 饲养环境：所有实验小鼠均饲养在武汉大学心血管病研究所SPF级实验动物中心。SRF 级大小鼠饲料购自北京华阜康生物科技有限公司。饲养条件：室温在22-24°C之间，湿度在 40-70%之间，明暗交替照明时间为12h，自由饮水摄食。
[0022] 实施例1心肌肥厚（AB)模型获得 1. 实验动物分组：心脏特异性Carabin转基因小鼠（TG)和非转基因小鼠（NTG)，通过 主动脉缩窄术建立心肌肥厚模型。随机分为4组，分组如下：非转基因小鼠假手术组（NTG Sham)及AB术组（NTG AB)、心脏特异性Carabin转基因小鼠假手术组（TG Sham)及AB术组 (TG AB)。
[0023] 2.心肌肥厚模型采用主动脉弓缩窄手术，模型操作流程： 2. 1术前准备 (1)麻醉：先给小鼠称重，按照90mg/kg体重计算所需麻药（3%戊巴比妥钠）量，通过腹 腔注射，并记录注射时间点。夹尾、夹趾无明显反应且小鼠状态良好为麻醉成功标准(一般 注射后约lOmin无明显反应，以麻醉后约50min小鼠夹趾有反应，麻醉后30min左右为最佳 手术时间）。
[0024] (2)术区准备：将小鼠左胸部、左侧胸部及左前肢腋下的皮肤去毛。剃毛后用湿纱 布擦拭术区去除鼠毛，以不影响手术视野为宜。
[0025] (3)气管插管：用橡皮筋将小鼠上门齿固定于V形板斜面上，并迅速将气管插管经 声门准确插入气管内，随后右侧卧位置于加热垫上(加热垫需提前预热)，然后将气管插管 与呼吸机连接，固定小鼠。若小鼠的胸廓起伏与呼吸机频率一致，说明气管插管成功。
[0026] 2. 2主动脉弓降支结扎术 取右侧卧位，小鼠左前肢置于右前肢上方，并用医用胶带将两前肢固定。右胸部下方垫 入棉签，抬高胸廓，依次用碘酒及体积分数为75%酒精对手术区域皮肤消毒。左手持眼科镊 将左胸部皮肤捏起，右手持眼科剪剪开皮肤约lcm，依次分离肌肉及软组织，于第2-3肋水 平打开胸腔，用棉签稍拨开左肺，游离主动脉弓降支，将7-0手术缝线穿过血管，并在血管 上方平行放置一段26G (25. 0-27. 5g小鼠）或者27G (23. 5-25. Og)注射器针头，将血管及 针头一起结扎好，再抽出针头即可达到相应程度的血管缩窄。结扎完毕后依次缝合，关闭胸 腔，用注射器从缝口处插入胸腔并抽出lcc气体以恢复胸腔内负压，拔出注射器后迅速缝 合皮肤切口。假手术组（Sham)在游离出主动脉降支后只穿线不结扎，其余步骤同心肌肥厚 (AB)模型组。
[0027] 2.3术后护理 主动脉弓降支结扎术后，待小鼠出现自主呼吸、夹趾出现强烈反应，拔出气管插管，并 将小鼠放入装有高压灭菌过的垫料、饲料和饮用水的饲养笼内，于饲养室继续饲养观察。非 转基因小鼠及心脏特异性Carabin转基因小鼠术后8周分别进行各项指标的检测。
[0028] 实施例2小鼠心肌肥厚（AB)模型心肌肥厚及纤维化检测 1.取材 (1)前期工作：预先准备装有20mL的体积分数10%甲醛的尿杯，并贴好标签(小鼠编号、 组别、手术类型及取材日期)。将倒满质量分数10% KC1溶液的培养皿置于取材处。打开分 析天平，调零备用。再称重处死小鼠。
[0029] (2)取材：眼科弯镊夹住心耳下方的血管蒂，剪下心脏，迅速置于质量分数10% KC1 溶液中。待心脏停跳在舒张期后，置于灭菌纱布上，轻轻挤压心腔内液体，蘸干表面液体后， 称重并记录，将心脏放入相应的尿杯中，固定48h后用于病理学检测。
[0030] (3)相关测量及计算：取出小鼠肺脏，修剪后滤纸吸干，称重并记录。剪开小鼠后 肢胫骨处皮肤，测量并记录胫骨长度。计算心重与体重的比值（HW/BW)，肺重与体重的比值 (LW/BW)以及心重与胫骨长度的比值（HW/TL)。
[0031] 2.病理学检测 2. 1制备石錯标本切片 主要操作程序包括修剪心脏一包埋框处理一流水冲洗一脱水一透明一浸蜡一包埋一 切片一摊片一晾干或烘烤后备用。
[0032] 2.2苏木精-伊红（HE)染色 主要步骤为：55 °C烘烤30min -二甲苯5min，3次一100%酒精lmin - 95%酒精 lmin - 70%酒精lmin -双蒸水lmin -苏木素溶液(珠海贝索，BA-4021) 5min -水 洗lmin - 1%盐酸酒精(取3mL浓盐酸与297mL 70%酒精充分混合均匀）l-3s -水洗 lmin - Scott液(碳酸氢钠 0. 35g，七水硫酸镁2g，两者溶于100mL蒸馈水）lmin -水洗 lmin -伊红溶液(珠海贝索，BA-4024) 3_5min -蒸馈水洗去浮色一70%酒精Is - 95%酒 精Is - 100%酒精30s，3次一二甲苯2min，3次一趁二甲苯未干立即封片一通风橱内吹干， 显微镜拍照。
[0033] HE染色图片统计：每张图片选择3个以上边界清楚，核大致位于中央的细胞，用 Image-Pro Plus 6. 0软件圈细胞面积。
[0034] 2. 3天狼星红（PSR)染色 主要步骤为：55 °C烘烤30min -二甲苯2min，3次一100%酒精lmin - 95%酒 精lmin - 70%酒精lmin -流水冲洗lOmin -双蒸水lmin -质量分数0. 2%磷钥酸 2min - 0. 1%天狼猩红苦味酸溶液滴于组织上，湿盒中染色90min -去除残液一0. 01N盐 酸4s - 70%酒精1次一90%酒精1次一100%酒精30s，3次一二甲苯2min，3次一趁二甲 苯未干立即盖玻片封片，显微镜拍照。
[0035] 心肌组织由心肌细胞和间质组织组成，心脏是一终末分化器官，心肌细胞失去增 殖能力，各种生理或病理性刺激引起的心肌细胞反应，只能是单个细胞的体积增大而不能 在数量上增殖。因此，在心肌肥厚的病理生理过程中，主要表现为心肌细胞体积增大，肌节 数量增多，细胞排列紊乱，心脏间质改变包括心肌成纤维细胞的增殖与转化，胶原纤维密度 增加，胶原分泌增加，胶原比例平衡失调等。
[0036] 图1、图2、图3是NTG和Carabin-TG小鼠 AB模型后的表型结果。结果表明NTG 小鼠 AB术后8周的HW/BW、LW/BW及HW/TL高于其Sham组；AB术后8周TG小鼠的HW/BW、 LW/BW及HW/TL增大的程度明显小于NTG小鼠（图1)。心脏表型，AB组较Sham组的心脏均 增大，且AB术后TG小鼠心脏增大的程度远小于NTG小鼠。HE染色切片可观察到：Sham组 心肌肌原纤维细胞排列整齐、致密，形态完整，胞核及核仁结构清晰；AB组肌丝排列紊乱、 松散，心肌细胞体积明显增大，形态不规整，胞核深染、增大、畸形，核仁模糊，TG小鼠 AB术 后心肌细胞横截面积大于Sham组，显著小于NTG小鼠 AB组（图2)。PSR染色可见，发现AB 组心室心肌间质胶原含量较Sham组增加，动脉血管周围胶原增加更为明显，胶原增粗，排 列紊乱成网络状；TG小鼠 AB术后心肌间质胶原含量及血管周围胶原含量均小于NTG小鼠 AB组（图3)。以上结果说明经AB模型后，小鼠发生明显的心肌肥厚，Carabin-TG小鼠的心 肌肥厚程度小于NTG小鼠。
[0037] 实施例3心肌肥厚（AB)模型小鼠超声检测心功能 1前期准备 (1)麻醉机准备：先连接氧气瓶和麻醉机上的进气接口，再拧开麻醉机上加药口密封 盖，迅速加入异氟烷至安全刻度后拧紧密封盖。拧开氧气瓶上总阀门，调整流量控制阀的旋 钮，出气压力维持在〇· 2-0. 3mPa。
[0038] (2)待测小鼠准备：待检测小鼠用异氟烷迅速麻醉后，左胸前区剃毛，将处理好的 小鼠头部伸入麻醉剂导管套头内，以1. 5-2. 0%异氟烷维持小鼠稳定的麻醉状态。
[0039] 2心功能检测 小鼠取左侧卧位或仰卧位，并在剃毛区均匀涂抹超声耦合剂(天津成信公司）。采用 高频超声诊断仪，频率为15MHz，选取标准左心室乳头肌短轴切面，测量左室舒张末期内径 (LVEDD)、左室收缩末期内径（LVESD)、射血分数（EF)及短轴缩短率（FS)。
[0040] 本实施例运用Μ型超声心动图检测评价心肌肥厚和心功能。图4是NTG和 Carabin-TG小鼠 ΑΒ模型后的超声检测结果。与NTG Sham组相比，NTG小鼠 ΑΒ术后8周 表现出心功能减弱和心肌肥厚。主要表现为心肌肥厚的指标LVEDD、LVESD增大，而反映心 功能的指标EF、FS则下降。AB术后8周，与NTG小鼠相比，TG小鼠心肌肥厚的指标LVEDD、 LVESD增大的程度及反应心功能的指标EF、FS下降的程度则小于NTG组。这些结果与TG小 鼠心肌肥厚被抑制的结果一致。
[0041] 由以上结果可知，在主动脉弓缩窄引起的心肌肥厚疾病模型中，Carabin基因过表 达显著抑制了心肌肥厚、纤维化，保护心功能。因此Carabin基因具有保护心功能和抑制心 肌肥厚及纤维化的作用，特别是Carabin基因能够抑制主动脉弓缩窄引起的心肌肥厚相关 疾病发生的作用。
[〇〇42] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。 SEQUENCE LISTING 〈110>武汉大学 〈120〉Carabin在治疗心肌肥厚中的功能及应用 <130> 1 <160> 2 <170> Patentln version 3.5 <210> 1 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> 〈223>上游引物 <400> 1 gttgtcgacg ccaccatggc ccaggccctg ggaga 35 <210> 2 〈211〉 29 〈212〉 DNA <213> Artificial Sequence 〈220〉 〈223>下游引物 〈400> 2 gccaagctta gaatcgggtg tccaggaaa 29
【权利要求】
1. Carabin在制备保护心脏功能的药物中的应用。
2. -种保护心脏功能的药物，其特征在于：包含Carabin。 3. Carabin在制备预防、缓解和/或治疗心肌肥厚的药物中应用。
4. 一种预防、缓解和/治疗心肌肥厚的药物，其特征在于：包含Carabin。
【文档编号】A61K38/17GK104107418SQ201410377412
【公开日】2014年10月22日 申请日期:2014年8月1日 优先权日:2014年8月1日
【发明者】李红良, 蒋丁胜, 邓克穷, 张晓东 申请人:武汉大学