IκB激酶ε抑制剂（SIKE）在治疗心肌肥厚中的功能及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种IκB激酶ε的抑制剂SIKE在心肌肥厚中的功能和应用，属于基因的功能与应用领域。本发明确定了SIKE的表达与心肌肥厚之间的相互关系，以心脏特异性SIKE转基因小鼠和非转基因为实验对象，通过主动脉弓缩窄手术，模拟心肌肥厚疾病模型，结果表明SIKE基因过表达显著抑制了心肌肥厚及其纤维化，改善心功能。因此，SIKE基因可作为药物靶标，用于在筛选保护心脏功能和/或预防、缓解和/治疗心肌肥厚的药物；SIKE基因可作为基因治疗中的靶基因，用于在设计和制备在保护心脏功能和/或预防、缓解和/治疗心肌肥厚的药物和/或生物学试剂，为心肌肥厚的治疗提供了一条有效的新途径。
【专利说明】[0001] I κ B激酶ε抑制剂（SIKE)在治疗心肌肥厚中的功能及应用
【技术领域】
[0002] 本发明属于基因的功能与应用领域，特别涉及一种I κ B激酶ε抑制剂（SIKE)在 治疗心肌肥厚中的功能和应用，具体是在制备预防、缓解和/或治疗心肌肥厚的药物中的 应用。
【背景技术】
[0003] 据世界卫生组织报告，心血管疾病已成为威胁人类生命健康的全球性慢性非传染 性疾病之一。多种心血管疾病包括高血压、动脉粥样硬化、心脏瓣膜病、心肌病等都会进展 为心力衰竭，是大多数病患住院和死亡的首要原因。心肌肥厚是心脏对机械负荷及神经体 液因子改变的代偿反应，临床研究表明，心肌肥厚不仅是心力衰竭前的一种适应性反应，而 且是缺血，心律失常、猝死等心血管疾病的独立危险因子。心肌肥厚包括"生理性"肥厚和 "病理性"肥厚，通常将发生在锻炼后的正常个体且不伴有心肌损伤的肥厚称为"生理性"月巴 厚；在"病理性"肥厚时，尽管增大的心脏体积最初是代偿性机制，持续的肥厚却最终会导致 左室功能的下降、显著升高个体心衰、心律失常和猝死的风险。心血管疾病发病率和病死率 在全世界范围内持续升高，尽管在治疗方法上有了进步，但是目前依然没有有效方法减少 心血管事件的发生。因此寻找抑制心肌肥厚的特异性分子，对于进一步阐述心肌肥厚的发 生发展机制，具有重大的理论意义，可为临床防治心肌肥厚提供新靶点和新策略。
[0004] SIKE (suppressor of IKK ε 1)是 IKK ε (inhibitor of kappa B kinase 印silon，lKB激酶ε)抑制剂。IkB激酶家族（lKBkinases，IKKs)是NF-κΒ信号途径 最为重要的成员之一，其在先天性免疫以及炎症反应的调节中发挥关键作用。目前已发现 IKKs家族除IKK α / β / Y复合物之外，还存在另外一种I K B激酶复合物IKK ε。作为IKKs 家族的最新成员，ΙΚΚε和ΙΚΚα/β/Υ之间有非常高的同源性，他们在N末端都含有一个 特殊的激酶功能结构物，在C端则是一个螺旋-螺旋膜体(motif)。IKK ε可高表达于胸腺、 脾、外周血细胞及富含活化Τ细胞的细胞群中【1】。
[0005] 心肌肥厚发生的机制十分复杂，研究证实NF-κ Β的激活是心肌细胞肥大所必需 的，研究表明NF-κ Β信号通路在心肌肥厚的发生发展中起着重要作用【2,3】。ΙΚΚε被证明 有助于脂多糖和病毒诱导的IRF3 (干扰素调节因子3)和IRF7的磷酸化过程，由此引起它 的同型二聚、核转运和I型干扰素基因（INF-α和INF-β )的激活【4】。SIKE是ΙΚΚε的抑 制剂，可抑制由病毒和TLR3触发引起的IRF3活性【5,6】;而IRF3可通过下调ERK1/2的激 活，来抑制心肌肥厚【7】。因此，SIKE可能在心肌肥厚中起到重要作用，为心肌肥厚引起的 心脏疾病的治疗研究提供新的思路。
[0006] 【参考文献】 1、Peters RT， Liao SM， Maniatis T. IKKepsiIon is part of a novel PMA-inducible IkappaB kinase complex. Mol Cell 2000; 5: 513-522 2、 Freund C， Schmidt-Ullrich R， Baurand A， et al. Requirement of nuclear factor-NF-κ B in angiotensin II and isoproterenol-induced cardiac hypertrophy in vivo. Circulation, 2005, 111 (18):2319-2325. 3、 Young D，Popovic ZB, Jones WK, et al. Blockade of NF-kappa B using I kappa B alpha dominant-negative mice ameliorates cardiac hypertrophy in myotrophin-overexpressed transgenic mice. J Mol Biol, 2008，381 (3):559-568. 4、 Hemmi H， Takeuchi 0， Sato S， et al. K. The roles of two IkappaB kinase-related kinases in lipopolysaccharide 554 and double stranded RNA signaling and viral infection. J Exp Med, 2004,199: 1641-1650. 5、 Huang J，Liu T，Xu LG, Chen D，et al. SIKE is an IKK epsilon/ TBK1-associated suppressor of TLR3- and virus-triggered IRF-3 activation pathways. ΕΜΒ0 J. 2005, ; 24 (23) : 4018-28. 6、 Marion JD， Roberts CF， Call RJ， et al. Mechanism of endogenous regulation of the type I interferon response by suppressor of I κ B kinase epsilon (SIKE), a novel substrate of TANK-binding kinase 1 (TBK1). J Biol Chem. 2013:288(25) :18612-23. 7、 Lu J， Bian ZY， Zhang R， Zhang Y， et al. Interferon regulatory factor 3 is a negative regulator of pathological cardiac hypertrophy. Basic Res Cardiol. 2013;108(2) :326
【发明内容】
[0007] 为解决上述现有技术的缺陷和不足，本发明的首要目的在于确定SIKE的表达和 心肌肥厚的相互关系，提供一种SIKE作为药物靶标在筛选保护心脏功能和/或预防、缓解 和/治疗心肌肥厚的药物中的应用，提供一个用于保护心脏功能和/或预防、缓解和/或治 疗心肌肥厚的靶基因 SIKE的新用途。
[0008] 本发明的目的通过下述技术方案实现： 本发明通过试验确定SIKE表达与心肌肥厚之间的关系：SIKE基因过表达显著抑制了 心肌肥厚及其纤维化，改善心功能。
[0009] 本发明选用心脏特异性SIKE转基因小鼠和非转基因小鼠进行试验，并将每种小 鼠分成假手术组和手术组，每组10只小鼠。手术组给予主动脉弓缩窄手术，假手术组不予 主动脉弓缩窄，然后通过对假手术组和手术组的各组小鼠进行心脏心肌肥厚、纤维化及心 功能的测定，研究SIKE基因过表达对主动脉弓缩窄诱导的心肌肥厚的影响。结果表明过表 达SIKE基因显著抑制心肌肥厚及纤维化，保护心功能。
[0010] 由以上结果可知SIKE基因过表达显著抑制了心肌肥厚、纤维化，保护心功能。因 此SIKE基因具有保护心功能和抑制心肌肥厚及纤维化的作用，特别是SIKE基因能够抑制 主动脉弓缩窄引起的心肌肥厚相关疾病发生的作用。
[0011] 针对SIKE的上述功能，提供一种SIKE的应用，主要体现为SIKE在保护心脏和制 备治疗心肌肥厚中的应用，特别是SIKE在制备保护心脏功能和/或预防、缓解和/或治疗 心肌肥厚的药物中应用。
[0012] 一种保护心脏功能的药物，包含SIKE。
[0013] 一种预防、缓解和/治疗心肌肥厚的药物，包含SIKE。
[0014] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果： (1)本发明发现SIKE的新功能，即SIKE具有能够保护心脏功能和抑制心肌肥厚的作 用。
[0015] (2)基于SIKE在保护心脏功能和抑制心肌肥厚中的作用，其可以用于制备保护心 脏功能和/或预防、缓解和/或治疗心肌肥厚的药物。
【专利附图】
【附图说明】
[0016] 图1是NTG和TG小鼠 AB模型8周后心身比（HW/BW)、肺身比（LW/BW)及心胫比（HW/ TL)的统计柱状图，结果显示SIKE过表达会抑制HW/BW、LW/BW及HW/TL (* :p < 0. 05vs NTG Sham 组，# :p < 0· 05vs NTG AB 组）。
[0017] 图2是NTG和TG小鼠 AB模型8周后心脏组织HE染色及心肌细胞横截面积统计 柱状图，结果显示SIKE过表达会抑制心肌细胞肥大（*:p < 0. 05vs NTG Sham组，#:p < 0·05vs NTG AB 组）。
[0018] 图3是NTG和TG小鼠 AB模型8周后心脏组织天狼星红染色图，结果显示SIKE过 表达会抑制心脏的纤维化。
[0019] 图4是NTG和TG小鼠 AB模型8周后超声检测心功能结果统计柱状图，结果显示 SIKE过表达显著保护心功能；其中，LVEDD为左室舒张末期内径、LVESD为左室收缩末期内 径、EF为射血分数、FS为短轴缩短率（*:p < 0.05vs NTG Sham组，#:p < 0.05vs NTG AB 组）。
【具体实施方式】
[0020] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限 于此。
[0021] 实验用动物及饲养 实验动物：选用8-10周龄、体重在23. 5-27. 5g，雄性，心脏特异性SIKE转基因小鼠 (TG，心脏特异性SIKE转基因小鼠由武汉大学心血管病研究所李红良教授实验室构建)及非 转基因小鼠（NTG，同龄同窝对照非转基因小鼠）为实验对象。
[0022] 心脏特异性SIKE转基因小鼠的构建： 用引物（上游引物：GTTGTCGACGCCACCATGAGCTGCACGATCGAGAA ;下游引物： GCCAAGCTTACTTGATGGTCTGAGAGG)扩增小鼠 SIKE 全长基因（NCBI, Gene ID: 66641， NM_025679. 3)，把扩增的SIKE全长基因连接于心肌肌球蛋白重链（a -MHC)启动子下游，将 构建的序列通过显微注射构造成受精胚胎（C57BL/6J背景），得到心脏特异性SIKE转基因 老鼠。（上述的转基因小鼠参照下述文献制备：Jiang DS, Bian ZY, Zhang Y, Zhang SM, Liu Y, Zhang R et al. Role of interferon regulatory factor 4 in the regulation of pathological cardiac hypertrophy. Hypertension 2013; 61:1193-1202.) 饲养环境：所有实验小鼠均饲养在武汉大学心血管病研究所SPF级实验动物中心。SRF 级大小鼠饲料购自北京华阜康生物科技有限公司。饲养条件：室温在22-24°C之间，湿度在 40-70%之间，明暗交替照明时间为12h，自由饮水摄食。
[0023] 【实施例1】心肌肥厚（AB)模型获得 1. 实验动物分组：心脏特异性SIKE转基因小鼠（TG)和非转基因小鼠（NTG)，通过主动 脉缩窄术建立心肌肥厚模型。随机分为4组，分组如下：非转基因小鼠假手术组（NTG Sham) 及AB术组（NTG AB)、心脏特异性SIKE转基因小鼠假手术组（TG Sham)及AB术组（TG AB)。
[0024] 2.心肌肥厚模型采用主动脉弓缩窄手术，模型操作流程： 2. 1术前准备 (1)麻醉：先给小鼠称重，按照90mg/kg体重计算所需麻药（3%戊巴比妥钠）量，通过腹 腔注射，并记录注射时间点。夹尾、夹趾无明显反应且小鼠状态良好为麻醉成功标准(一般 注射后约lOmin无明显反应，以麻醉后约50min小鼠夹趾有反应，麻醉后30min左右为最佳 手术时间）。
[0025] (2)术区准备：将小鼠左胸部、左侧胸部及左前肢腋下的皮肤去毛。剃毛后用湿纱 布擦拭术区去除鼠毛，以不影响手术视野为宜。
[0026] (3)气管插管：用橡皮筋将小鼠上门齿固定于V形板斜面上，并迅速将气管插管经 声门准确插入气管内，随后右侧卧位置于加热垫上(加热垫需提前预热)，然后将气管插管 与呼吸机连接，固定小鼠。若小鼠的胸廓起伏与呼吸机频率一致，说明气管插管成功。
[0027] 2.2主动脉弓降支结扎术 取右侧卧位，小鼠左前肢置于右前肢上方，并用医用胶带将两前肢固定。右胸部下方垫 入棉签，抬高胸廓，依次用碘酒及体积分数为75%酒精对手术区域皮肤消毒。左手持眼科镊 将左胸部皮肤捏起，右手持眼科剪剪开皮肤约lcm，依次分离肌肉及软组织，于第2-3肋水 平打开胸腔，用棉签稍拨开左肺，游离主动脉弓降支，将7-0手术缝线穿过血管，并在血管 上方平行放置一段26G (25. 0-27. 5g小鼠）或者27G (23. 5-25. Og)注射器针头，将血管及 针头一起结扎好，再抽出针头即可达到相应程度的血管缩窄。结扎完毕后依次缝合，关闭胸 腔，用注射器从缝口处插入胸腔并抽出lcc气体以恢复胸腔内负压，拔出注射器后迅速缝 合皮肤切口。假手术组（Sham)在游离出主动脉降支后只穿线不结扎，其余步骤同心肌肥厚 (AB)模型组。
[0028] 2.3术后护理 主动脉弓降支结扎术后，待小鼠出现自主呼吸、夹趾出现强烈反应，拔出气管插管，并 将小鼠放入装有高压灭菌过的垫料、饲料和饮用水的饲养笼内，于饲养室继续饲养观察。非 转基因小鼠及心脏特异性SIKE转基因小鼠术后8周分别进行各项指标的检测。
[0029] 【实施例2】小鼠心肌肥厚（AB)模型心肌肥厚及纤维化检测 1.取材 (1)前期工作：预先准备装有20mL的体积分数10%甲醛的尿杯，并贴好标签(小鼠编号、 组别、手术类型及取材日期)。将倒满质量分数10% KC1溶液的培养皿置于取材处。打开分 析天平，调零备用。再称重处死小鼠。
[0030] (2)取材：眼科弯镊夹住心耳下方的血管蒂，剪下心脏，迅速置于质量分数10% KC1 溶液中。待心脏停跳在舒张期后，置于灭菌纱布上，轻轻挤压心腔内液体，蘸干表面液体后， 称重并记录，将心脏放入相应的尿杯中，固定48h后用于病理学检测。
[0031] (3)相关测量及计算：取出小鼠肺脏，修剪后滤纸吸干，称重并记录。剪开小鼠后 肢胫骨处皮肤，测量并记录胫骨长度。计算心重与体重的比值（HW/BW)，肺重与体重的比值 (LW/BW)以及心重与胫骨长度的比值（HW/TL)。
[0032] 2.病理学检测 2. 1制备石錯标本切片 由实验室专业病理工作人员制备石蜡标本切片，主要操作程序包括修剪心脏一包埋框 处理一流水冲洗一脱水一透明一浸蜡一包埋一切片一摊片一晾干或烘烤后备用。
[0033] 2.2苏木精-伊红（HE)染色 主要步骤为：55 °C烘烤30min -二甲苯5min，3次一100%酒精lmin - 95%酒精 lmin - 70%酒精lmin -双蒸水lmin -苏木素溶液(珠海贝索，BA-4021) 5min -水 洗lmin - 1%盐酸酒精(取3mL浓盐酸与297mL 70%酒精充分混合均匀）l-3s -水洗 lmin - Scott液(碳酸氢钠0. 35g，七水硫酸镁2g，两者溶于100mL蒸馈水）lmin -水洗 lmin -伊红溶液(珠海贝索，BA-4024) 3_5min -蒸馈水洗去浮色一70%酒精Is - 95%酒 精Is - 100%酒精30s，3次一二甲苯2min，3次一趁二甲苯未干立即封片一通风橱内吹干， 显微镜拍照。
[0034] HE染色图片统计：每张图片选择3个以上边界清楚，核大致位于中央的细胞，用 Image-Pro Plus 6. 0软件圈细胞面积。
[0035] 2. 3天狼星红（PSR)染色 主要步骤为：55 °C烘烤30min -二甲苯2min，3次一100%酒精lmin - 95%酒 精lmin - 70%酒精lmin -流水冲洗lOmin -双蒸水lmin -质量分数0. 2%磷钥酸 2min - 0. 1%天狼猩红苦味酸溶液滴于组织上，湿盒中染色90min -去除残液一0. 01N盐 酸4s - 70%酒精1次一90%酒精1次一100%酒精30s，3次一二甲苯2min，3次一趁二甲 苯未干立即盖玻片封片，显微镜拍照。
[0036] 心肌组织由心肌细胞和间质组织组成，心脏是一终末分化器官，心肌细胞失去增 殖能力，各种生理或病理性刺激引起的心肌细胞反应，只能是单个细胞的体积增大而不能 在数量上增殖。因此，在心肌肥厚的病理生理过程中，主要表现为心肌细胞体积增大，肌节 数量增多，细胞排列紊乱；心脏间质改变包括心肌成纤维细胞的增殖与转化，胶原纤维密度 增加，胶原分泌增加，胶原比例平衡失调等。
[0037] 图1、图2、图3是NTG和SIKE-TG小鼠 AB模型后的表型结果。结果表明NTG小鼠 AB术后8周的HW/BW、LW/BW及HW/TL高于其Sham组；AB术后8周TG小鼠的HW/BW、LW/BW 及HW/TL增大的程度明显小于NTG小鼠（图1)。心脏表型表明，AB组较Sham组的心脏均增 大，且AB术后TG小鼠心脏增大的程度远小于NTG小鼠。HE染色切片可观察到：Sham组心 肌肌原纤维细胞排列整齐、致密，形态完整，胞核及核仁结构清晰；AB组肌丝排列紊乱、松 散，心肌细胞体积明显增大，形态不规整，胞核深染、增大、畸形，核仁模糊TG小鼠 AB术后心 肌细胞横截面积大于Sham组，显著小于NTG小鼠 AB组（图2)。PSR染色可见，发现AB组心 室心肌间质胶原含量较Sham组增加，动脉血管周围胶原增加更为明显，胶原增粗，排列紊 乱成网络状；TG小鼠 AB术后心肌间质胶原含量及血管周围胶原含量均小于NTG小鼠 AB组 (图3)。以上结果说明经AB模型后，小鼠发生明显的心肌肥厚，SIKE过表达可显著抑制心 脏的心肌细胞肥大和纤维化。
[0038] 【实施例3】心肌肥厚（AB)模型小鼠超声检测心功能 1前期准备 (1)麻醉机准备：先连接氧气瓶和麻醉机上的进气接口，再拧开麻醉机上加药口密封 盖，迅速加入异氟烷至安全刻度后拧紧密封盖。拧开氧气瓶上总阀门，调整流量控制阀的旋 钮，出气压力维持在〇· 2-0. 3mPa。
[0039] (2)待测小鼠准备：待检测小鼠用异氟烷迅速麻醉后，左胸前区剃毛，将处理好的 小鼠头部伸入麻醉剂导管套头内，以1. 5-2. 0%异氟烷维持小鼠稳定的麻醉状态。
[0040] 2心功能检测 小鼠取左侧卧位或仰卧位，并在剃毛区均匀涂抹超声耦合剂(天津成信公司）。采用 高频超声诊断仪，频率为15MHz，选取标准左心室乳头肌短轴切面，测量左室舒张末期内径 (LVEDD)、左室收缩末期内径（LVESD)、射血分数（EF)及短轴缩短率（FS)。
[0041] 本实施例运用Μ型超声心动图检测评价心肌肥厚和心功能。图4是NTG和SIKE-TG 小鼠 ΑΒ模型后的超声检测结果。与NTG Sham组相比，NTG小鼠 ΑΒ术后8周表现出心功能 减弱和心肌肥厚。主要表现为心肌肥厚的指标LVEDD、LVESD增大，而反应心功能的指标EF、 FS则下降。AB术后8周，与NTG小鼠相比，TG小鼠心肌肥厚的指标LVEDD、LVESD增大的程 度及反应心功能的指标EF、FS下降的程度则小于NTG组。这些结果表明SIKE过表达可以 显著保护心功能，与TG小鼠心肌肥厚被抑制的结果一致。
[0042] 由以上结果可知，在主动脉弓缩窄引起的心肌肥厚疾病模型中，SIKE基因过表达 显著抑制了心肌肥厚、纤维化，保护心功能。因此SIKE基因具有保护心功能和抑制心肌肥 厚及纤维化的作用，特别是SIKE基因能够抑制主动脉弓缩窄引起的心肌肥厚相关疾病发 生的作用。
[〇〇43] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1. IK B激酶ε的抑制剂SIKE在制备保护心脏功能和/或预防、缓解和/或治疗心肌 肥厚的药物中的应用。
2. -种保护心脏功能和/或预防、缓解和/或治疗心肌肥厚的药物，其特征在于：包含 ΙκΒ激酶ε的抑制剂SIKE。
3. Ικ Β激酶ε的抑制剂SIKE在筛选保护心脏功能和/或预防、缓解和/或治疗心肌 肥厚的药物中的应用。
【文档编号】A61K45/00GK104107430SQ201410377414
【公开日】2014年10月22日 申请日期:2014年8月1日 优先权日:2014年8月1日
【发明者】李红良, 蒋丁胜, 邓克穷, 张晓东 申请人:武汉大学