Sh2b衔接蛋白3（sh2b3）在治疗心肌肥厚中的功能及应用的制作方法

Sh2b衔接蛋白3（sh2b3）在治疗心肌肥厚中的功能及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种SH2B衔接蛋白3（SH2B3）在治疗心肌肥厚中的功能及应用。本发明确定了SH2B3基因的表达与心肌肥厚之间的相互关系：心肌肥厚发生时SH2B3的表达明显上调；SH2B3基因缺陷抑制Akt信号通路的激活，抑制了心肌肥厚、纤维化，保护心功能；SH2B3基因过表达显著促进激活Akt信号通路，促进了心肌肥厚及其纤维化，恶化心功能。因此，SH2B3基因可作为药物靶标，用于筛选保护心脏功能和/或预防、缓解和/治疗心肌肥厚的药物；SH2B3基因可作为基因治疗中的靶基因，用于设计和制备保护心脏功能和/或预防、缓解和/治疗心肌肥厚的药物和/或生物学试剂，为心肌肥厚的治疗提供了一条有效的新途径。
【专利说明】
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因的功能与应用领域，特别涉及一种SH2B衔接蛋白3 (SH2B3)在治 疗心肌肥厚中的功能和应用，具体是在制备预防、缓解和/或治疗心肌肥厚药物中的应用。 SH2B衔接蛋白3 (SH2B3)在治疗心肌肥厚中的功能及应用

【背景技术】
[0002] 心血管系统疾病是目前世界的头号杀手之一，在我国目前心血管系统疾病的发生 率已提高至各种主要疾病的首位。研究表明，心肌肥厚是冠心病、高血压、心律失常、心脏瓣 膜病及心肌病等多种心血管疾病的共同病理生理过程，是多种心血管并发症的独立危险因 素。心肌肥厚是指心脏在遗传、环境、多种生理及病理因素的作用下，为了适应心脏做功增 加而出现的心脏重量和体积增加，主要以心肌细胞体积增大和细胞外基质增多为特征，被 认为是单个心肌细胞增大所致的形态学改变而不是心肌细胞数量的增长。心肌肥厚由多种 因素调节，且是一种复杂的动态过程。研究表明持续的压力和/或容量负荷过度，可增加室 壁应力，导致心肌肥厚。大体可见心脏重量明显增加、心室结构改变；细胞水平上可见，心肌 细胞长度和/或宽度增大，肌节数量增加、排列紊乱，胶原含量增加，纤维组织过度增生，细 胞排列紊乱松散；分子水平上，转化生长因子-β、血管紧张素 II、内皮素、儿茶酚胺等各种 胞外刺激信号可激活信号转导，诱导胚胎型基因的表达，从而促使细胞发生肥大表型变化， 最终导致心肌细胞肥大。左室肥厚是公认的心血管疾病死亡率的危险因素，如果未经治疗， 其可以导致收缩和舒张功能不全并最终导致心力衰竭。然而，现有的研究并不能完全诠释 心肌肥厚的发生机制。因此，寻找抑制心肌肥厚的特异性分子，对于进一步阐述心肌肥厚的 发生发展机制，具有重大的理论意义，可为临床防治心肌肥厚提供新靶点和新策略。
[0003] SH2B是一类含有SH2和ΡΗ结构域的信号接头蛋白，在生长发育、代谢平衡和免疫 调节等诸多方面发挥着重要的调控作用。SH2B3是SH2B家族的成员，也称LNK，主要表达于 造血系统，由一些功能区域组成，包含一个Ν端脯氨酸区域，一个同源（ΡΗ)结构域，一个SH2 结构域，以及一个C端可能是酪氨酸磷酸化位点的序列【1，2】。
[0004] LNK负性调节多个酪氨酸激酶和细胞因子信号通路，SH2B3缺失的小鼠脾脏Β细 胞前体(未成熟的Β细胞和pre-B)积累，造血干细胞增加，提高自我更新能力。细胞体外实 验表明，在永生化的B类淋巴细胞中，SH2B3移码突变体SH2B3蛋白合成功能缺失，JAK2和 STAT3的磷酸化水平升高，提高细胞生长和增殖能力。SH2B3是适配性蛋白质，在正常和恶 性造血细胞、神经细胞、内皮细胞、肿瘤细胞中等均有广泛的研究。在卵巢癌中，SH2B3可通 过增强Ρ-ΑΚΤ、ρ-ΜΑΡΚ信号通路，增强细胞黏附，减慢细胞迁移，促进肿瘤细胞的生长【3】； SH2B3基因敲除小鼠体内B细胞、巨核细胞及造血干细胞的数量增加，SH2B3基因的多态 性与炎症和自身免疫学疾病有关联，在人类骨髓增殖性肿瘤和急性白血病患者中均可发现 SH2B3基因的突变，抑制炎症细胞⑶8 (+) T细胞的增殖，从而利于维持肠道稳态【4】；SH2B3 通过抑制IL-11信号通路，从而抑制辐射耐受性和辐射诱导的急性B细胞恶性肿瘤【5】； 在神经系统中，SH2B3通过激活PLC γ、MEK-ERK1/2以及PI3K-AKT信号通路和Egr-Ι的表 达，抑制神经分化，负性调节PC12细胞和皮质神经细胞的神经突生长【6】;在内皮细胞中， SH2B3是整合素信号的关键调控器，可SH2B3负性调节TNF信号通路，减少促炎因子产生， 抑制内皮细胞的凋亡，对血小板及内皮细胞的粘附、迁移和血栓形成有重要的影响【7，8】。 而SH2B3在心肌肥厚中的作用及其机制的研究目前尚无报道。
[0005] 【参考文献】： 1、 Li Y, et al. Cloning and characterization of human Lnk, an adaptor protein with pleckstrin homology and Src homology 2 domains that can inhibit T cell activation. J Immunol (2000). 164 (10):5199 - 5206 2、 Takaki S, et al. Control of B cell production by the adaptor protein Ink. Definition of a conserved family of signal-modulating proteins. Immunity. 13(5) :599 - 609 3> L-ff Ding, et al. LNK (SH2B3): paradoxical effects in ovarian cancer. Oncogene advance online publication 7 April 2014; doi: 10.1038/onc.2014.34 4> Katayama H, et al. Lnk prevents inflammatory CD8 ( + ) T-cell proliferation and contributes to intestinal homeostasis. Eur J Immunol. 2014 Jun;44(6):1622-32 5、 Louria-Hayon I, et al. Lnk adaptor suppresses radiation resistance and radiation-induced B-cell malignancies by inhibiting IL-11 signaling. Proc Natl Acad Sci USA. 2013 Dec 17;110 (51):20599-604 6、 Wang TC, et al. The adaptor protein SH2B3 (Lnk) negatively regulates neurite outgrowth of PC 12 cells and cortical neurons. PLoS One. 2011;6(10):e26433. doi: 10 7、 Devalliere J, et al. LNK (SH2B3) is a key regulator of integrin signaling in endothelial cells and targets a -parvin to control cell adhesion and migration. FASEB J. 2012 Jun;26 (6):2592-606 8、 Devalliere J, et al. The adaptor Lnk (SH2B3): an emerging regulator in vascular cells and a link between immune and inflammatory signaling. Biochem Pharmacol. 2011 Nov 15;82 (10):1391-402。


【发明内容】

[0006] 为解决上述现有技术的缺陷和不足，本发明的目的在于确定SH2B3的表达和心肌 肥厚的相互关系，提供一种SH2B3作为药物靶标在筛选保护心脏功能和/或预防、缓解和/ 治疗心肌肥厚的药物中的应用，提供一个用于保护心脏功能和/或预防、缓解和/或治疗心 肌肥厚的靶基因 SH2B3的新用途。
[0007] 本发明的目的通过下述技术方案实现： 本发明首先通过试验确定SH2B3表达与心肌肥厚之间的关系： 1、在发生心肌肥厚的情况下，SH2B3的表达明显上调 本发明选用正常人和扩张型心肌病、肥厚性心肌病患者以及正常小鼠和发生心肌肥厚 小鼠的心脏，对心脏提取蛋白质进行SDS-PAGE-免疫印迹试验（Western blot)，结合特异 性识别SH2B3和蛋白心肌细胞肥大标志物ANP、Myh7的抗体进行检测，测定其SH2B3的表 达。结果表明，在人和小鼠发生肥厚的心脏中，心肌细胞肥大标志物ANP、Myh7的表达明显 上调，SH2B3的表达也明显上调（图1、图2、图3)。
[0008] 2、SH2B3基因敲除显著抑制了心肌肥厚、纤维化的程度，保护心功能；SH2B3基因 过表达显著促进了心肌肥厚及其纤维化的程度，恶化心功能 本发明选用野生型小鼠、SH2B3基因敲除小鼠及心脏特异性SH2B3转基因小鼠和非转 基因小鼠进行试验，并将每种小鼠分成假手术组和手术组，每组10只小鼠。手术组给予主 动脉弓缩窄手术，假手术组不予主动脉弓缩窄，然后通过对假手术组和手术组的各组小鼠 进行心脏心肌肥厚、纤维化及心功能的测定，研究SH2B3基因敲除/过表达对主动脉弓缩窄 诱导的心肌肥厚的影响。结果表明敲除SH2B3基因所致的SH2B3缺陷显著抑制心肌肥厚、 纤维化，保护心功能；过表达SH2B3基因显著恶化心肌肥厚、纤维化以及心功能（图4-11)。
[0009] 3、SH2B3基因敲除抑制AKT信号通路的激活；SH2B3基因过表达促进AKT信号通路 激活 本发明用野生型小鼠、SH2B3基因敲除小鼠及心脏特异性SH2B3转基因小鼠和非转基 因小鼠分别进行假手术和主动脉弓缩窄手术，然后在术后4周对各组小鼠心脏提取蛋白质 进行SDS-PAGE-免疫印迹试验（Western blot)，结果显示敲除SH2B3基因所致的SH2B3缺 陷显著抑制AKT信号通路的激活，SH2B3基因过表达促进AKT信号通路的激活（图12,图 13)。
[0010] 由以上结果可知发生心肌肥厚时，SH2B3表达上调，SH2B3基因缺陷抑制AKT信号 通路的激活，抑制了心肌肥厚及其纤维化，保护心功能，SH2B3基因过表达促进AKT信号通 路的激活，显著促进了心肌肥厚、纤维化，恶化心功能。因此，SH2B3基因可作为药物靶点，构 建SH2B3基因过表达的体外细胞模型或动物模型，用于筛选预防、缓解和/或治疗心肌肥厚 疾病的药物；SH2B3基因也可作为基因治疗中的靶基因，设计并制备预防、缓解和/或治疗 心肌肥厚的药物和/或生物学试剂，通过基因工程技术达到预防、缓解和/或治疗心肌肥厚 的目的。例如以SH2B3为靶基因，设计可干扰SH2B3表达的双链siRNA，通过化学方法合成 以后，注射入人体通过RNA干扰的方法使SH2B3基因沉默来治疗心肌肥厚疾病；还可以设计 并构建SH2B3的突变体，注射后进入细胞，竞争SH2B3原形的作用底物，从而抑制SH2B3的 功能，起到治疗目的；此外，还可以以SH2B3为靶点设计小分子化合物抑制剂，利用SH2B3基 因过表达的体外细胞模型或动物模型，通过筛选，发现其中能够特异性抑制SH2B3的分子， 从而为心肌肥厚的治疗提供新的治疗性分子。
[0011] 针对SH2B3的上述功能，提供SH2B3作为药物靶标在筛选保护心脏功能和预防、缓 解和/或治疗心肌肥厚的药物中的应用。
[0012] 针对SH2B3的上述功能，提供SH2B3的抑制剂在制备保护心脏功能和预防、缓解和 /或治疗心肌肥厚的药物中的应用。
[0013] 一种保护心脏功能的药物，包含SH2B3的抑制剂。
[0014] 一种预防、缓解和/或治疗心肌肥厚的药物，包含SH2B3的抑制剂。
[0015] 所述的SH2B3的抑制剂优选为SH2B3基因的siRNA、SH2B3基因的RNA干扰载体， SH2B3的抗体及其他能够抑制SH2B3表达的抑制剂中的一种。
[0016] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果： (1)本发明发现了 SH2B3基因的新功能，S卩SH2B3能够恶化心脏功能和促进心肌肥厚的 作用。
[0017] (2)基于SH2B3在恶化心脏功能和促进心肌肥厚中的功能，为研制心肌肥厚的药 物提供靶标。
[0018] (3)SH2B3的抑制剂可用于制备保护心脏功能和预防、缓解和/或治疗心肌肥厚的 药物。

【专利附图】

【附图说明】
[0019] 图1是正常人和扩张型心肌病患者心脏中ANP、Myh7、SH2B3的表达，心肌病患者心 脏SH2B3的表达上调，β -Tubulin作为内参（* :p < 0. 05 vs正常人组)。
[0020] 图2是正常人和肥厚性心肌病患者心脏中ANP、Myh7、SH2B3的表达，心肌病患者心 脏SH2B3的表达上调，β -Tubulin作为内参（* :p < 0. 05 vs正常组)。
[0021] 图3是小鼠在假手术（Sham)和主动脉弓缩窄手术（AB)后心脏中ANP、Myh7、SH2B3 的表达，说明发生心肌肥厚的心脏SH2B3的表达上调，β -Tubulin作为内参；其中4W表示 4周，8W表示8周（* :p < 0. 05 vs野生型小鼠 Sham组）。
[0022] 图 4 是 SH2B3+/+ 和 SH2B3-/-小鼠 AB 模型 4 周后 HW/BW、LW/BW 及 HW/TL 的统计 柱状图（* :p < 0. 05 vs野生型Sham组，# :p < 0. 05 vs野生型AB组）。
[0023] 图5是SH2B3+/+和SH2B3-/-小鼠 AB模型4周后心脏组织HE染色及心肌细胞横 截面积统计柱状图（* :p < 0· 05 vs野生型Sham组，# p < 0· 05 vs野生型AB组)。
[0024] 图6是SH2B3+/+和SH2B3-/-小鼠 AB模型4周后心脏组织天狼星红染色及左室 胶原面积统计柱状图（* :p < 0. 05 vs野生型Sham组，# :p < 0. 05 vs野生型AB组)。
[0025] 图7是NTG和TG小鼠 AB模型4周后HW/BW、LW/BW及HW/TL的统计柱状图（* :p < 0· 05 vs NTG Sham 组，# :p < 0· 05 vs NTG AB 组）。
[0026] 图8是NTG和TG小鼠 AB模型4周后心脏组织HE染色及心肌细胞横截面积统计 柱状图（* :P < 〇· 05 vs NTG Sham 组，# :p < 0· 05 vs NTG AB 组）。
[0027] 图9是NTG和TG小鼠 AB模型4周后心脏组织天狼星红染色及左室胶原面积统计 柱状图（* Φ < 〇· 05 vs NTG Sham 组，# :p < 0· 05 vs NTG AB 组）。
[0028] 图10是SH2B3+/+和SH2B3-/-小鼠 AB模型4周后心功能检测结果。A是超声检 测心功能结果统计柱状图；B是血流动力学检测心功能结果统计柱状图，其中，LVEDD为左 室舒张末期内径、LVESD为左室收缩末期内径、FS为短轴缩短率、EF为射血分数、dP/dt max 为左室内压最大上升速率及dP/dt min为左室内压最小上升速率（*:p< 0.05 vs野生型 Sham 组，# :p < 0· 05 vs 野生型 AB 组）。
[0029] 图11是NTG和TG小鼠 AB模型4周后心功能检测结果。A是超声检测心功能结 果统计柱状图；B是血流动力学检测心功能结果统计柱状图，其中，LVEDD为左室舒张末期 内径、LVESD为左室收缩末期内径、FS为短轴缩短率、EF为射血分数、dP/dt max为左室内 压最大上升速率及dP/dt min为左室内压最小上升速率（* :p < 0. 05 vs NTG Sham组，# : p < 0· 05 vs NTG AB 组）。
[0030] 图12是SH2B3+/+和SH2B3-/-小鼠 Sham及AB模型4周时AKT信号通路Western blot检测图，结果显示SH2B3敲除会降低FAK、AKT、mTOR和GSK3 β的磷酸化激活；其中 "Ρ-"代表磷酸化的激酶（FAK、AKT、mTOR和GSK3 β )，"Τ-"代表总的(磷酸化的和未磷酸化 的）激酶（FAK、AKT、mTOR 和 GSK3P)，β-Tubulin 作为内参（*:p<0.05 vs 野生型 Sham 组，# :p < 0. 05 vs野生型AB组）。
[0031] 图13是NTG和TG小鼠 Sham及AB模型4周时AKT信号通路Western blot检测 图，结果显示SH2B3过表达会促进FAK、AKT、mTOR和GSK3 β的磷酸化激活；其中"p-"代 表磷酸化的激酶（FAK、AKT、mTOR和GSK3 β )，"Τ-"代表总的(磷酸化的和未磷酸化的）激 酶（FAK、AKT、mT0R 和 GSK3P)，β-Tubulin 作为内参（*:p<0.05 vs NTG Sham 组，#:ρ < 0· 05 vs NTG AB 组）。

【具体实施方式】
[0032] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限 于此。
[0033] 实验用动物及饲养 实验动物：选用8-10周龄、体重在23. 5-27. 5g，背景为雄性C57BL/6的心脏特异 性Cre小鼠（野生型小鼠 a -MHC-Cre (命名SH2B3+/+)，背景为C57BL/6,购自Jackson Laboratory，货号005650)、SH2B3基因敲除小鼠（SH2B3-/-，购自日本RIKEN公司，货号： RIKEN00993)、心脏特异性SH2B3转基因小鼠（TG，心脏特异性SH2B3转基因小鼠由武汉大学 心血管病研究所李红良教授实验室构建)及非转基因小鼠（NTG，同窝对照非转基因小鼠）为 实验对象。
[0034] 心脏特异性SH2B3转基因小鼠的构建： 用引物（上游引物：GTTGTCGACGCCACCATGAACGAGCCCACCGTGCA ;下游引物： GCCAAGCTTACACGTCTGCCTCTCTGCAC)扩增小鼠 SH2B3 全长基因（NCBI，Gene ID :16923， XM_006530171. 1)，把扩增的SH2B3全长基因连接于心肌肌球蛋白重链（α-MHC)启动 子下游，将构建的序列通过显微注射构造成受精胚胎（C57BL/6J背景)，得到心脏特异性 SH2B3转基因老鼠。（上述的转基因小鼠参照下述文献制备Jiang DS，Bian ZY，Zhang Y, Zhang SM, Liu Y, Zhang R et al. Role of interferon regulatory factor 4 in the regulation of pathological cardiac hypertrophy. Hypertension 2013; 61:1193-1202.) 饲养环境：所有实验小鼠均饲养在武汉大学心血管病研究所SPF级实验动物中心。SRF 级大小鼠饲料购自北京华阜康生物科技有限公司。饲养条件：室温在22-24°C之间，湿度在 40-70%之间，明暗交替照明时间为12h，自由饮水摄食。
[0035] 实施例1 SH2B3在正常人和心肌病患者心脏中的表达 选用正常人心脏(非心脏原因的死亡捐献的个体)、扩张型心肌病患者心脏(做心脏移 植手术病人置换的受体，DCM)和肥厚性心肌病患者心脏(做心脏移植手术病人置换的受 体，HCM)，对心脏提取蛋白质进行SDS-PAGE-免疫印迹试验（Western blot)，结合特异性识 SH2B3 蛋白和心肌细胞肥大标志物 ANP (Millipore，AB2232)、Myh7 (santa cruz，sc53090) 的抗体进行检测，测定其 SH2B3(santa cruz，sc7222)的表达，P_Tubulin(Cell Signaling Technology, 2128)做内参。检测结果如图1、图2所示，扩张型心肌病患者心脏中的心肌细 胞肥大标志物ANP、Myh7的表达明显上调，SH2B3的表达也明显上调（图1);肥厚性心肌病患 者心脏中的心肌细胞肥大标志物ANP、Myh7的表达明显上调，SH2B3的表达也明显上调（图 2)。
[0036] 实施例2 SH2B3在野生型小鼠 Sham组和AB手术4W、8W心脏中的表达 1.心肌肥厚模型采用主动脉弓缩窄手术，模型操作流程： 1. 1术前准备 (1)麻醉：先给小鼠称重，按照90mg/kg体重计算所需麻药（3%戊巴比妥钠）量，通过腹 腔注射，并记录注射时间点。夹尾、夹趾无明显反应且小鼠状态良好为麻醉成功标准(一般 注射后约lOmin无明显反应，以麻醉后约50min小鼠夹趾有反应，麻醉后30min左右为最佳 手术时间）。
[0037] (2)术区准备：将小鼠左胸部、左侧胸部及左前肢腋下的皮肤去毛。剃毛后用湿纱 布擦拭术区去除鼠毛，以不影响手术视野为宜。
[0038] (3)气管插管：用橡皮筋将小鼠上门齿固定于V形板斜面上，并迅速将气管插管经 声门准确插入气管内，随后右侧卧位置于加热垫上(加热垫需提前预热)，然后将气管插管 与呼吸机连接，固定小鼠。若小鼠的胸廓起伏与呼吸机频率一致，说明气管插管成功。
[0039] 1.2主动脉弓缩窄术 取右侧卧位，小鼠左前肢置于右前肢上方，并用医用胶带将两前肢固定。右胸部下方垫 入棉签，抬高胸廓，依次用碘酒及体积分数为75%酒精对手术区域皮肤消毒。左手持眼科镊 将左胸部皮肤捏起，右手持眼科剪剪开皮肤约lcm，依次分离肌肉及软组织，于第2-3肋水 平打开胸腔，用棉签稍拨开左肺，游离主动脉弓降支，将7-0手术缝线穿过血管，并在血管 上方平行放置一段26G (25. 0-27. 5g小鼠）或者27G (23. 5-25. Og)注射器针头，将血管及 针头一起结扎好，再抽出针头即可达到相应程度的血管缩窄。结扎完毕后依次缝合，关闭胸 腔，用注射器从缝口处插入胸腔并抽出lcc气体以恢复胸腔内负压，拔出注射器后迅速缝 合皮肤切口。假手术组（Sham)在游离出主动脉降支后只穿线不结扎，其余步骤同心肌肥厚 (AB)模型组。
[0040] 1.3术后护理 主动脉弓降支结扎术后，待小鼠出现自主呼吸、夹趾出现强烈反应，拔出气管插管，并 将小鼠放入装有高压灭菌过的垫料、饲料和饮用水的饲养笼内，于饲养室继续饲养观察。
[0041] 2.取材：打开分析天平，调零备用。再称重处死小鼠。眼科弯镊夹住心耳下方的 血管蒂，剪下心脏，迅速置于灭菌纱布上，轻轻挤压心腔内液体，蘸干表面液体后，称重并记 录，将心脏放入相应的冻存管中，迅速置于液氮罐中，于-80°C冰箱保存后用于分子生物学 检测。
[0042] 3. SH2B3在Sham小鼠和AB小鼠心脏中的表达 分别选野生型Sham小鼠和AB手术后4周及8周的心脏，对心脏提取蛋白质进行 SDS-PAGE-免疫印迹试验（Western blot)，结合特异性识别SH2B3蛋白及心肌细胞肥大标 志物ANP、Myh7的抗体进行检测，测定其SH2B3的表达，检测结果如图3所示。如图3所示， 心肌细胞肥大标志物在AB术后ANP、Myh7的表达明显上调，SH2B3的表达在AB术后明显上 调。
[0043] 实施例3小鼠心肌肥厚（AB)模型心肌肥厚及纤维化检测 1.心肌肥厚模型采用主动脉弓缩窄手术，模型操作流程： 选用8-10周龄、体重在23. 5-27. 5g的野生型小鼠、SH2B3基因敲除小鼠、心脏特异性 SH2B3转基因小鼠及非转基因小鼠各分成假手术组和心肌肥厚模型组，每组10只小鼠。造 模方法同实施例2。
[0044] 2.取材 (1)前期工作：预先准备装有20mL的体积分数10%甲醛的尿杯，并贴好标签(小鼠编号、 组别、手术类型及取材日期)。将倒满质量分数10% KC1溶液的培养皿置于取材处。打开分 析天平，调零备用。再称重处死小鼠。
[0045] (2)取材：眼科弯镊夹住心耳下方的血管蒂，剪下心脏，迅速置于质量分数10% KC1 溶液中。待心脏停跳在舒张期后，置于灭菌纱布上，轻轻挤压心腔内液体，蘸干表面液体后， 称重并记录，将心脏放入相应的尿杯中，固定48h后用于病理学检测。
[0046] (3)相关测量及计算：取出小鼠肺脏，修剪后滤纸吸干，称重并记录。剪开小鼠后 肢胫骨处皮肤，测量并记录胫骨长度。计算心重与体重的比值（HW/BW)，肺重与体重的比值 (LW/BW)以及心重与胫骨长度的比值（HW/TL)。
[0047] 3.病理学检测 3. 1制备石錯标本切片 主要操作程序包括修剪心脏一包埋框处理一流水冲洗一脱水一透明一浸蜡一包埋一 切片一摊片一晾干或烘烤后备用。
[0048] 3.2苏木精-伊红（HE)染色 主要步骤为：55 °C烘烤30min -二甲苯5min，3次一100%酒精lmin - 95%酒精 lmin - 70%酒精lmin -双蒸水lmin -苏木素溶液(珠海贝索，BA-4021) 5min -水 洗lmin - 1%盐酸酒精(取3mL浓盐酸与297mL 70%酒精充分混合均匀）l-3s -水洗 lmin - Scott液(碳酸氢钠0. 35g，七水硫酸镁2g，两者溶于100mL蒸馈水）lmin -水洗 lmin -伊红溶液(珠海贝索，BA-4024) 3_5min -蒸馈水洗去浮色一70%酒精Is - 95%酒 精Is - 100%酒精30s，3次一二甲苯2min，3次一趁二甲苯未干立即封片一通风橱内吹干， 显微镜拍照。
[0049] HE染色图片统计：每张图片选择3个以上边界清楚，核大致位于中央的细胞，用 Image-Pro Plus 6. 0软件圈细胞面积。
[0050] 3. 3天狼星红（PSR)染色 主要步骤为：55 °C烘烤30min -二甲苯2min，3次一100%酒精lmin - 95%酒 精lmin - 70%酒精lmin -流水冲洗lOmin -双蒸水lmin -质量分数0. 2%磷钥酸 2min - 0. 1%天狼猩红苦味酸溶液滴于组织上，湿盒中染色90min -去除残液一0. 01N盐 酸4s - 70%酒精1次一90%酒精1次一100%酒精30s，3次一二甲苯2min，3次一趁二甲 苯未干立即盖玻片封片，显微镜拍照。
[0051] PSR染色图片统计（Image-Pro Plus 6. 0软件):胶原比例=胶原面积八总面积-空 白面积）X 1〇〇%。
[0052] 心肌组织由心肌细胞和间质组织组成，心脏是一终末分化器官，心肌细胞失去增 殖能力，各种生理或病理性刺激引起的心肌细胞反应，只能是单个细胞的体积增大而不能 在数量上增殖。因此，在心肌肥厚的病理生理过程中，主要表现为心肌细胞体积增大，肌节 数量增多，细胞排列紊乱，心脏间质改变包括心肌成纤维细胞的增殖与转化，胶原纤维密度 增加，胶原分泌增加，胶原比例平衡失调等。
[0053] SH2B3+/+和SH2B3-/-小鼠 AB模型后的表型结果见图4-6。Sham (假手术）组 中SH2B3+/+小鼠和SH2B3-/-小鼠的HW/BW、LW/BW及HW/TL之间的差异均无统计学意义； SH2B3+/+ 小鼠 AB 术后 4 周的 HW/BW、LW/BW、HW/TL 高于其 Sham 组；AB 术后 4 周，SH2B3-/-小 鼠的HW/BW、LW/BW及HW/TL均较SH2B3+/+小鼠降低（图4)。HE染色切片可观察到：Sham组 心脏无明显差异，AB组较Sham组的心脏均增大，SH2B3-/-小鼠的心脏明显小于SH2B3+/+ 组小鼠；Sham组心肌肌原纤维细胞排列整齐、致密，形态完整，胞核及核仁结构清晰；AB组 肌丝排列紊乱、松散，心肌细胞体积明显增大，形态不规整，胞核深染、增大、畸形，核仁模 糊，SH2B3-/-组则无 SH2B3+/+组细胞肥大明显，差异有统计学意义（图5)。PSR染色后，发 现AB组心室心肌间质胶原含量较Sham组增加，动脉血管周围胶原增加更为明显，胶原增 粗，排列紊乱成网络状；SH2B3-/-小鼠 AB术后胶原含量及血管周围胶原含量则比SH2B3+/+ 小鼠 AB术后增加较少（图6)。以上结果说明经AB模型后，小鼠发生明显的心肌肥厚， SH2B3-/-小鼠的心肌肥厚程度小于SH2B3+/+小鼠。
[0054] 图7-9是NTG和SH2B3-TG小鼠 AB模型后的表型结果。同样TG小鼠 AB术后4周 的HW/BW、LW/BW及HW/TL高于其Sham组；AB术后4周TG小鼠的HW/BW、LW/BW及HW/TL增 大的程度明显大于NTG小鼠（图7)。心脏表型，AB组较Sham组的心脏均增大，且AB术后 TG小鼠心脏增大的程度远大于NTG小鼠。HE染色切片可观察到：TG小鼠 AB术后心肌细胞 横截面积大于Sham组，显著大于NTG小鼠 AB组（图8)。PSR染色可见，TG小鼠 AB术后心 肌间质胶原含量及血管周围胶原含量大于NTG小鼠 AB组（图9)。以上结果说明经AB模型 后，小鼠发生明显的心肌肥厚，SH2B3-TG小鼠的心肌肥厚程度大于NTG小鼠。
[0055] 实施例4心肌肥厚（AB)模型小鼠心功能检测 1超声检测心功能 1. 1前期准备 (1)麻醉机准备：先连接氧气瓶和麻醉机上的进气接口，再拧开麻醉机上加药口密封 盖，迅速加入异氟烷至安全刻度后拧紧密封盖。拧开氧气瓶上总阀门，调整流量控制阀的旋 钮，出气压力维持在〇· 2-0. 3mPa。
[0056] (2)待测小鼠准备：待检测小鼠用异氟烷迅速麻醉后，左胸前区剃毛，将处理好的 小鼠头部伸入麻醉剂导管套头内，以1. 5-2. 0%异氟烷维持小鼠稳定的麻醉状态。
[0057] 1.2心功能检测 小鼠取左侧卧位或仰卧位，并在剃毛区均匀涂抹超声耦合剂(天津成信公司）。采用高 频超声诊断仪，频率为15MHz，选取标准左心室乳头肌短轴切面，测量、左室舒张末期内径 (LVEDD)、左室收缩末期内径（LVESD)及短轴缩短率（FS)。
[0058] 2心脏导管超声（PV)检测血流动力学 2. 1前期准备 (1)麻醉机准备：同超声检测心功能部分。
[0059] (2)待测小鼠准备：待检测小鼠用异氟烷迅速麻醉后，颈部手术区剃毛，并用湿纱 布擦拭去毛。将处理好的小鼠头部伸入麻醉剂导管套头内，以1. 5-2. 0%异氟烷以维持麻醉 深度，避免麻醉过深或过浅。
[0060] 2. 2 PV 检测 碘酒及75%酒精消毒后，剪开小鼠颈部皮肤，依次分离肌肉和软组织，并游离出右颈总 动脉，于血管下穿过双线并结扎远心端，同时活结结扎近心端。用血管剪在远心端剪一切口 (1/3-1/2管径)，于体视显微镜下将Millarl. 4F超微导管迅速插入右颈总动脉，同时穿一 缝线将导管和血管结扎。打开近心端活结，将导管沿右颈总动脉-升主动脉插入左心室内， 连接Powerlab生物信号采集处理系统。观察记录仪上波形情况，调节导管的位置使波形图 清晰且稳定。监测射血分数（EF)、左室内压最大上升速率（dP/dt max)及左室内压最小上 升速率（dP/dt min)等指标。
[0061] 图10是SH2B3+/+和SH2B3-/-小鼠 AB模型后心功能检测结果图。与SH2B3+/+ Sham组相比，SH2B3+/+小鼠 AB术后4周表现出心功能减弱和心肌肥厚，主要表现为心肌肥 厚的指标LVEDD、LVESD均不同程度的增加，而反映心功能的指标FS则下降。AB术后4周， SH2B3-/-小鼠心肌肥厚的指标增大的程度及反映心功能的指标下降的程度小于SH2B3+/+ 小鼠（图10A)。通过血流动力学指标的检测，观察到AB术后4周SH2B3+/+小鼠 EF、dP/dt max和dP/dt min均比其Sham组降低，AB术后SH2B3-/-小鼠比SH2B3+/+小鼠 AB组的EF、 dP/dt max和dP/dt min降低较少（图10B)。这些结果均与SH2B3-/-小鼠心肌肥厚程度较 小的结果一致。
[0062] 图11是NTG和SH2B3-TG小鼠 AB模型后的超声和PV检测结果。与NTG Sham组 相比，NTG小鼠 AB术后4周表现出心功能减弱和心肌肥厚。主要表现为心肌肥厚的指标 LVEDD、LVESD增大，而反映心功能的指标EF、FS则下降。AB术后4周，与NTG小鼠相比，TG 小鼠心肌肥厚的指标增大的程度及反映心功能的指标下降的程度则大于NTG组（图11A)。 通过血流动力学指标的检测，观察到AB术后4周NTG小鼠 EF、dP/dt max和dP/dt min均 比其Sham组降低，TG小鼠 AB术后EF、dP/dt max和dP/dt min降低的程度则大于NTG组， 差异有统计学意义（图11B)。
[0063] 实施例5 SH2B3基因敲除抑制AKT信号通路的激活；SH2B3基因过表达促进AKT 信号通路的激活 用野生型小鼠、SH2B3基因敲除小鼠、心脏特异性SH2B3转基因小鼠和非转基因小鼠 分别进行假手术和主动脉弓缩窄手术，造模方法同实施例2。然后在术后4周对各组小鼠 心脏提取蛋白质进行SDS-PAGE-免疫印迹试验（Western blot)，检测AKT信号通路蛋白的 表达情况，β-Tubulin (Cell Signaling Technology, 2128)作为内参。结果显示 AB 手术 后 AKT 信号通路被激活，敲除 SH2B3 基因后 p-FAK (Cell Signaling Technology，3284)、 p-AKT (Cell Signaling Technology,4060)、p_mT0R (Cell Signaling Technology,2971) 和p-GSK30 (Cell Signaling Technology,9322)的蛋白表达水平要低于其对照野生型小 鼠组，总的蛋白 T-FAK (Bioworld，BS3583)、T-AKT (Cell Signaling Technology，4691)、 T-mTOR (Cell Signaling Technology，2983)和 T_GSK3i3 (Cell Signaling Technology, 9315)在Sham及AB的各组小鼠间均无明显差异（图12);SH2B3基因过表达后p-FAK、p-AKT、 p-mT0R和p-GSK3 β的蛋白表达水平要高于其对照NTG小鼠，总的蛋白T-FAK、T-AKT、 T-mT0R和T-GSK3 β在Sham及AB的各组小鼠间均无明显差异（图13)。
[0064] 由以上结果可知发生心肌肥厚时，SH2B3表达会上调，SH2B3基因缺陷显著抑制了 心肌肥厚、纤维化，保护心功能，SH2B3基因过表达显著促进了心肌肥厚、纤维化，恶化心功 能。因此SH2B3基因具有恶化心功能和促进心肌肥厚及纤维化的作用，特别是SH2B3基因 能够恶化主动脉弓缩窄引起的心肌肥厚相关疾病发生的作用。 SEQUENCE LISTING 〈110>武汉大学 〈120〉SH2B衔接蛋白3 (SH2B3)在治疗心肌肥厚中的功能及应用 <130> 1 <160> 2 <170> Patentln version 3.5 <210> 1 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> 〈223>上游引物 <400> 1 gttgtcgacg ccaccatgaa cgagcccacc gtgca 35 <210> 2 〈211〉 29 〈212〉 DNA <213> Artificial Sequence 〈220〉 〈223>下游引物 〈400> 2 gccaagctta cacgtctgcc tctctgcac 29
【权利要求】
1. SH2B3作为药物靶标在筛选保护心脏功能的药物中的应用。 2. SH2B3作为药物靶标在筛选预防、缓解和/或治疗心肌肥厚的药物中的应用。 3. SH2B3的抑制剂在制备保护心脏功能的药物中的应用。
4. 一种保护心脏功能的药物，其特征在于：包含SH2B3的抑制剂。 5. SH2B3的抑制剂在制备预防、缓解和/或治疗心肌肥厚的药物中的应用。
6. -种预防、缓解和/或治疗心肌肥厚的药物，其特征在于：包含SH2B3的抑制剂。
7. 根据权利要求3或5所述的应用，其特征在于：所述的SH2B3的抑制剂为SH2B3基 因的siRNA、SH2B3基因的RNA干扰载体或SH2B3的抗体及其他能够抑制SH2B3表达的抑制 剂中的一种。
8. 根据权利要求4或6所述的药物，其特征在于：所述的SH2B3的抑制剂为SH2B3基 因的siRNA、SH2B3基因的RNA干扰载体或SH2B3的抗体及其他能够抑制SH2B3表达的抑制 剂中的一种。
【文档编号】A61K45/00GK104107429SQ201410377411
【公开日】2014年10月22日 申请日期:2014年8月1日 优先权日:2014年8月1日
【发明者】李红良, 蒋丁胜, 蒋曦, 张晓东 申请人:武汉大学