一种抑制藤黄微球菌的金银花抑菌剂的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种抑制藤黄微球菌的金银花抑菌剂，属于中药领域。抑菌剂中金银花提取液与水溶性纳米银以75:1～100:1的比例混合，两种药物的合用对抑制藤黄微球菌起到协同的作用。本发明的一种金银花提取物与纳米银抑菌剂与现有的技术相比，解决了常规抑菌方法中金银花抑菌剂用量较大的问题，同时采用两种低剂量的抑菌物质减少了微生物耐药的发生机率、降低了其对人体的毒性，更加的安全。
【专利说明】一种抑制藤黄微球菌的金银花抑菌剂
【技术领域】
[0001] 本发明属于中药领域，尤其涉及一种中药抑菌组合。
【背景技术】
[0002] 金银花（Lonicera japonica Thumb)，又名双花、银花、忍冬花，为忍冬科多年生缠 绕性木质藤本植物忍冬的花蕾，是我国中草药资源最重要的成员之一，在我国南北各地均 有分布。其对于人体的生理功能主要为清热解毒、疏散风热、凉血止痢。现代医学研究表 明金银花富含绿原酸、异绿原酸、黄酮类物质、忍冬甙、肌醇及微量挥发油等，因而其对人体 有积极作用。金银花可以抗病原微生物，实验证明金银花对各种致病菌、病毒，如金黄色葡 萄球菌、溶血性链球菌、肺炎双球菌、百日咳杆菌、伤寒杆菌、副伤寒杆菌、痢疾杆菌、霍乱弧 菌、绿脓杆菌、大肠杆菌、脑膜炎双球菌、皮肤真菌、流感病毒、钩端螺旋体等均有不同程度 的抑制作用。另外金银花还可以增强免疫功能，促进淋巴细胞转化，增强白细胞的吞噬功 能。金银花因其较高的医药价值和其抗菌性、抗炎性、抗老化、防癌症等许多医药应用而获 得了人们的关注。
[0003] 中药制剂浓缩液制成口服液或抑菌剂、涂覆剂等一次用剂量大，影响效果。
[0004]
【发明内容】
[0005] 针对金银花抑菌剂一次用量大的问题，本发明人经过大量实验，发现纳米银能有 效增强金银花提取液抑菌性能，减少金银花抑菌剂的用量，且采用两种低剂量的抑菌组合 物，更加的安全本。本发明的目的在于提供一种金银花纳米银抑菌剂，减少金银花抑菌剂一 次的用剂量和降低药品对人体的毒性 本发明提供如下技术方案： 一种抑菌剂，包含金银花提取液、水溶性纳米银； 金银花提取液制备包括如下步骤：取干药材金银花，加水量为金银花重量的9倍，经95 °〇水浴提取4 h，再经过减压浓缩得到提取液；所得提取液经0.22 μ m滤膜过滤。最后提取 液经高压液相色谱法对提取液中绿原酸含量进行标准定量。
[0006] 抑制大肠杆菌0157:H7时金银花提取液、水溶性纳米银的体积比为75?100:1。 抑制藤黄微球菌时金银花提取液、水溶性纳米银的体积比为6. 73?12. 5:1。算体积比时金 银花提取液中绿原酸含量为23.62 mg/g，水溶性纳米银浓度为10 mg/mL。
[0007] 水溶性纳米银颗粒粒径为3?10 nm，纳米银外表包覆两性聚合物。
[0008] 水溶性纳米银粒径为3?10 nm，外表为羧基，依照下列方法制备：加水量为金银 花重量的9倍，经95 °C水浴提取4 h，再经过真空旋转浓缩仪得到提取液。所述水溶性纳 米银依照下列方法制备：取22.8 g十四烷酸溶于140 mL按2:5比例混合的甲醇和水中，向 溶液中加入4 g的氢氧化钠析出沉淀，过滤，将沉淀加入到100 mL浓度为10 mol/L水溶性 的硝酸银溶液中得到十四烷酸银；称取6.7 g 20 mmoL/L十四烷酸银于100 mL烧杯中，向 烧杯中加入58 mL40 mm〇L/L的三乙胺，80°C下电磁搅拌2 h，白色的十四烷酸银粉末逐渐变 成棕色，不溶的前体消失，加入20 mL丙酮沉淀析出，抽滤，用丙酮洗涤沉淀数次后，真空干 燥，即得到纳米银粒子粉末。依照本方法制备的水溶性纳米银颗粒与金银花提取液具有良 好的协同抗菌作用。
[0009] 本发明还涉及上所述抑菌剂在抑制大肠杆菌〇157:H7中的应用。
[0010] 本发明还涉及上述抑菌剂在抑制藤黄微球菌中的应用。
[0011] 本发明的有益效果是：本发明水溶性纳米银能有效增强金银花抑菌性能，降低金 银花抑菌剂的用量，两种药物的合用对抑制大肠杆菌0157:H7和藤黄微球菌起到协同作 用，同时本抑菌剂采用两种低剂量的抑菌物质，相对于使用高剂量的金银花或者水溶性纳 米银，更加的安全，可以作为安全可靠地外用涂覆剂等。
【专利附图】
【附图说明】
[0012] 图1金银花提取液与纳米银之比为100:1对大肠杆菌0157:H7协同抑菌作用 (图la 200 μ L金银花提取液对大肠杆菌0157: H7的抑制作用，图lb 2 μ L的纳米银 对大肠杆菌0157:Η7的抑制作用，图lc 100 μ L金银花提取液与1 μ L纳米银对大肠杆菌 0157 :Η7的协同抑菌作用。） 图2金银花提取液与纳米银之比为75:1对大肠杆菌0157:Η7协同抑菌作用 (图2a 150 μ L金银花提取液对大肠杆菌0157: Η7的抑制作用，图2b 2 μ L的纳米 银对大肠杆菌0157:Η7的抑制作用，图2c 75 μ L金银花提取液、1 μ L纳米银对大肠杆菌 0157 :Η7的协同抑菌作用。） 图3金银花提取液与纳米银对藤黄微球菌协同抑菌作用 图3a 200 μ L金银花提取液对藤黄微球菌的抑制作用，图3b 16 μ L的纳米银对藤黄 微球菌的抑制作用，图3c 100 μ L金银花提取液与8 μ L纳米银对藤黄微球菌的协同抑菌 作用。
[0013] 图4金银花提取液与纳米银对藤黄微球菌协同抑菌作用 图4a 100 μ L金银花提取液对藤黄微球菌的抑制作用，图4b 16 μ L的纳米银对藤黄 微球菌的抑制作用，图4c 50 μ L金银花提取液与8 μ L纳米银对藤黄微球菌的协同抑菌 作用。
【具体实施方式】
[0014] 实施例中所用试剂均为常规试剂，依照常规方式配制即可。
[0015] 实施例1 1、金银花提取液的制备过程：称取干药材金银花50 g，加水量为450 mL，在95 °C下提 取4 h，经过真空旋转浓缩仪后，用0.22 μπι滤膜除去提取液中的杂质和细菌，最后用高效 液相色谱法测得提取液中绿原酸含量为23.62 mg/g。
[0016] 2、水溶性银纳米颗粒制备： 取22. 8 g十四烷酸溶于140 mL按2:5比例混合的甲醇和水中，向溶液中加入4 g的 氢氧化钠析出沉淀，过滤，将沉淀加入到100 mL浓度为10 mol/L水溶性的硝酸银溶液中得 到十四烷酸银；称取6.7 g浓度为20 mm〇L/L十四烷酸银于100 mL烧杯中，向烧杯中加入 58 mL浓度为40 mm〇L/L的三乙胺，80°C下电磁搅拌2 h，白色的十四烷酸银粉末逐渐变成 棕色，不溶的前体消失，加入20 mL丙酮沉淀析出，抽滤，用丙酮洗涤沉淀数次后，真空干燥， 即得到纳米银粒子粉末。
[0017] 3、金银花提取液与水溶性纳米银协同抑菌作用。
[0018] a细菌的培养 挑取LB琼脂培养基上的大肠杆菌0157:H7的单菌落于10 mL LB肉汤培养基中，置于 37 °C培养箱中培养16 h，再按1 %的接种量接种于5 mL的LB肉汤培养基中，37 °C培养4 h后。取1 mL上述菌液用0. 1%的蛋白胨水连续稀释三个梯度，最终的菌液大约为106 CFU/ mL〇
[0019] b水溶性纳米银与金银花提取液在抑菌性能上的协同作用 分别取1 mL上述已稀释好的菌液于1. 5 mL灭菌的离心管中，向1号离心管中分别加 入200 yL金银花提取液(绿原酸含量为23. 62 mg/g，下同），向2号离心管中加入2 yL 浓度为10 mg/mL的水溶性纳米银，向3号离心管中加入100 μ L金银花提取液和1 μ L浓 度为10 mg/mL的水溶性纳米银，不加入任何上述抑菌剂。为保证每管液体最终体积相等， 差量用0.1%的蛋白胨水补齐。置于37 °C培养2 h。每组实验平行三次。
[0020] C平板计数 将实验组待测液用PBS连续稀释两个梯度，10°、10'10_2各取出200 μ L分别均匀涂布 在 LB固体平板上；空白组连续稀释四个梯度，从ΙΟ'ΙΟ'ΚΓ4三个梯度分别均涂布在 LB固体平板上。平板吹干后，37°C倒置培养12 h，长出菌落后计数，以30-300个菌落 形成单位（CFU)为有效的计数范围。每毫升原菌液活菌数=平板计数*稀释倍数*5 实验结果如下：
【权利要求】
1. 一种抑制藤黄微球菌的金银花抑菌剂，其特征在于由金银花提取液、水溶性纳米银 组成；所述金银花提取液制备包括如下步骤：加水量为金银花重量的9倍，经95 °C水浴 提取4 h，再经过真空旋转浓缩仪得到提取液；所述水溶性纳米银依照下列方法制备：取 22. 8 g十四烷酸溶于140 mL按2:5比例混合的甲醇和水中，向溶液中加入4 g的氢氧化 钠析出沉淀，过滤，将沉淀加入到100 mL浓度为10 mol/L水溶性的硝酸银溶液中得到十四 烷酸银；称取6.7 g浓度为20 mmol/L十四烷酸银于100 mL烧杯中，向烧杯中加入58 mL 浓度为40 mmol/L的三乙胺，80°C下电磁搅拌2 h，白色的十四烷酸银粉末逐渐变成棕色，不 溶的前体消失，加入20 mL丙酮沉淀析出，抽滤，用丙酮洗涤沉淀数次后，真空干燥，即得到 纳米银粒子粉末；所述菌为藤黄微球菌；抑制藤黄微球菌时金银花提取液、水溶性纳米银 的体积比为6. 73?12. 5:1，金银花提取液中绿原酸含量为23. 62mg/g，水溶性纳米银浓度 为 10mg/mL〇
2. 如权利要求1所述的金银花抑菌剂，其特征在于所得提取液经0. 22 μ m滤膜过滤。
3. 如权利要求Γ2任一所述金银花抑菌剂在制备抑制藤黄微球菌药物中的应用。
【文档编号】A61K36/355GK104147076SQ201410383216
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2012年9月28日 优先权日:2012年9月28日
【发明者】许恒毅, 魏华, 曲锋, 熊勇华, 赖卫华, 徐锋, 万翠香, 郭亮 申请人:南昌大学