龟裂马勃菌多糖在制备抗氧化剂中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了龟裂马勃菌多糖在制备抗氧化剂中的应用。本发明发明人在中国东北小兴安岭，收集到14种常见的野生大型真菌。通过三种方法测试了14种大型真菌多糖的抗氧化活性，结果发现其中抗氧化活性最强的为龟裂马勃菌(Handkea utriformis)，它的清除自由基活性为535.8μmol/g TEAC，还原力活性为5.94mmol Fe/g，金属螯合力为274.8μmol Fe2+/g，本发明的提出填补了一些大型真菌多糖研究的空白，尤其是龟裂马勃除了抗氧化活性较强外兼具抗酪氨酸酶活性。本发明的提出为中国东北野生大型真菌的合理利用提供了基础。
【专利说明】龟裂马勃菌多糖在制备抗氧化剂中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及龟裂马勃菌多糖的新用途，特别涉及龟裂马勃菌多糖在制备抗氧化剂 中的应用，还涉及龟裂马勃菌多糖的提取方法。
【背景技术】
[0002] 大型真菌（Macrofungi或Macromycetes)，是指那些能够形成肉眼可见的大型 子实体的真菌，它们多数属于真菌界的担子菌门（Basidiomycota)，其余的属于子囊菌门 (Ascomycota)。有性孢子产生在外部微小棒状结构的大型真菌隶属于担子菌门；有性孢子 产生在微小囊状结构的大型真菌隶属于子囊菌门。
[0003] 大型真菌被认为是重要的天然资源，根据用途可以将大型真菌分为食用菌和药用 菌。大型真菌富含多糖、氨基酸、维生素等营养物质，被认为是低脂肪、高营养的健康食品。 一些大型真菌被发现了具有抗肿瘤、抗氧化、抗菌、抗糖尿病和降血脂的作用，这些活性和 大型真菌产生的多糖、不饱和脂肪酸、蛋白酶等活性成分相关。大型真菌除了食用与药用 夕卜，还被应用在其它很多方面。例如，甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的活性母核，最初就是在大 型真菌中分离出来的。
[0004] 大型真菌根据它的营养方式可以分为，寄生型大型真菌、腐生型大型真菌。主要从 活体生物，获取营养的大型真菌，被称为寄生型大型真菌；从非活体生物中，获取营养的为 腐生真菌。寄生菌中一部分真菌可以和寄主植物形成共生菌根，被称为外生菌根型大型真 菌。相比较而言，腐生菌较易人工培养，然后是寄生菌，菌根菌较难人工培养。
[0005] 我们国家幅员辽阔，被认为是生物多样性最丰富的国家之一，被记载的大型真菌 有3800种以上，其中伞菌类（如，蜜环菌）约有1600种，多孔菌类（如，云芝菌）约1300 种，腹菌（如，马勃菌）约300种，胶质类（如，木耳菌）约100种。自古以来，中国人就有 利用大型真菌的传统。食用菌方面：早在6000至7000年前我们祖先就开始采食蘑菇了， 文字记载的采食蘑菇的历史可以追溯至2000多年前，中国已知的大型真菌近900种，其中 有很多大型真菌被人工驯化培养，中国也是全世界食用菌产量最高的国家，超过总量50% 的食用菌产自中国。由于东西方饮食习惯的差距很大，在许多国家认为是有毒的大型真菌， 但在中国经过加工后就可以被食用。自古以来，我国就有利用大型真菌入药的习俗，例如灵 芝、冬虫夏草这些著名的中药都属于大型真菌。
[0006] 本发明的目的是通过分子鉴定技术与形态学鉴定技术相结合的方法鉴定收集到 的14种东北常见的野生大型真菌，调查这14种大型真菌的多种生物活性。通过对14种野 生大型真菌的研究，为进一步开发利用的这些真菌提供理论依据，使一些闲置的、可再生的 资源得到合理开发利用。
【发明内容】
[0007] 本发明发明人在中国东北小兴安岭，收集到14种常见的野生大型真菌。首先对 这14种大型真菌进行鉴定，并且对它们的多糖含量、抗氧化、抗酪氨酸酶等活性进行研究。 通过形态学和分子生物学两种方法鉴定大型真菌，发现它们分别属于6个科：其中多孔科4 种、口蘑科3种、红菇科3种、环柄菇科3种、马勃科1种与铆钉菇科1种。对这14种大型 真菌的粗多糖进行了提取，然后对粗多糖提取物进行了沉淀、脱脂与透析来进行纯化，获得 了水溶性的纯化后的多糖。
[0008] 接下来，本发明通过三种方法测试了 14种大型真菌多糖的抗氧化活性，对于清除 自由基ABTS'+活性方面大型真菌的纯化后多糖PPS的活性为16. 9至535. 8 ii mol/g TEAC， 在铁离子还原力方面纯化后多糖PPS的活性为0. 23至5. 94mmol Fe/g，在亚铁离子螯合 力方面纯化后多糖PPS的活性为0. 70至484. 61 ii mol Fe2+/g发现有6种大型真菌多糖的 抗氧化活性较强，而且这6种大型真菌都可以食用。这6种真菌分别是龟裂马勃、乳突环 柄菇、奥氏蜜环菌、高大环柄菇、紫丁香蘑和黄小蜜环菌。最强的为龟裂马勃菌（Handkea utriformis)，它的清除自由基活性为535.8 iimol/g TEAC，还原力活性为5. 94mmol Fe/g， 金属螯合力为274. 8 ii mol Fe2+/g，都是位于14种大型真菌的前两位的。
[0009] 故，在此研究的基础上，本发明提出了龟裂马勃菌多糖在制备抗氧化剂中的应用。
[0010] 在本发明中，优选的，所述的龟裂马勃菌多糖是通过以下方法提取得到的：
[0011] (1)将龟裂马勃菌的子实体，在30-50°C条件下烘干，直到质量不再变化，用粉碎 机把烘干的子实体磨成粉；
[0012] ⑵用丙酮将干燥的龟裂马勃菌粉在20-30°C条件下浸提三次，每次2-4小时，离 心去上清，沉淀用沸水提取3个小时，离心，除去沉淀后，收集上清液；
[0013] (3)将步骤⑵收集得到的上清液与乙醇按照1:4-6的体积比混合，在O-KTC下， 使多糖沉淀，离心分离，获得沉淀；
[0014] (4)沉淀溶解在水中，然后用冻干法，得到龟裂马勃菌多糖的粗提取物。
[0015] 在本发明中，更优选的，所述方法还包括将得到龟裂马勃菌多糖的粗提取物进一 步脱蛋白纯化、透析以及再次利用乙醇沉淀，具体操作为：
[0016] (1)将氯仿与正丁醇混合配制成Sevag试剂，然后将龟裂马勃菌多糖的粗提取物 与Sevag试剂混合，搅拌，离心；溶液分三层，上层为多糖溶液，下层为有机试剂，中间层为 去除的蛋白层，收集上层的多糖溶液；
[0017] (2)将收集的多糖溶液按照步骤（1)方法重复处理，直到去除蛋白质；
[0018] (3)用去离子水进行透析，透析袋的截留分子量为3500道尔顿，去除小分子，获得 的纯化的多糖溶液，加入5倍体积的乙醇，在4°C下，使多糖沉淀，离心分离，获得沉淀；获得 的沉淀，再用水溶解，冻干，即为水溶性的纯化后的多糖。
[0019] 其中，优选的，所述的Sevag试剂是将氯仿与正丁醇按照体积比5:1混合配制而 成。
[0020] 其中，优选的，将所述的龟裂马勃菌多糖的粗提取物先溶解于少量水中，然后与 Sevag试剂按照体积比为5:1进行混合。
[0021] 其中，优选的，在步骤（3)中，还包括将获得的沉淀，再用水溶解，然后再次加入5 倍体积的乙醇，在4°C下，使多糖沉淀，离心分离，获得沉淀，以更加充分去除醇溶性物质，最 后再将沉淀溶解于水中，冻干，即为水溶性的纯化后的多糖。
[0022] 本发明还测试了 14种大型真菌多糖浓度在lmg/ml时对酪氨酸酶的抑制率，其中 龟裂马勃菌和血红铆钉菇对酪氨酸酶的抑制率超过了 50%，分别为61 %和85%，通过测试 这两种大型真菌其它浓度的多糖对酪氨酸酶的抑制率，得到它们的IC5tl值能达到0. 78mg/ ml和0. 46mg/ml，尤其是血红铆钉菇的多糖的活性甚至接近于熊果苷IC5tl值（0. 43mg/ml)。 进一步实验发现，血红铆钉菇的应该属于复合型酪氨酸酶抑制剂。
[0023] 进一步的，本发明还提出了一种大型真菌多糖的提取方法，其特征在于利用丙酮、 Sevag试剂、乙醇以及透析的方法去除包括非极性、弱极性物质、蛋白、醇溶性物质以及分子 量小于3500道尔顿的小分子在内的非多糖类物质，具体包括以下步骤：
[0024] (1)将大型真菌的子实体，在30-50°C条件下烘干，直到质量不再变化，用粉碎机 把烘干的子实体磨成粉；
[0025] (2)用丙酮将干燥的大型真菌菌粉在20-30°C条件下浸提三次，每次2-4小时，离 心去上清，然后用沸水提取3个小时，离心，除去沉淀后，收集上清液；
[0026] (3)将步骤⑵收集得到的上清液与乙醇按照1:4-6的体积比混合，在O-KTC下， 使多糖沉淀，离心分离，获得沉淀；
[0027] (4)沉淀溶解在水中，然后用冻干法，得到大型真菌多糖的粗提取物。
[0028] 其中，优选的，还包括将得到大型真菌多糖的粗提取物进一步脱蛋白纯化、透析以 及再次利用乙醇沉淀，具体操作为：
[0029] (1)将氯仿与正丁醇混合配制成Sevag试剂，然后将大型真菌多糖的粗提取物与 Sevag试剂混合，搅拌，离心；溶液分三层，上层为多糖溶液，下层为有机试剂，中间层为去 除的蛋白层，收集上层的多糖溶液；
[0030] (2)将收集的多糖溶液按照步骤（1)方法重复处理，直到去除蛋白质；
[0031] (3)用去离子水进行透析，透析袋的截留分子量为3500道尔顿，去除小分子，获得 的纯化的多糖溶液，加入5倍体积的乙醇，在4°C下，使多糖沉淀，离心分离，获得沉淀。获得 的沉淀，再用水溶解，冻干，即为水溶性的纯化后的多糖。
[0032] 其中，优选的，所述的Sevag试剂是将氯仿与正丁醇按照体积比5:1混合配制而 成；更优选的，所述的龟裂马勃菌多糖的粗提取物先溶解于少量水中，然后与Sevag试剂按 照体积比为5:1进行混合。
[0033] 其中，优选的，在步骤（3)中，还包括将获得的沉淀，再用水溶解，然后再次加入5 倍体积的乙醇，在4°C下，使多糖沉淀，离心分离，获得沉淀，以更加充分去除醇溶性物质，最 后再将沉淀溶解于水中，冻干，即为水溶性的纯化后的多糖。
[0034] 本发明的提出填补了一些大型真菌多糖研究的空白，如龟裂马勃、乳突环柄菇和 黄小蜜环菌的多糖以前很少见到报道，通过本研究发现它们的多糖具有抗氧化活性，尤其 是龟裂马勃除了抗氧化活性较强外兼具抗酪氨酸酶活性。另外还发现一些大型真菌的多糖 虽然曾经被研究过，但是通过本研究发现了它的新活性，如血红铆钉菇具有很好的抗酪氨 酸酶活性。本发明的提出为中国东北野生大型真菌的合理利用提供了基础。
【专利附图】
【附图说明】
[0035] 图1为实施例1中多糖制备的技术路线图；
[0036] 图2为大型真菌多糖的3种抗氧化活性测定结果；
[0037] 图3为大型真菌多糖（lmg/ml)的抗酪氨酸酶活性测定结果。
【具体实施方式】
[0038] 以下结合实施例对本发明上述的和另外的技术特征和优点作更详细的说明。应当 理解的是，以下所述的实施例，仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的 范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术 方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
[0039] 本发明实施例中所涉及的实验材料、试剂与仪器
[0040] 1、试验材料
[0041] 2011年的9月，在中国东北小兴安岭收集了 14种东北常见的大型野生真菌。
[0042] 2、试剂与仪器
[0043] 试剂：丙酮、无水乙醇、氯仿、苯酚等分析纯，来自北京化学试剂公司。分子鉴定用 的蛋白酶K，Taq酶、dNTP等试剂来自北京天根生化科技有限公司。酪氨酸酶等来自Sigma 化学试剂有限公司。玻璃棒、三角瓶、烧杯、冷凝管，胶头滴管、移液管、容量瓶、抽滤瓶、蓝盖 瓶、西林瓶、玻璃干燥器、圆底烧瓶等玻璃器皿，来自蜀牛玻璃仪器有限公司。旋转蒸发仪 RE-52AA来自上海亚荣生化仪器厂。舒美KQ-600DE数控超声波清洗仪，来自昆山市超声仪 器有限公司。85-2恒温磁力搅拌器来自海门麒麟医用仪器厂。98-1-C数字控温电热套与 101-1AB鼓风干燥箱来自天津市泰斯特仪器有限公司，冷冻干燥机，来自博医康实验仪器有 限公司，SHB-III循环水式多用真空泵来自南京文尔仪器设备有限公司。冷冻离心机，来自 湖南湘仪离心机仪器有限公司。各种量程的移液器，来自上海大龙医疗设备有限公司。电 泳设备来自北京六一仪器厂。PCR仪PCR System9700,来自加拿大Applied Biosystems公 司。
[0044] 实施例1大型真菌的分子鉴定
[0045] 方法：
[0046] 大型真菌的分子鉴定，利用PCR技术，选择通用引物扩增大型真菌的 ITS(Internal Transcribed Spacer, ITS内部转录间隔区）序列，然后进行测序和比对来完 成的，具体步骤如下：
[0047] 1.收集到的大型真菌在鼓风干燥箱内35°C下干燥。
[0048]2. IOmL 的 IM 浓度的 pH 为 8. 0 的 Tris-Hcl，加入 20ml 的 0? 5M 浓度的 pH 为 8. 0 的EDTA，再加入5ml的5M浓度的NaCl，加无菌水定容至100ml，配置成DNA提取缓冲液 IOOml (即，IOOmM Tris-HCl，IOOmM EDTA pH8. 0,250mM NaCl)。
[0049] 3.取50mg大型真菌的子实体，在液氮中研磨成粉末，装入至1.5ml的离心管中，力口 入500 iU提取缓冲液，用涡旋振荡器混合、重悬。
[0050] 4?加入125iU的10%的SDS，然后再加入12. 5iil浓度为20mg/ml的蛋白酶K， 37°C 水浴 lh。
[0051]5. 12000rpm下，离心3min，用移液器取上清，弃沉淀。上清中加入500ii 1异丙醇， 混勻，室温下5至IOmin。
[0052] 6. 12000rpm下，离心5min，用移液器弃掉上清，沉淀用Iml的70%乙醇洗一次， 12000rpm下离心3min，用移液器弃掉上清。留沉淀，自然干燥，得到DNA粗提物。
[0053] 7.在DNA粗提物中加入500 ill的TE，充分溶解DNA之后，进行酚仿抽提。等体积 Tris饱和酚抽提一次，12000rpm下离心5min取上清；等体积苯酚氯仿抽提一次，12000rpm 离心下5min取上清；等体积氯仿抽提一次，12000rpm离心3min取上清，去除杂质。
[0054] 8.加入1/10体积的3M浓度的NaAc，2倍体积的无水乙醇混勻，冰浴30min至Ih 沉淀DNA，12000rpm下离心5min，用移液器去上清。沉淀（也许不可见）用70%乙醇ImL 清洗一次（用枪头），室温下干燥约IOmin。
[0055] 9. 30-50 ill 的 TE 溶解 DNA，加入 1 至 2 ill 的 RNA 酶，在 37°C 水浴 lh。L 5 ill 溴 酚兰加5yL样品，进行电泳。
[0056] 10?将总 DNA 稀释 50 倍，以真菌通用引物 ITSl (5'-TCCGATGGTGAACCTGCGG-3，）与 ITS4(5' -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）为扩增引物对，进行PCR反应，扩增目标真菌的ITS 序列，反应体系如下：10倍缓冲液25 iil，dNTP(10mM)l. Oiil，引物I(IOiiM) 2.5 iil，引物 2(10iiM)2.5ii 1，模板 DNA(10ng/ii L)L0ii 1，Taq DNA 聚合物（2. 5u/iiL) 0.5 ii 1，无菌去 离子水25 u 1。
[0057] 11.混匀上述溶液，离心后，放入PCR仪。按下列设置进行反应：94°C下3min，然后 重复括号中的循环（循环：94°C下，Imin ;然后52°C下，Imin ;72°C下，2min)30次，然后72°C 下 8min。
[0058] 12. PCR完成后进行电泳检测扩增出的ITS序列，纯化目标序列。
[0059] 13.纯化后的ITS序列利用引物ITSl和ITS4进行测序，测序结果利用http:// www. ncbi. nlm. nih. gov 网立占的 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)进l：匕对。
[0060] 14?结合形态学观察，鉴定大型真菌，提交测序结果至http://www. ncbi. nlm. nih. gov 网站的 GenBank 中，获得 DNA 序列登录号（Accession Number)。
[0061] 结果：
[0062] 大型真菌的分子鉴定结果如下表1所示：
[0063] 表1大型真菌的分子鉴定结果表
[0064]
【权利要求】
1. 龟裂马勃菌多糖在制备抗氧化剂中的应用。
2. 如权利要求1所述的应用，其特征在于所述的龟裂马勃菌多糖是通过以下方法提取 得到的： (1) 将龟裂马勃菌的子实体，在30-50°C条件下烘干，直到质量不再变化，用粉碎机把 烘干的子实体磨成粉； (2) 用丙酮将干燥的龟裂马勃菌粉在20-30°C条件下浸提三次，每次2-4小时，离心去 上清，沉淀用沸水提取3个小时，离心，除去沉淀后，收集上清液； (3) 将步骤（2)收集得到的上清液与乙醇按照1:4-6的体积比混合，在O-KTC下，使多 糖沉淀，离心分离，获得沉淀； (4) 沉淀溶解在水中，然后用冻干法，得到龟裂马勃菌多糖的粗提取物。
3. 如权利要求2所述的应用，其特征在于还包括将得到龟裂马勃菌多糖的粗提取物进 一步脱蛋白纯化、透析以及再次利用乙醇沉淀，具体操作为： (1) 将氯仿与正丁醇混合配制成Sevag试剂，然后将龟裂马勃菌多糖的粗提取物与 Sevag试剂混合，搅拌，离心；溶液分三层，上层为多糖溶液，下层为有机试剂，中间层为去 除的蛋白层，收集上层的多糖溶液； (2) 将收集的多糖溶液按照步骤（1)方法重复处理，直到去除蛋白质； (3) 用去离子水进行透析，透析袋的截留分子量为3500道尔顿，去除小分子，获得的纯 化的多糖溶液，加入5倍体积的乙醇，在4°C下，使多糖沉淀，离心分离，获得沉淀；获得的沉 淀，再用水溶解，冻干，即为水溶性的纯化后的多糖。
4. 如权利要求3所述的应用，其特征在于所述的Sevag试剂是将氯仿与正丁醇按照体 积比5:1混合配制而成。
5. 如权利要求3所述的应用，其特征在于将所述的龟裂马勃菌多糖的粗提取物先溶解 于少量水中，然后与Sevag试剂按照体积比为5:1进行混合。
6. 如权利要求3所述的应用，其特征在于在步骤（3)中，还包括将获得的沉淀，再用水 溶解，然后再次加入5倍体积的乙醇，在4°C下，使多糖沉淀，离心分离，获得沉淀，以更加充 分去除醇溶性物质，最后再将沉淀溶解于水中，冻干，即为水溶性的纯化后的多糖。
7. -种大型真菌多糖的提取方法，其特征在于利用丙酮、Sevag试剂、乙醇以及透析的 方法去除包括非极性、弱极性物质、蛋白、醇溶性物质以及分子量小于3500道尔顿的小分 子在内的非多糖类物质，具体包括以下步骤： (1) 将大型真菌的子实体，在30-50°C条件下烘干，直到质量不再变化，用粉碎机把烘 干的子实体磨成粉； (2) 用丙酮将干燥的大型真菌菌粉在20-30°C条件下浸提三次，每次2-4小时，离心去 上清，然后用沸水提取3个小时，离心，除去沉淀后，收集上清液； (3) 将步骤（2)收集得到的上清液与乙醇按照1:4-6的体积比混合，在O-KTC下，使多 糖沉淀，离心分离，获得沉淀； (4) 沉淀溶解在水中，然后用冻干法，得到大型真菌多糖的粗提取物。
8. 如权利要求7所述的方法，其特征在于还包括将得到大型真菌多糖的粗提取物进一 步脱蛋白纯化、透析以及再次利用乙醇沉淀，具体操作为： (1)将氯仿与正丁醇混合配制成Sevag试剂，然后将大型真菌多糖的粗提取物与Sevag 试剂混合，搅拌，离心；溶液分三层，上层为多糖溶液，下层为有机试剂，中间层为去除的蛋 白层，收集上层的多糖溶液； (2) 将收集的多糖溶液按照步骤（1)方法重复处理，直到去除蛋白质； (3) 用去离子水进行透析，透析袋的截留分子量为3500道尔顿，去除小分子，获得的纯 化的多糖溶液，加入5倍体积的乙醇，在4°C下，使多糖沉淀，离心分离，获得沉淀；获得的沉 淀，再用水溶解，冻干，即为水溶性的纯化后的多糖。
9. 如权利要求8所述的方法，其特征在于所述的Sevag试剂是将氯仿与正丁醇按照体 积比5:1混合配制而成；优选的，所述的龟裂马勃菌多糖的粗提取物先溶解于少量水中，然 后与Sevag试剂按照体积比为5:1进行混合。
10. 如权利要求8所述的方法，其特征在于在步骤（3)中，还包括将获得的沉淀，再用水 溶解，然后再次加入5倍体积的乙醇，在4°C下，使多糖沉淀，离心分离，获得沉淀，以更加充 分去除醇溶性物质，最后再将沉淀溶解于水中，冻干，即为水溶性的纯化后的多糖。
【文档编号】A61P39/06GK104306392SQ201410542186
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年10月14日 优先权日:2014年10月14日
【发明者】徐利剑, 吴建勇, 孟威, 王庆贵, 张志 , 李泽宇, 曹聪, 王健, 王兵兵 申请人:黑龙江大学