一种积雪草提取物及其制备与应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种积雪草提取物，其制备方法包括以下步骤：用乙醇溶液作溶剂，用超声波提取法对积雪草进行粗提；用AB-8树脂分离柱及用乙醇溶液作为洗脱剂分离出有效组分，其中30％-50％乙醇和51％-75％乙醇溶液洗脱下来的目标组分即为所述积雪草提取物。本发明的积雪草提取物无需NGF诱导就能促进神经元模型PC12细胞增殖、分化，可应用于抑郁症，及各种神经损伤、神经元细胞凋亡相关疾病的治疗。本发明提供的提取方法工艺简单、成本低廉、效率高。
【专利说明】
一种积雪草提取物及其制备与应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种积雪草提取物的制备与应用。
【背景技术】
[0002]根据世界卫生组织的推断，到2030年，抑郁症的致残和致死率将紧随心脏病之后位列第二。经济合作与发展组织在2008年的一份报告指出，抑郁症是代价最高的精神疾病之一，并且患者人数众多，严重影响了劳动力。在欧盟，抑郁症产生的相关费用超过1180亿欧元(合9580亿元人民币)。这相当于整个欧盟地区生产总值的1%。因此，加强抑郁症的防治，寻找积极、有效的治疗方法，具有非常重要的社会和经济意义。
[0003]临床应用最广泛的抗抑郁药，如:选择性5-HT再摄取抑制剂(SSRI)、5_HT/去甲肾上腺素(NE)再摄取抑制剂(SNRI)等都是针对增加突触间隙内单胺类递质浓度，然而上述抗抑郁药物快速引起脑内单胺递质的变化与用药数周后才产生临床疗效之间的矛盾，使得抑郁症的病因学研究已经不仅仅局限于中枢单胺类神经递质系统功能的失调。
[0004]目前抑郁症的神经发生假说引起了科学家的关注，即海马神经发生与抑郁症的发病机制有关，其原因就在于大量的动物实验和临床研究表明在抑郁症(尤其是应激造成的抑郁状态)时神经发生是显著减少的，而抗抑郁治疗后能逆转减少的神经发生。抑郁症患者的脑组织尸检中发现有海马体积下降，并伴有神经细胞萎缩和缺失。这些改变可以被抗抑郁药物治疗所逆转。因此能够刺激神经发生的药物将成为潜在的新型抗抑郁药物。
[0005]积雪草提取物在神经增长因子Nerve Growth Factor (NGF)存在的条件下，促进神经元模型SH-SY5Y细胞分化已有文献记载，但是，也存在一些缺陷，该种提取物促进神经发生需要以价格昂贵的神经生长因子为前提，因此成本较高。所以，本领域技术人员致力于开发一种无需NGF诱导就能促进神经发生的积雪草提取物。
【发明内容】
[0006]有鉴于现有技术存在成本较高的缺陷，本发明所要解决的技术问题是以往积雪草提取物需要使用NGF作为诱导，才可以刺激细胞系增殖、分化的问题。
[0007]为实现上述目的，本发明提供了一种积雪草提取物，该提取物的提取步骤为:
[0008]一.用乙醇溶液作溶剂，用超声波提取法对积雪草进行粗提；
[0009]二.用AB-8树脂分离柱及用乙醇溶液作为洗脱剂分离出有效组分，按水、10 % -20 %乙醇、30 % -50 %乙醇、51 % -75 %乙醇的顺序洗脱，其中30 % -50 %和51%-75%乙醇洗脱下来的组分浓缩后即为所述积雪草提取物。
[0010]进一步地，步骤一的具体操作为:
[0011]I)将积雪草浸入乙醇溶液中，用超声提取至少I次，合并提取液；
[0012]2)将提取液减压浓缩至无醇味，离心，弃去沉淀，即得积雪草粗提液，准备上样。
[0013]优选地，步骤一中所述乙醇溶液的浓度为70% -80%，积雪草与乙醇溶液的比例为每I克积雪草添加8-12mL乙醇溶液。
[0014]优选地，步骤一中所述超声提取一次的时间为I小时，提取的次数为2次；
[0015]优选地，步骤一的第2)步操作中所述离心的转速为8000转/分，离心时间为15分钟。
[0016]进一步地，步骤二的具体操作为:
[0017]I)称取与积雪草原料等重的AB-8树脂，经过醇洗和水洗处理后装柱，加水冲洗柱子直至柱中不再含有气泡；
[0018]2)上样，静置吸附I小时后按水、10% -20%乙醇、30% -50%乙醇、51% -75%乙醇的顺序进行洗脱；
[0019]3)将各个馏分分别减压浓缩至无醇味，其中用30% -50%乙醇和51% -75%乙醇洗脱出的馏分即为所述积雪草提取物。
[0020]优选地，上述步骤二的第2)步操作的流出速度为每5分钟100ml。
[0021]优选地，上述步骤二的第2)步操作使用的洗脱液的量分别为3柱体积的水，5柱体积的10 % -20 %乙醇，3柱体积的30 % -50 %乙醇，3柱体积的51 % -75 %乙醇(注:以树脂的体积为一柱)。
[0022]本发明的一个最佳实施例为，采用3柱体积的水，5柱体积的20 %乙醇，3柱体积的50%乙醇、3柱体积的75%乙醇的顺序进行洗脱。其中效果最佳的积雪草提取物为75%乙醇洗脱的第2柱，效果次佳的积雪草提取物为50%乙醇洗脱的第3柱。
[0023]本发明具有以下有益效果:
[0024]1.本发明提供了一种积雪草提取物，该提取物无需NGF诱导就能促进神经元模型PC12细胞增殖、分化。
[0025]2.本发明提供的积雪草提取物可应用于抑郁症，及各种神经损伤、神经元细胞凋亡相关疾病的治疗。
[0026]3.本发明提供的提取方法工艺简单、成本低廉、效率高。
【专利附图】
【附图说明】
[0027]图1是实施例2中经不同浓度积雪草提取物孵育72小时后，PC12细胞突触的长度的分布比较图；
[0028]图2是实施例2中蛋白质印迹法检测加积雪草提取物孵育72小时后PC12细胞中NF68蛋白和GAPDH蛋白表达含量的结果。
【具体实施方式】
[0029]下面对本发明的实施例作详细说明:本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
[0030]实施例1
[0031]将积雪草浸入75%乙醇溶液中，每I克积雪草添加1mL乙醇溶液，用超声提取2次，每次I小时，合并提取液，减压浓缩至无醇味，离心(8000转/分，15分钟)，弃去沉淀，准备上样。
[0032]称取与积雪草原料等重的AB-8树脂，经过醇洗和水洗处理后装柱，加水冲洗柱子直至柱中不再含有气泡。
[0033]上样，静置吸附I小时后按水、20%乙醇、50%乙醇、75%乙醇、95%乙醇的顺序进行洗脱，以5分钟10ml的流量承接提取液。分别使用3柱、5柱、3柱、3柱、2柱体积溶液进行洗脱(注:以树脂的体积为一柱)。所得洗脱液每柱分开减压浓缩至无醇味。
[0034]实施例2药效比较实验
[0035]将PC12细胞接种于96孔板，进行cck_8毒性测试，得到药物的使用剂量。之后，将PC12细胞接种于12孔板，药物孵育72小时后，观察PC12细胞突触的长度，显微镜下拍照，并用软件进行数据统计分析，与正常组进行比对，得到药效最好的是75%乙醇洗脱的第2柱和次好的50%乙醇洗脱的第3柱。75%乙醇洗脱的第2柱与不加积雪草提取物的正常PC12比较的结果如图1所示，图1中O代表不加积雪草提取物的正常组，1:100代表将75%乙醇洗脱的第2柱积雪草提取物稀释100倍孵育的处理组，I:50代表将75%乙醇洗脱的第2柱积雪草提取物稀释50倍孵育的处理组，经积雪草提取物处理后，分化的PC12细胞的比例显著增加，突触长度在15-30 μ m和>30 μ m的PC12细胞数目比例均达到正常组的两倍，表明积雪草目标提取物可以显著促进PC12突触增长，诱导PC12细胞进行分化。即没有生长因子NGF的培养环境下，两种稀释比例的积雪草目标提取物对PC12细胞分化具有明显的刺激作用。
[0036]最后采用蛋白质印迹法检测加药孵育72小时后PC12细胞中NF68和GAPDH的蛋白质表达含量，同样使用75%乙醇洗脱的第2柱的积雪草提取物，并以浓度为50ng/mL的NGF处理组作为阳性对照组，结果如图2所示，与统计学的结果类似，用稀释比例为1:50的75%乙醇洗脱的第2柱积雪草提取物处理组蛋白质相对表达量显著上调。结果表明:积雪草目标提取物具有显著的促进PC12细胞分化的作用。
[0037]以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本【技术领域】中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
【权利要求】
1.一种积雪草提取物，其特征在于，其制备方法包括以下步骤: 一.用乙醇溶液作溶剂，用超声波提取法对积雪草进行粗提； 二.用AB-8树脂分离柱及用乙醇溶液作为洗脱剂分离出有效组分，按水、10%-20%乙醇、30% -50%乙醇、51-75%乙醇的顺序洗脱，其中30% -50%乙醇和51% -75%乙醇洗脱下来的目标组分浓缩后即为所述积雪草提取物。
2.一种积雪草提取物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: 一.用乙醇溶液作溶剂，用超声波提取法对积雪草进行粗提； 二.用AB-8树脂分离柱及用乙醇溶液作为洗脱剂分离出有效组分，按水、10%-20%乙醇、30% -50%乙醇、51% -75%乙醇的顺序洗脱，其中30% -50%乙醇和51 % -75%乙醇洗脱下来的目标组分浓缩后即为所述积雪草提取物。
3.根据权利要求2所述的积雪草提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤一的具体操作为: 1)将积雪草浸入乙醇溶液中，用超声提取至少I次，合并提取液； 2)将提取液减压浓缩至无醇味，离心，弃去沉淀，即得积雪草粗提液，准备上样。
4.根据权利要求3所述的积雪草提取物的制备方法，其特征在于，步骤一中所述乙醇溶液的浓度为70% -80%，加入乙醇溶液的量为每I克积雪草添加8-12mL乙醇溶液。
5.根据权利要求3所述的积雪草提取物的制备方法，其特征在于，步骤一中所述超声提取一次的时间为I小时，提取的次数为2次。
6.根据权利要求2所述的积雪草提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤二的具体操作为: 1)称取与积雪草原料等重的AB-8树脂，经过醇洗和水洗处理后装柱，加水冲洗柱子直至柱中不再含有气泡； 2)上样，静置吸附I小时后，按水、10%-20%乙醇、30% -50%乙醇、51% -75%乙醇的顺序进行洗脱； 3)将各个馏分分别减压浓缩至无醇味，其中用30%-50%乙醇和51% -75%乙醇洗脱出的馏分即为所述积雪草提取物。
7.根据权利要求6所述的积雪草提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤二的第2)步操作的流出速度为每5分钟100ml。
8.根据权利要求6所述的积雪草提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤二的第2)步操作使用的洗脱液的量分别为3柱体积的水，5柱体积的10% -20%乙醇，3柱体积的30% -50%乙醇，3柱体积的51% -75%乙醇。
9.根据权利要求6所述的积雪草提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤二的第2)步操作使用的洗脱液的浓度和用量分别为3柱体积的水，5柱体积的20%乙醇，3柱体积的50 %乙醇、3柱体积的75 %乙醇。
10.根据权利要求2-9所述方法制备的积雪草提取物在治疗抑郁症、神经损伤、神经元细胞凋亡相关疾病药物中的应用。
【文档编号】A61P25/00GK104274504SQ201410561649
【公开日】2015年1月14日 申请日期:2014年10月21日 优先权日:2014年10月21日
【发明者】姜慧, 吕君蔚, 丁显廷, 林津津 申请人:上海交通大学