干扰素诱导蛋白p204在制备抗肺癌转移药物中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种干扰素诱导蛋白p204在制备抗肺癌转移药物中的应用。利用小鼠的体外淋巴细胞转化实验与体内荷瘤实验表明本发明所述干扰素诱导蛋白p204可以显著抑制肺癌细胞的转移，预示该干扰素诱导蛋白有望成为抗肺癌转移研究的重要靶点，为制备抗肺癌转移药物提供了基础，具有良好的开发应用前景。
【专利说明】干扰素诱导蛋白P204在制备抗肺癌转移药物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种干扰素诱导蛋白的应用，尤其涉及一种干扰素诱导蛋白P204在 制备抗肺癌转移药物中的应用，属于肿瘤生物学领域。
【背景技术】
[0002] 干扰素诱导蛋白p204(如下简称p204)是一种核蛋白，是干扰素（IFN)诱导产 生的P200蛋白家族（IFI-200) -员。该蛋白含有640个氨基酸残基（详见UniProtKB/ Swiss-Prot :P15092. 2)，分子量为72kDa，其N末端（aa 1-216)有核定位信号（NLS)和核输 出信号（NES) ;C末端含有两个保守的HIN-200结构域，Rb蛋白的结合基序定位其上。p204 在心脏、胸腺、脾脏、骨髓等器官中有大量表达。
[0003] 实验证明p204参与多种重要信号通路，它可以通过与下游转录因子、信号蛋白的 结合来调节其活性，并在组织分化中起重要作用，如P204具有调节骨骼和肌肉发育以及巨 噬细胞活性的功能。刘等研究发现，在成骨分化过程中，P204依靠其蛋白上的两个非重叠 片段与Cbfal蛋白协同作用，这一过程需要pRb蛋白作为两者的连接桥梁，p204通过C末 端LXCXE基序与pRb蛋白结合，最终与Cbfal和pRb蛋白组成了一个三元复合体共同参与 成骨细胞发育。
[0004] 2010年Unterholzner报道人类IFI16及其鼠源蛋白p204是细胞质内病毒DNA的 感受器，P204可以通过HIN-200结构域探知胞质内非AT丰富的dsDNA，并在探测到DNA存 在后与STING蛋白相互作用，激活TBKI所介导的IRF3磷酸化途径并直接活化NF-κ B(含 有p65和p60两个亚基）。上述被激活的转录因子会入核诱导IFN- α / β的表达。但P204 在抗肿瘤转移方面的研究鲜见报道。
[0005]目前癌症是威胁人类健康的头号杀手，全球因癌症死亡的人数正逐年上升，据世 界卫生组织估计，随着世界人口日趋老龄化，预计到2030年可能将超过1310万。这其中大 多数患者并非死于原发性癌，而是死于转移性癌。因此，研究和开发抗肿瘤转移的生物药物 具有极其重要的意义。经检索，有关干扰素诱导蛋白P204在制备抗肺癌转移药物中的应用 未见报道。
【发明内容】
[0006] 针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种干扰素诱导蛋白p204在制备 抗肺癌转移药物中的应用。
[0007] 本发明所述干扰素诱导蛋白p204在制备抗肺癌转移药物中的应用。
[0008] 本发明利用C57BL6野生型小鼠与p204敲除型小鼠为模型，研究了 p204分子的生 物学作用，实验证实：该分子能够显著抑制肺癌细胞的转移，为制备抗肺癌转移药物的研究 奠定了基础。
[0009] 为了更好的证明本发明所述分子的作用效果，下面结合小鼠（野生型小鼠与p204 敲除型小鼠）的体外淋巴细胞转化实验与体内荷瘤实验和结果，来进一步阐述本发明所述 干扰素诱导蛋白P204在抗肺癌转移中所具有的作用。
[0010] 1.小鼠脾脏淋巴细胞转化实验
[0011] 获得野生型小鼠与P204敲除型小鼠的脾脏淋巴细胞，对其分别进行ConA/LPS刺 激，培养48h后，加入CCK-8检测液，然后检测OD值并按照公式：刺激指数=[(实验孔（0D 值）-空白孔（0D值））八对照孔（0D值）-空白孔（0D值））]计算淋巴细胞的刺激指数（转 化率）。
[0012] 结果显示在三组平行实验中：对于ConA与LPS的刺激，野生型小鼠的淋巴细 胞转化率均高于P204基因敲除小鼠，且结果经过spss软件分析，两者具有显著性差异 (p〈0. 05)，表明p204基因的敲除导致了小鼠免疫功能的下降（见图1)。
[0013] 2.荷瘤小鼠模型构建
[0014] 取Lewis肺癌细胞，分别接种于野生型小鼠与p204敲除型小鼠的左侧腋窝下，对 照组注射〇. 9%灭菌生理盐水。接种7天后能用手触摸到左侧腋窝处有隆起的肿瘤组织，说 明荷瘤模型构建成功。
[0015] 3.荷瘤小鼠体重与肿瘤体积记录。
[0016] 对荷瘤模型构建成功的小鼠跟踪观察，记录体重数据并按照公式计算体重变化 率：体重变化率=(检测时体重-肿瘤接种时体重）/肿瘤接种时体重。
[0017] 结果显示，a.两种基因型小鼠在注射肿瘤细胞后，体重较对照组（只注射生理盐 水）均有明显增加（荷瘤实验组小鼠体重为22?26g，体重增加约为4?7g ;对照组小 鼠体重为22?25g,体重增加约为1?2. 5g),且荷瘤实验组与对照组体重增加值相比具 有极显著差异（P〈〇. 01) ;b.荷瘤实验组小鼠的体重变化率在第15d开始具有显著性差异 (p〈0. 05)并在第24d开始具有极显著性差异，而同一时间点对照组小鼠体重变化率无显著 性差异（P>〇.〇5) ;c.p204敲除小鼠在第22d体重下降。以上三点暗示了 p204敲除后小鼠 体内肿瘤重量增幅虽小，但其恶化情况却更为严重，影响了小鼠正常生理功能（饮食、排泄 等），使其体重迅速下降（见图2)。
[0018] 试验期间，每周处死荷瘤小鼠后，将肿瘤块剥离，使用游标卡尺对肿瘤的长径（a) 与短径（b)进行记录，并按照公式V = (ab2)/2计算肿瘤体积。
[0019] 结果显示，无论野生型还是p204敲除型小鼠，其肿瘤体积均随接种时间增长而增 大，但野生型小鼠肿瘤体积明显大于同时间点的P204敲除型小鼠，且在肿瘤细胞接种后的 第三周和第四周具有统计学差异（Ρ〈〇· 05)(见图3A);
[0020] 在第四周预计处死的10只实验组小鼠中，野生型小鼠仅有一只提前死亡，死亡率 为10%,而ρ204敲除型小鼠有四只提前死亡,死亡率为40% (见图3Β)。
[0021] 实验组的ρ204敲除型小鼠其肿瘤体积小于实验组的野生型小鼠，却具有更高的 死亡率，暗示了由于与野生型小鼠相比， Ρ204敲除型小鼠体内环境更适合肿瘤的浸润。所 以野生型小鼠体内肿瘤基本在注射部位（腋下）生长，而Ρ204敲除型小鼠肿瘤细胞更多的 去浸润其它组织，导致小鼠饮水摄食等出现障碍，并最终死亡。
[0022] 4.小鼠肺部组织石蜡切片与HE染色观察
[0023] 处死小鼠后，取小鼠的左侧肺叶进行石蜡切片，并将切片进行HE染色，在倒置显 微镜下进行观察并拍照。
[0024] 结果表明：无论是野生型还是p204敲除型，其对照组小鼠的肺部切片（图4C、4D) 均显示无炎症情况和淋巴细胞浸润，肺泡形态正常，无肿瘤灶。对比荷瘤实验组小鼠的肺部 切片可以清楚观察到P204敲除型小鼠其肺部出现明显淋巴细胞聚集和肿瘤浸润情况（图 4B图中箭头所示部位为肺癌细胞转移浸润），而野生型实验组小鼠仅出现炎症反应，无肿 瘤细胞的浸润（图4A)。
[0025] 上述实验数据均经统计学处理（spss软件分析），实验数据以平均值土标准误差 表不。
[0026] 通过上述实验及其结果，可以得到以下结论：
[0027] p204敲除小鼠相比野生型小鼠其免疫力降低，但其肿瘤块体积却小于相同时间点 的野生型小鼠（具有显著性差异），再结合石蜡切片所显示的结果说明：干扰素诱导蛋白 P204其全身性敲除导致小鼠免疫力降低，并有利于肺癌细胞在小鼠体内的转移与浸润，表 明干扰素诱导蛋白P204可以抑制肺癌细胞的转移。
[0028] 本发明公开的干扰素诱导蛋白p204在抗肺癌转移中的应用，预示该干扰素诱导 蛋白P204有望成为抗肺癌转移研究的重要靶点，为制备抗肺癌转移药物提供了基础，具有 良好的开发应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0029] 图1野生型小鼠与p204敲除小鼠淋巴细胞转化结果（刺激指数）
[0030] 其中：图中A代表三组平行实验（WT1与K01、WT2与K02、WT3与K03)中两种基因 型小鼠淋巴细胞转化结果（刺激指数），图B是将图A中结果进行统计分析后得出的柱状 图。
[0031] 图2小鼠体重变化趋势图
[0032] 其中：图中实线代表荷瘤实验组（圆点表示野生型小鼠，方块表示p204敲除型小 鼠）；虚线代表对照组（正三角代表野生型小鼠，倒三角代表P204敲除型小鼠）；横坐标 表示实验组小鼠肿瘤接种的时间，纵坐标表示小鼠体重变化率（体重变化率=(检测时体 重-肿瘤接种时体重）/肿瘤接种时体重）。
[0033] 图3荷瘤实验组小鼠肿瘤体积及死亡率统计
[0034] 其中：图A表示在接种肿瘤细胞后，不同时间点实验组小鼠肿瘤体积，横坐标代表 肿瘤接种后时间（分别为接种后第2周、第3周、第4周）；纵坐标代表肿瘤体积大小。图B 表示荷瘤实验组小鼠死亡率。
[0035] 图4小鼠肺部组织石蜡切片HE染色图（20 X 40)
[0036] 其中：图A:荷瘤组野生型小鼠肺部切片；图B :荷瘤组p204敲除型小鼠肺部切片； 图C :对照组野生型小鼠肺部切片；图D:对照组p204敲除型小鼠肺部切片。图中箭头所示 部位为肺癌细胞转移浸润。
【具体实施方式】
[0037] 实施例1
[0038] 小鼠脾脏淋巴细胞转化实验
[0039] 1)取野生型（WT)和p204基因敲除型（KO)小鼠各3只并随机编号为WT1/WT2/WT3 与K01/K02/K03,断颈处死后，在75%酒精中浸泡5min ;
[0040] 2)将小鼠在超净工作台内解剖，取出脾脏，经200目细胞筛研磨成单细胞悬液；
[0041]3)使用PBS(PH 7. 4)洗涤并离心（1000g，5min)，重复一次，并用PBS重悬细胞；
[0042] 4)将细胞悬液按照1:1的比例小心叠加在淋巴细胞分离液上层（保证两种液体分 界面不被破坏），然后离心（500g，20min);
[0043] 5)离心完毕后，将离心管中第二层（从上向下数）--乳白色的淋巴细胞层小心 地分离出来，按照1:2比例加入细胞洗涤液，充分混匀后离心（500g，20min);
[0044] 6)用PBS (PH 7. 4)重悬细胞，计数，将细胞浓度调整为IX 106/ml，取出18 μ 1，加 入2 μ 1台盼蓝染液，染色3min后，在显微镜下用计数板分别计数活细胞（拒染）和死细胞 (呈淡蓝色）数目，按照公式计算细胞存活率：
[0045] 细胞存活率（％)=活细胞总数/(活细胞总数+死细胞总数）X 100%
[0046] 存活率在95%以上的细胞可用于淋巴细胞转化实验。
[0047]7)将符合条件的淋巴细胞悬液离心（1000g，5min)，弃上清，加入1640培养液（已 加入10%胎牛血清、10(^/1111青霉素和10(^8/1111链霉素）重悬细胞，并将细胞浓度调整为 IXlO fVml，接种于96孔培养板中，每孔100μ 1(即IXlO5个细胞/孔）；
[0048] 8)实验设5组（每只小鼠均设5组），按照下表所示处理方法与平行孔数对样品 进行处理：
[0049]
【权利要求】
1.干扰素诱导蛋白P204在制备抗肺癌转移药物中的应用。
【文档编号】A61P35/00GK104399061SQ201410620500
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年11月6日 优先权日:2014年11月6日
【发明者】时永香, 刘传聚, 杨桢, 魏伟, 尹郭伟, 闫晓桐 申请人:山东大学