预防儿童脑膜炎的联合疫苗及其制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种预防儿童脑膜炎的联合疫苗及其制备方法，其中所述疫苗含有脑膜炎双球菌、肺炎链球菌和流感嗜血杆菌多糖蛋白质结合物，用于免疫6周龄以上儿童，用于预防脑膜炎双球菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌引起的儿童脑膜炎，同时预防这些病原菌引起的其他感染性疾病。
【专利说明】预防儿童脑膜炎的联合疫苗及其制备方法
【技术领域】：
[0001] 本发明涉及一种联合疫苗及其制备方法，主要用于预防儿童脑膜炎，同时也预防 相关病原菌引起的其他感染性疾病。本发明的联合疫苗特别涉及预防脑膜炎双球菌、肺炎 链球菌、流感嗜血杆菌引起的儿童脑膜炎，同时预防这些病原菌引起的其他感染性疾病。
【背景技术】：
[0002] 急性细菌性脑膜炎是儿童死亡的主要病因之一，全球每年有17万死亡病 例(MeenakshiR. ,etal.SequelaeduetobacterialmeningitisamongAfrican children:asystematicliteraturereview.BMCMedicine2009, 7:47),在幸存者中， 还伴随有高比例的神经系统后遗症，严重危害人体健康。导致细菌性脑膜炎的主要病 原菌包括肺炎链球菌（Streptococcuspneumoniae,Sp)、流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae,Hi)和脑膜炎双球菌（Neisseriameningitides，Nm)，其中，肺炎链球菌和流感 嗜血杆菌还是引起儿童肺炎、败血症、中耳炎等感染性疾病的最主要病原菌。
[0003] 国际上已有针对以上病原菌的上市疫苗，如针对肺炎链球菌的"23价肺炎球菌 多糖疫苗"、"13价肺炎球菌结合疫苗"、"10价肺炎球菌结合疫苗"等，针对流感嗜血杆菌 的"b型流感嗜血杆菌结合疫苗"，针对脑膜炎双球菌的"ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗"、 "ACYW135群脑膜炎球菌结合疫苗"、"AC群脑膜炎球菌多糖疫苗"、"AC群脑膜炎球菌结合疫 苗" "A群脑膜炎球菌多糖疫苗"等，也有针对两种病原菌的联合疫苗，如"AC群脑膜炎球菌 (结合）b型流感嗜血杆菌（结合）联合疫苗"、"CY群脑膜炎球菌b型流感嗜血杆菌结合 疫苗"等，但还没有同时针对肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、脑膜炎双球菌三种病原菌的联合 疫苗。国外有采用三种疫苗同时接种的报道（LagosR.，etal.Immunologyofcombining CRM(197)conjugatesforStreptococcuspneumoniae,Neisseriameningitisand HaemophilusinfluenzaeinChileaninfants.Vaccine. 2009, 17:2299)，米用 "9 价肺炎 球菌结合疫苗"、"C群流脑结合疫苗"和"b型流感嗜血杆菌结合疫苗"混合后接种，观察到有 些细菌型别抗体降低的情况，但各种抗体阳转率并无明显变化，还有将"7价肺炎球菌结合 疫苗"、"C群流脑结合疫苗"和"百白破/IPV/b型流感嗜血杆菌五联苗"同时在不同部位接 种的报道（MossSJ. ,etal.ImmunogenicityofaHeptavalentConjugatePneumococcal VaccineAdministeredConcurrentlywithaCombinationDiphtheria,Tetanus,Five-C omponentAcellularPertussis,InactivatedPolio,andHaemophilusinfluenzaeType bVaccineandaMeningococcalGroupCConjugateVaccineat2, 3,and4Monthsof Age.Clin.VaccineImmunol. 2010, 17:311)，也发现类似情况，证明针对疫苗的联合免疫， 可以诱导有保护效果的免疫应答。
[0004] 本发明意外的发现，将脑膜炎双球菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌制备成结合疫苗 可以预防儿童脑膜炎，同时发现三者结合具有协同增效作用。
【发明内容】
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[0005] 本发明提供了一种预防儿童脑膜炎的联合疫苗制剂，所述疫苗制剂含有的活性成 分为：脑膜炎双球菌结合物、肺炎球菌结合物和流感嗜血杆菌结合物。
[0006] 其中，脑膜炎双球菌结合物选自：脑膜炎双球菌A群、C群、Y群、W135群中的一种 或多种不同血清型的组合。
[0007] 肺炎球菌结合物选自：肺炎球菌1型、2型、3型、4型、5型、64、68、7?、8型、9队听、 10八、1认、12?、14型、158、17?、18(：、194、19?、20型、22?、23?和33?型一种或多种不同血清型 的组合。
[0008] 流感嗜血杆菌结合物选自：流感嗜血杆菌a型和b型的一种或2种血清型组合。
[0009] 本发明联合疫苗制剂中，每型结合物的含量0. 5 - 20yg/剂（以多糖含量计），优 选1 一 10yg/剂，更优选2 - 5yg/剂。联合制剂中，各型结合物含量可相同，也可不同。
[0010] 本发明联合疫苗制剂，所述结合物的结合蛋白，选自破伤风类毒素、破伤风毒素C 片段、白喉类毒素、交叉反应物质（如CRM197)、百日咳毒素及其类似物、重组绿脓杆菌外毒 素A及其类似物、B群脑膜炎球菌外膜蛋白、不可分型流感嗜血杆菌P蛋白、肺炎球菌外膜 蛋白等。
[0011] 本发明联合疫苗制剂，其中除上述活性成分外，还可含有佐剂，优选铝佐剂，加入 量为0. 1 - 1. 5mg铝含量/剂，铝佐剂可为氢氧化铝、硫酸铝、磷酸铝的一种或不同配比的 混合物。
[0012] 本发明联合疫苗制剂优选注射剂，可为冻干或液体制剂，供皮下或肌肉注射。
[0013] 本发明的联合疫苗制剂可通过以下工艺制备：
[0014] 多糖的制备：选用脑膜炎双球菌、肺炎链球菌和流感嗜血杆菌的菌种，经发酵培养 后，纯化出各型荚膜多糖。荚膜多糖纯化方法可选用有机溶剂分离和/或层析纯化，属于本 行业通用技术。纯化荚膜多糖残余核酸和蛋白质含量不高于10%，优选不高于5%，更优选 不闻于2%。
[0015] 载体蛋白质的制备：选用相应菌种发酵培养后，纯化目标蛋白质而成，其中类毒素 类产品需经脱毒，脱毒剂可选用甲醛、戊二醛的一种或混合。目标蛋白质的纯化方法包括盐 析、层析、超滤等，属于本行业通用技术。目标蛋白质含量不低于90%，优选不低于95%。
[0016] 结合物制备：采用胺还原法或氰基活化法制备，属于本行业通用技术。多糖与蛋 白质可以直接连接，也可以通过桥连剂（如ADH)连接。制备的结合物游离多糖含量不高于 30 %，优选不高于20 %，更优选不高于10 %。
[0017] 联合疫苗制备：将不同的结合物，以一定比例混合，用缓冲盐水或盐水稀释至一定 浓度分装而成。可添加佐剂制备成吸附剂型，也可添加赋形剂分装冻干后，制备为冻干剂 型。赋形剂可以是糖类、蛋白质类或氨基酸类，优选糖类，最优选乳糖。
[0018] 本发明联合疫苗制剂采用脑膜炎双球菌、肺炎链球菌和流感嗜血杆菌制备的结合 物，所选血清型中，脑膜炎双球菌选择A群、C群、Y群、W135群，优选A群、C群，最优选A群； 肺炎链球菌选择1型、2型、3型、4型、5型、6八、68、7?、8型、9队叭、1(^、1认、12?、14型、158、 17F、18C、19A、19F、20型、22F、23F和33F型，优选1型、3型、4型、5型、6六、68、7卩、听、14型、 18C、19A、19F和23F，最优选4型、6B、9V、14型、18C、19F和23F ;流感嗜血杆菌选择a型和b 型，优选b型。
[0019] 因此，本发明的联合疫苗制剂，优选的是含有A、C群流脑（结合）13价肺炎（结 合）b型流感嗜血杆菌（结合）的联合疫苗。最优选的是含有A、C群流脑（结合）7价肺炎 (结合）b型流感嗜血杆菌（结合）的联合疫苗。其中13价为：1型、3型、4型、5型、6A、6B、 7F、9V、14 型、18C、19A、19F和 23F，7 价为：4 型、6B、9V、14 型、18C、19F和 23F;
[0020] 本发明的联合疫苗制剂，优选的配方，各组分的配比如下：
[0021]A，C群脑膜炎球菌结合物，配制成终浓度分别为10-20yg/ml
[0022] 4型、9V、14型、18C、19F和23F肺炎球菌结合物，配制成终浓度分别为3-5iig/ml
[0023] 6B肺炎球菌结合物，配制成终浓度分别为7-9iig/ml
[0024]b型流感嗜血杆菌结合物，配制成终浓度分别为10-20yg/ml。
[0025] 或，
[0026]A，C群脑膜炎球菌结合物，配制成终浓度分别为10-20yg/ml
[0027] 1型、3型、4型、5型、6八、7?、9￥、14型、18(：、194、19?和23?肺炎球菌结合物，配制 成终浓度分别为3-5yg/ml
[0028] 6B肺炎球菌结合物，配制成终浓度分别为7-9iig/ml
[0029]b型流感嗜血杆菌结合物，配制成终浓度分别为10-20yg/ml。
[0030] 本发明的联合疫苗制剂，最优选的配方，各组分的配比如下：
[0031]A,C群脑膜炎球菌结合物，配制成终浓度分别为10或20i!g/ml
[0032] 4型、9V、14型、18C、19F和23F肺炎球菌结合物，配制成终浓度分别为4iig/ml
[0033]6B肺炎球菌结合物，配制成终浓度分别为8iig/ml
[0034]b型流感嗜血杆菌结合物，配制成终浓度分别为10或20i!g/ml。
[0035] 或，
[0036]A,C群脑膜炎球菌结合物，配制成终浓度分别为10或20iig/ml
[0037] 1型、3型、4型、5型、6八、7?、9￥、14型、18(：、194、19?和23?肺炎球菌结合物，配制 成终浓度分别为4iig/ml
[0038]6B肺炎球菌结合物，配制成终浓度分别为8iig/ml
[0039]b型流感嗜血杆菌结合物，配制成终浓度分别为10或20iig/ml。
[0040] 本发明联合疫苗制剂的小鼠免疫原性观察发现，各型抗原都可以诱导良好的免疫 应答，各抗原间没观察到明显的免疫抑制现象。
[0041] 以下通过实验数据进一步说明本发明的有益效果：
[0042] 实验1，流脑肺炎流感嗜血杆菌联合疫苗制剂的小鼠免疫原性
[0043] 选用实施例9, 10, 11的联合疫苗分别免疫NIH小鼠各10只，免疫3针，间隔2周， 免疫剂量为〇.lml/针，最后一次免疫后2周经眼眶采血，离心收集血清。另设10只小鼠为 对照，用生理氯化钠免疫。
[0044] 血清特异性抗体测定采用间接ELISA法，包被抗原为相应多糖与牛血清白蛋白的 偶联物。在已包被的酶标板中加入1:200稀释的血清并做倍比稀释，洗板后，加入辣根过氧 化物酶标记的抗小鼠IgG抗体，洗板后，加入底物显色，0D405nm读数。以对照小鼠1 :200 的平均0D值+3SD为cutoff值，判定并计算各型别小鼠的抗体几何平均滴度。
[0045] 联合疫苗免疫后小鼠特异性抗体滴度（1:)
[0046]
【权利要求】
1. 一种预防儿童脑膜炎的联合疫苗制剂，其特征在于，所述疫苗制剂含有的活性成分 为：脑膜炎双球菌结合物、肺炎球菌结合物和流感嗜血杆菌结合物；其中，脑膜炎双球菌结 合物选自：脑膜炎双球菌A群、C群、Y群、W135群中的一种或多种不同血清型的组合；肺炎 球菌结合物选自：肺炎球菌1型、2型、3型、4型、5型、6八、68、7?、8型、9队听、1(^、1认、12卩、 14型、15B、17F、18C、19A、19F、20型、22F、23F和33F型一种或多种不同血清型的组合；流感 嗜血杆菌结合物选自：流感嗜血杆菌a型和b型的一种或2种血清型组合。
2. 根据权利要求1的联合疫苗制剂，其特征在于，其中，脑膜炎双球菌结合物、肺炎球 菌结合物和流感嗜血杆菌结合物的含量以多糖含量计为〇. 5 - 20 y g/剂。
3. 根据权利要求1的联合疫苗制剂，其特征在于，其中，脑膜炎双球菌结合物、肺炎球 菌结合物和流感嗜血杆菌结合物的含量以多糖含量计为1 一 10 Ug/剂。
4. 根据权利要求1的联合疫苗制剂，其特征在于，为注射剂。
5. 根据权利要求1的联合疫苗制剂，其特征在于，为冻干或液体制剂，供皮下或肌肉注 射。
6. 根据权利要求1的联合疫苗制剂，其特征在于，是含有A、C群流脑（结合）13价肺 炎（结合）b型流感嗜血杆菌（结合）的联合疫苗，其中13价为：1型、3型、4型、5型、6A、 6B、7F、9V、14 型、18C、19A、19F 和 23F。
7. 根据权利要求1的联合疫苗制剂，其特征在于，是含有A、C群流脑（结合）7价肺炎 (结合）b型流感嗜血杆菌（结合）的联合疫苗，其中7价为：4型、6B、9V、14型、18C、19F和 23F。
8. 根据权利要求1的联合疫苗制剂，其特征在于，各组分的配比如下： A，C群脑膜炎球菌结合物，配制成终浓度分别为10-20 y g/ml ; 4型、9V、14型、18C、19F和23F肺炎球菌结合物，配制成终浓度分别为3-5 ii g/ml6B肺 炎球菌结合物，配制成终浓度分别为7-9ii g/ml ; b型流感嗜血杆菌结合物，配制成终浓度分别为10-2(^ g/ml ; 或， A，C群脑膜炎球菌结合物，配制成终浓度分别为10-20 y g/ml ; 1型、3型、4型、5型、6八、7?、听、14型、18(：、194、19?和23?肺炎球菌结合物，配制成终 浓度分别为3-5 y g/ml ; 6B肺炎球菌结合物，配制成终浓度分别为7-9 y g/ml ; b型流感嗜血杆菌结合物，配制成终浓度分别为10-2(^ g/ml。
9. 根据权利要求1的联合疫苗制剂，其特征在于，各组分的配比如下： A，C群脑膜炎球菌结合物，配制成终浓度分别为10或20 y g/ml ; 4型、9V、14型、18C、19F和23F肺炎球菌结合物，配制成终浓度分别为4 y g/ml6B肺炎 球菌结合物，配制成终浓度分别为8 y g/ml ; b型流感嗜血杆菌结合物，配制成终浓度分别为10或20 y g/ml ; 或， A，C群脑膜炎球菌结合物，配制成终浓度分别为10或20 y g/ml ; 1型、3型、4型、5型、6八、7?、听、14型、18(：、194、19?和23?肺炎球菌结合物，配制成终 浓度分别为g/ml ; 6B肺炎球菌结合物，配制成终浓度分别为8 y g/ml ; b型流感嗜血杆菌结合物，配制成终浓度分别为10或20 y g/ml。
10.权利要求1的联合疫苗制剂的制备方法，其特征在于，所述结合物的结合蛋白，选 自破伤风类毒素、破伤风毒素C片段、白喉类毒素、交叉反应物质、百日咳毒素及其类似物、 重组绿脓杆菌外毒素A及其类似物、B群脑膜炎球菌外膜蛋白、不可分型流感嗜血杆菌P蛋 白、肺炎球菌外膜蛋白； 其中，多糖的制备：选用脑膜炎双球菌、肺炎链球菌和流感嗜血杆菌的菌种，经发酵培 养后，纯化出各型荚膜多糖； 载体蛋白质的制备：选用相应菌种发酵培养后，纯化目标蛋白质而成，其中类毒素类产 品需经脱毒； 结合物制备：采用胺还原法或氰基活化法制备，多糖与蛋白质可以直接连接，也可以通 过桥连剂连接，制备的结合物游离多糖含量不高于30% ; 联合疫苗制备：将不同的结合物，按比例混合，用缓冲盐水或盐水稀释至确定的浓度分 装而成，可添加佐剂制备成吸附剂型，也可添加赋形剂分装冻干后，制备为冻干剂型。
【文档编号】A61K39/095GK104383531SQ201410655317
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年11月18日 优先权日:2014年11月18日
【发明者】杜琳, 朱卫华 申请人:北京智飞绿竹生物制药有限公司