百合花提取物在制备治疗神经系统疾病及肌无力疾病药物中的应用的制作方法

百合花提取物在制备治疗神经系统疾病及肌无力疾病药物中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种百合花提取物的新用途，即百合花提取物在制备治疗老年痴呆、脑卒中、精神分裂症等神经系统疾病，及重症肌无力、进行性肌营养不良等肌无力疾病的药物中的应用。本发明首次将百合花提取物用于制备治疗老年痴呆、脑卒中、精神分裂症等神经系统疾病，及重症肌无力、进行性肌营养不良等肌无力疾病的药物，能够有效抑制老年痴呆、脑卒中、精神分裂症、重症肌无力、进行性肌营养不良。
【专利说明】百合花提取物在制备治疗神经系统疾病及肌无力疾病药物中的应用

【技术领域】
[0001]本发明属于医药【技术领域】，特别涉及百合花提取物在制备神经系统疾病及肌无力疾病药物中的应用。
技术背景
[0002]神经系统疾病包括老年痴呆、脑卒中、精神分裂症。老年痴呆是一种起病隐匿的进行性发展的神经系统退行性疾病。临床上以记忆障碍、失语、失用、失认、视空间技能损害、执行功能障碍以及人格和行为改变等全面性痴呆表现为特征，病因迄今未明。其患病率随年龄增高而增高，在65岁以上人群中约为5%，85岁以上人群中约20%。本病常散发，女性多于男性，女性患者的病程常较男性患者长。随着人口的老龄化，其发病率逐年上升，严重危害老年人的身心健康和生活质量，已成为严重的社会问题，引起各国政府和医学界的普遍关注。目前主要有以下几种治疗药物:(I)干扰Αβ形成和沉积的药物；(2)胆碱能类药物；(3)谷氨酸受体调控剂；(4)影响自由基代谢的药物；(5)脑代谢调节剂。
[0003]脑卒中是一种突然起病的脑血液循环障碍性疾病是指在脑血管疾病的病人，因各种诱发因素引起脑内动脉狭窄，闭塞或破裂，而造成急性脑血液循环障碍，临床上表现为一过性或永久性脑功能障碍的症状和体征。脑卒中是当前老年人致残致痴的主要原因之一，据WHO公布的资料，在57个国家中，有40个国家把脑卒中的死亡率列入了前三位，其中在日本和中国卒中的死亡率已占首位。而缺血性脑卒中占脑卒中病人总数的60%-70%。目前临床常用治疗策略如下:(I)溶栓剂；(2)神经保护剂；(3)干细胞疗法。
[0004]精神分裂症是一组病因未明的功能性的精神疾病，多在青壮年缓慢或亚急性起病，临床上往往表现为症状各异的综合征，涉及感知觉、思维、情感和行为等多方面的障碍以及精神活动的不协调。2004年WHO的调查结果显示，全球精神分裂症患病率为4%。。卫生部提供的资料显示，2002年我国重性精神疾病患者约1600万人，其中精神分裂症患者约780多万人。精神分裂症起病早，对患者的认知、生活和社会功能带来严重影响，给患者家庭造成沉重负担，并可能引发许多社会问题。目前用于临床的抗精神病药物主要分为两大类:
(I)典型抗精神病药；(2)非典型抗精神病药。
[0005]肌无力疾病包括重症肌无力、进行性肌营养不良。重症肌无力是一种由神经-肌肉接头处传递功能障碍所引起的自身免疫性疾病，临床主要表现为部分或全身骨骼肌无力和易疲劳，活动后症状加重，经休息后症状减轻。患病率为77?150/100万，年发病率为4?11/100万。女性患病率大于男性，约3:2，各年龄段均有发病，儿童I?5岁居多。随着人们对重症肌无力发病机制研宄的深入，虽取得了巨大进展，但至今尚无公认的标准治疗方案。目前常用治疗药物主要有:(I)胆碱酯酶抑制剂；(2)免疫抑制；(3)血浆置换；(4)静脉注射免疫球蛋白；(5)中医药治疗。
[0006]进行性肌营养不良症是一组由遗传因素所致的原发性骨骼肌疾病，其临床主要表现为缓慢进行的肌肉萎缩，肌无力及不同程度的运动障碍。本病可由多种遗传方式引起，其临床表现各具有不同的特点，因而形成许多类型。对其病因的研宄已为世人所瞩目，数十年来，相继提出的有血管性，神经性，肌纤维再生错乱和细胞膜缺陷等学说，但大量的研宄证据表明细胞膜缺陷在本病发生有重要地位，三分之一新生男婴患儿是由于基因突变所引起。该病迄今尚无特效的治疗方法，目前临床上只能采取对症疗法及一般支持疗法，包括应用维生素E、肌苷、加兰他敏、三磷腺苷、苯丙酸诺龙以及中药等。适当的功能锻炼，进行各关节充分被动运动，针灸、推拿、按摩等均可延缓更严重的肌无力、肌萎缩和关节挛缩的发生。
[0007]然而，现有技术中并没有将百合花提取物用于治疗老年痴呆、脑卒中、精神分裂症等神经系统疾病，及重症肌无力、进行性肌营养不良等肌无力疾病的报道。


【发明内容】

[0008]本发明的目的是提供一种百合花提取物的新用途，即百合花提取物在制备治疗神经系统疾病及肌无力疾病药物中的应用。
[0009] 申请人:在研宄中发现了百合花提取物具有改善神经系统疾病及肌无力疾病的作用，可以显著提高患者的生存质量。
[0010]经试验研宄发现，本发明的应用中，神经系统性疾病为老年痴呆、脑卒中和精神分裂症；肌无力疾病为重症肌无力和进行性肌营养不良；百合花提取物在改善上述疾病的过程中，是作为乙酰胆碱酯酶抑制剂使用的。
[0011]本发明的应用中，百合花提取物是将百合花经溶剂提取得得到的，所述溶剂为乙醇、蒸馏水或者石油醚。
[0012]进一步，本发明的应用中，溶剂为乙醇，百合花提取物为百合花醇提物；
[0013]百合花醇提物是按如下方法制得的:
[0014]将百合花按固液比为1:5-15加入浓度为50-95%的乙醇，提取1_3次，每次提取l_3h，提取液合并，过滤，浓缩，即得百合花醇提物。
[0015]进一步，本发明的应用中，溶剂为蒸馏水，百合花提取物为百合花水提物；
[0016]百合花水提物是按如下方法制得的:
[0017]将百合花按固液比为1:5-15加入蒸馏水，提取1-3次，每次提取l_3h，提取液合并，过滤，浓缩，即得百合花水提物。
[0018]进一步，本发明的应用中，溶剂为石油醚，百合花提取物为百合花石油醚提取物；
[0019]百合花石油醚提取物是按如下方法制得的:
[0020]将百合花按固液比为1:5-15加入石油醚，提取1-3次，每次提取l_3h，提取液合并，过滤，浓缩，然后加乙醇稀释，即得百合花石油醚提物。
[0021]本发明的应用中，将百合花提取物制成口服制剂，口服制剂由以下重量份的成分制得:
[0022]80-120重量份的百合花制得的百合花提取物；
[0023]30-40重量份的淀粉；
[0024]70-80重量份的糊精；
[0025]1-3重量份的硬脂酸镁；
[0026]4-8重量份的滑石粉；
[0027]8-12重量份的乙醇。
[0028]进一步，口服制剂由以下重量份的成分制得:
[0029]100重量份的百合花制得的百合花提取物；
[0030]35重量份的淀粉；
[0031]75重量份的糊精；
[0032]2重量份的硬脂酸镁；
[0033]6重量份的滑石粉；
[0034]10重量份的乙醇。
[0035]进一步，口服制剂为片剂或胶囊剂。
[0036]口服制剂为片剂时，按如下方法制得:
[0037]I)按照重量份数比为80-120:30-40:70-80:1-3:4-8:8-12准备百合花、淀粉、糊精、硬脂酸镁、滑石粉、和70%乙醇；
[0038]2)将步骤I)得到的百合花制成百合花提取物；
[0039]3)将步骤2)得到的百合花提取物进一步浓缩成密度为1.20-1.25的浸膏，加入步骤I)得到的淀粉、糊精、硬脂酸镁、滑石粉、和70%乙醇，搅拌混合制软粒；
[0040]4)将步骤3)得到的软粒压片，即得片剂，每片含百合花提取物lOOmg。
[0041]口服制剂为胶囊剂时，按如下方法制得:
[0042]I)按照重量份数比为80-120:30-40:70-80:1-3:4-8:8-12准备百合花、淀粉、糊精、硬脂酸镁、滑石粉、和70%乙醇；
[0043]2)将步骤I)得到的百合花制成百合花提取物；
[0044]3)将步骤2)得到的百合花提取物进一步浓缩成密度为1.20-1.25的浸膏，加入步骤I)得到的淀粉、糊精、硬脂酸镁、滑石粉、和70%乙醇，搅拌混合制软粒；
[0045]4)将步骤3)得到的软粒灌装胶囊，即得胶囊剂，每颗胶囊含百合花提取物lOOmg。
[0046]本发明的应用中，将百合花提取物制成注射制剂，注射制剂由以下重量份的成分制得:
[0047]80-120重量份的百合花制得的百合花提取物；
[0048]与百合花的固液比为1:5-15的注射用水。
[0049]进一步，注射制剂由以下重量份的成分制得:
[0050]100重量份的百合花制得的百合花提取物；
[0051]与百合花的固液比为1:10的注射用水。
[0052]进一步，注射制剂按如下方法制得:
[0053]I)称取百合花；
[0054]2)将步骤I)得到的百合花制成百合花提取物；
[0055]3)将将步骤2)得到的百合花提取物冷藏后去杂质，过滤，加入注射用水得溶液，所述步骤I)得到的百合花与所述溶液的固液比为1:5-15，将所述溶液冷藏过夜，解冻，抽滤，滤液调节PH到5.8?6.2，然后加入活性炭脱色，室温下静置，精滤，灌封，灭菌分装，地注射剂，每支注射剂含百合花醇提物200mg。
[0056]经过大量的动物试验确定了百合花提取物的有效使用剂量。
[0057]百合花提取物的用量为0.1-0.5g/kgo
[0058]百合花提取物的用量为0.1-0.5g/kg时，对各种疾病的改善效果更好。
[0059]本发明首次将百合花提取物用于制备治疗老年痴呆、脑卒中、精神分裂症、重症肌无力、进行性肌营养不良的药物中，能够有效改善老年痴呆、脑卒中、精神分裂症、重症肌无力、进行性肌营养不良等症状；提高患者的生活质量。

【具体实施方式】
[0060]下面结合实施例对本发明作进一步说明:
[0061]实施例1百合花醇提物
[0062]制备方法:称取百合花100g，粉碎，加95%乙醇100ml提取2次，每次提取2h，提取液合并，过滤，浓缩至100ml，即得百合花醇提物。
[0063]实施例2百合花醇提物
[0064]制备方法:称取百合花100g，粉碎，加50%乙醇500ml提取3h，提取液过滤，浓缩至100ml，即得百合花醇提物。
[0065]实施例3百合花醇提物
[0066]制备方法:称取百合花100g，粉碎，加75%乙醇1500ml提取3次，每次提取lh，提取液合并，过滤，浓缩至100ml，即得百合花醇提物。
[0067]实施例4百合花水提物
[0068]制备方法:称取百合花100g，粉碎，加蒸馏水1000ml煎煮2次，每次煎煮2h，煎煮液合并，过滤，浓缩，即得百合花水提物。
[0069]实施例5百合花水提物
[0070]制备方法:称取百合花100g，粉碎，加蒸馏水500ml煎煮3h，煎煮液过滤，浓缩，即得百合花水提物。
[0071]实施例6百合花水提物
[0072]制备方法:称取百合花100g，粉碎，加蒸馏水1500ml煎煮3次，每次煎煮lh，煎煮液合并，过滤，浓缩，即得百合花水提物。
[0073]实施例7百合花石油醚提取物
[0074]制备方法:称取百合花100g，粉碎，加石油醚1000ml提取2次，每次2h，提取液合并，过滤，浓缩至50ml，加乙醇稀释至300ml，即得百合花石油醚提取物。
[0075]实施例8百合花石油醚提取物
[0076]制备方法:称取百合花100g，粉碎，加石油醚500ml提取3h，过滤，浓缩至50ml，加乙醇稀释至300ml，即得百合花石油醚提取物。
[0077]实施例9百合花石油醚提取物
[0078]制备方法:称取百合花100g，粉碎，加石油醚1500ml提取2次，每次2h，提取液合并，过滤，浓缩至50ml，加乙醇稀释至300ml，即得百合花石油醚提取物。
[0079]实施例10片剂
[0080]处方:100g百合花制得的百合花醇提物；
[0081]35g 淀粉；
[0082]75g 糊精；
[0083]2g硬脂酸镁；
[0084]6g滑石粉；
[0085]1g 乙醇。
[0086]制备方法:
[0087]I)按处方量准备各原料；
[0088]2)将处方量的百合花按照实施例1的方法制成百合花醇提物；
[0089]3)将步骤2)得到的百合花醇提物进一步浓缩成密度为1.20的浸膏，加入处方量的淀粉、糊精、硬脂酸镁、滑石粉、和70%乙醇，搅拌混合制软粒；
[0090]4)将步骤3)得到的软粒压片，即得片剂，每片含百合花提取物lOOmg。
[0091]实施例11片剂
[0092]处方:80g百合花制得的百合花水提物；
[0093]30g 淀粉；
[0094]70g 糊精；
[0095]3g硬脂酸镁；
[0096]8g滑石粉；
[0097]12g 乙醇。
[0098]制备方法:
[0099]I)按处方量准备各原料；
[0100]2)将处方量的百合花按照实施例5的方法制成百合花水提物；
[0101]3)将步骤2)得到的百合花水提物进一步浓缩成密度为1.25的浸膏，加入处方量的淀粉、糊精、硬脂酸镁、滑石粉、和70%乙醇，搅拌混合制软粒；
[0102]4)将步骤3)得到的软粒压片，即得片剂，每片含百合花提取物lOOmg。
[0103]实施例12片剂
[0104]处方:120g百合花制得的百合花石油醚提取物；
[0105]40g 淀粉；
[0106]80g 糊精；
[0107]Ig硬脂酸镁；
[0108]4g滑石粉；
[0109]8g 乙醇。
[0110]制备方法:
[0111]I)按处方量准备各原料；
[0112]2)将处方量的百合花按照实施例9的方法制成百合花石油醚提取物；
[0113]3)将步骤2)得到的百合花石油醚提取物进一步浓缩成密度为1.25的浸膏，加入处方量的淀粉、糊精、硬脂酸镁、滑石粉、和70%乙醇，搅拌混合制软粒；
[0114]4)将步骤3)得到的软粒压片，即得片剂，每片含百合花提取物lOOmg。
[0115]实施例13胶囊剂
[0116]处方:100g百合花制得的百合花水提物；
[0117]35g 淀粉；
[0118]75g 糊精；
[0119]2g硬脂酸镁；
[0120]6g滑石粉；
[0121]1g 乙醇。
[0122]制备方法:
[0123]I)按处方量准备各原料；
[0124]2)将处方量的百合花按照实施例4的方法制成百合花水提物；
[0125]3)将步骤2)得到的百合花醇提物进一步浓缩成密度为1.20的浸膏，加入处方量的淀粉、糊精、硬脂酸镁、滑石粉、和70%乙醇，搅拌混合制软粒；
[0126]4)将步骤3)得到的软粒灌装胶囊，即得胶囊剂，每颗胶囊含百合花提取物lOOmg。
[0127]实施例14胶囊剂
[0128]处方:80g百合花制得的百合花醇提物；
[0129]30g 淀粉；
[0130]70g 糊精；
[0131]3g硬脂酸镁；
[0132]8g滑石粉；
[0133]12g 乙醇。
[0134]制备方法:
[0135]I)按处方量准备各原料；
[0136]2)将处方量的百合花按照实施例2的方法制成百合花醇提物；
[0137]3)将步骤2)得到的百合花醇提物进一步浓缩成密度为1.25的浸膏，加入处方量的淀粉、糊精、硬脂酸镁、滑石粉、和70%乙醇，搅拌混合制软粒；
[0138]4)将步骤3)得到的软粒灌装胶囊，即得胶囊剂，每颗胶囊含百合花提取物lOOmg。
[0139]实施例15胶囊剂
[0140]处方:120g百合花制得的百合花石油醚提取物；
[0141]40g 淀粉；
[0142]80g 糊精；
[0143]Ig硬脂酸镁；
[0144]4g滑石粉；
[0145]8g 乙醇。
[0146]制备方法:
[0147]I)按处方量准备各原料；
[0148]2)将处方量的百合花按照实施例8的方法制成百合花石油醚提取物；
[0149]3)将步骤2)得到的百合花石油醚提取物进一步浓缩成密度为1.20的浸膏，加入处方量的淀粉、糊精、硬脂酸镁、滑石粉、和70%乙醇，搅拌混合制软粒；
[0150]4)将步骤3)得到的软粒灌装胶囊，即得胶囊剂，每颗胶囊含百合花提取物lOOmg。
[0151]实施例16注射制剂
[0152]处方:100g百合花制得的百合花石油醚提取物；
[0153]1000ml 注射用水。
[0154]制备方法:
[0155]I)按处方量准备各原料；
[0156]2)将处方量的百合花按照实施例7的方法制成百合花石油醚提取物；
[0157]3)将步骤2)得到的百合花石油醚提取物冷藏后去杂质，过滤，加入处方量的注射用水得溶液，将所述溶液冷藏过夜，解冻，抽滤，滤液调节PH到6.0，然后加入活性炭脱色，室温下静置，精滤，灌封，灭菌分装，地注射剂，每支注射剂含百合花醇提物200mg。
[0158]实施例17注射制剂
[0159]处方:80g百合花制得的百合花醇提物；
[0160]1200ml 注射用水。
[0161]制备方法:
[0162]I)按处方量准备各原料；
[0163]2)将处方量的百合花按照实施例3的方法制成百合花醇提物；
[0164]3)将步骤2)得到的百合花醇提物冷藏后去杂质，过滤，加入处方量的注射用水得溶液，将所述溶液冷藏过夜，解冻，抽滤，滤液调节PH到5.8，然后加入活性炭脱色，室温下静置，精滤，灌封，灭菌分装，地注射剂，每支注射剂含百合花醇提物200mg。
[0165]实施例18注射制剂
[0166]处方:120g百合花制得的百合花石油醚提取物；
[0167]600ml注射用水。
[0168]制备方法:
[0169]I)按处方量准备各原料；
[0170]2)将处方量的百合花按照实施例6的方法制成百合花水提物；
[0171]3)将步骤2)得到的百合花水提物冷藏后去杂质，过滤，加入处方量的注射用水得溶液，将所述溶液冷藏过夜，解冻，抽滤，滤液调节PH到6.2，然后加入活性炭脱色，室温下静置，精滤，灌封，灭菌分装，地注射剂，每支注射剂含百合花醇提物200mg。
【专利附图】

【附图说明】
[0172]图1为三种不同的百合花提取物对乙酰胆碱酯酶的体外抑制作用；
[0173]图2为试验例2中各组小鼠在定位航行试验中寻找原平台的运动轨迹；
[0174]图3为试验例3中三种不同的百合花提取物、依达拉奉对缺血大鼠脑梗死保护作用的比较。
[0175]药效学试验
[0176]试验例I百合花提取物对乙酰胆碱酯酶的体外抑制试验
[0177]一、材料和动物
[0178]1、受试样品:
[0179]样品Al:50mg/ml的百合花水提物；
[0180]样品A2:100mg/ml的百合花水提物；
[0181]样品A3:50mg/ml的百合花醇提物；
[0182]样品A4:100mg/ml的百合花醇提物；
[0183]样品A5:50mg/ml的百合花石油醚提取物；
[0184]样品A6:100mg/ml的百合花石油醚提取物；
[0185]对照品B:0.01mg/ml加兰他敏(阳性药)。
[0186]2、试验体系:140 μ L 0.lmol/L PBS (pH 8.0)。
[0187]二、试验方法:
[0188]采用改良的Ellman体外酶活性筛选方法进行，利用经典的反应体系140 μ L0.lmol/L PBS (pH 8.0)，20 μ L待测样品溶液(分别为样品Al、样品A2、样品A3、样品Α4、样品Α5、样品Α6、对照品B)，20 μ L乙酰胆碱酯酶溶液，依次加入96孔板中，震荡混匀，4°C培养20分钟。然后加10 μ L 0.0lM的DTNB，最后通过加10 μ L 0.075Μ的ATCI开始反应。37°C培养20分钟后，用酶标仪在405nm下测量吸光度(A)并根据下式计算抑制率。
[0189]抑制率) = [1-(A试验-A试验对照)/(A空白-A空白对照)]X 100%。
[0190]三、试验效果
[0191]如图1所示，百合花水提物50mg/ml、100mg/ml乙酰胆碱酯酶抑制率分别为35.86%,73.08% ;百合花醇提物50mg/ml、100mg/ml乙酰胆碱酯酶抑制率分别为74.17%,91.73% ;百合花石油醚提取物50mg/ml、100mg/ml乙酰胆碱酯酶抑制率分别为78.64%,79.47% ;加兰他敏(阳性药)0.01mg/ml乙酰胆碱酯酶抑制率为46.28 0Z0o表明百合花水提、醇提、石油醚提取物均有一定的抗乙酰胆碱酯酶作用，其中醇提物抑制活性最强。
[0192]试验例2百合花提取物对老年痴呆的改善试验
[0193]一、材料和动物
[0194]1、受试样品:
[0195]样品1:百合花醇提物；
[0196]样品2:百合花水提物；
[0197]样品3:百合花石油醚提取物；
[0198]对照品:加兰他敏(临床用老年痴呆药物)。
[0199]2、动物:小鼠为SPF级SD雄性大鼠，体重200-220g ;武汉大学动物试验中心提供，动物合格证号为N0.00014833，生产许可证号:SCXK (鄂)2008-2004。鼠饲料，购于武汉大学试验动物中心。
[0200]二、试验方法:
[0201]1.动物模型建立:
[0202]小鼠随机分组:正常组，即对照组I ;模型组，即对照组2 ;模型+加兰他敏组，即对照组3 ;模型+百合花醇提物组，即试验组I ;模型+百合花水提物组，即试验组2 ;模型+百合花石油醚提取物组，即试验组3。
[0203]除正常组外，其余各组均经口给药，每日I次，连续21天；且第16天开始，除正常组外的各组均于实验前30min给予腹腔注射3mg/kg氢溴酸东莨菪碱，制备小鼠学习记忆障碍痴呆模型。
[0204]2.Morris水迷宫测试！Morris水迷宫主体为直径100cm，高35cm的圆形水池，水池内加入奶粉使水不透明，且将迷宫均分为4个象限，水温保持在(25±2)°C。另有一个白色圆形平台(直径9cm，高29cm)，置于某一象限中央，位于水面下l-2cm，迷宫上方安置着连接显示系统的摄像机，同步记录小鼠运动轨迹。测试方法参照文献进行。第16天开始进行定位航行实验，历时5天，每天I次。将小鼠面向池壁放入水中，记录其在120s内找到平台的时间(逃避潜伏期)。超过120s找不到平台，可引导其找到平台并在平台上滞留10s，逃避潜伏期记成120s。第21天上午进行空间探索实验，撤除平台，将小鼠随机从某一象限面向池壁放入水中，记录120s内小鼠寻找原平台的运动轨迹。
[0205]3.生物化学检测:行为学实验测试结束后，处死小鼠，迅速取出脑组织，用生理盐水制成10%匀浆，放入低温离心机中，3000r/min 4°C离心lOmin，取上清液装入试管中冷冻备用，按照试剂盒说明书进行ACh、AChE的测定。
[0206]试验组1:模型小鼠，经口给予百合花醇提物0.5g/kg，连续21天，于第16天开始进行Morris水迷宫测试，并记录其逃避潜伏期及寻找原平台的运动轨迹。行为学试验测试结束后，按照生物化学检测方法，进行乙酰胆碱(ACh)、乙酰胆碱酯酶(AChE)的测定；
[0207]试验组2:除将给予百合花醇提物0.5g/kg替换为给予百合花水提物0.5g/kg外，其余均与试验组I相同；
[0208]试验组3:除将给予百合花醇提物0.5g/kg替换为给予百合花石油醚提取物0.5g/kg外，其余均与试验组I相同；
[0209]对照组1:正常小鼠，不给予药物，进行Morris水迷宫测试，并记录其逃避潜伏期及寻找原平台的运动轨迹。行为学试验测试结束后，按照生物化学检测方法，进行乙酰胆碱(ACh)、乙酰胆碱醋酶(AChE)的测定；
[0210]对照组2:模型小鼠，不给予药物，进行Morris水迷宫测试，并记录其逃避潜伏期及寻找原平台的运动轨迹。行为学试验测试结束后，按照生物化学检测方法，进行乙酰胆碱(ACh)、乙酰胆碱醋酶(AChE)的测定；
[0211]对照组3:除将给予百合花醇提物0.5g/kg替换为给予加兰他敏2mg/kg外，其余均与试验组I相同。
[0212]三、试验结果
[0213]结果显示，对照组I中，正常小鼠，逃避潜伏期为17.38±7.97s，ACh含量为39.39±2.50pmol/mg prot, AChE 活性为 0.67±0.19U/mg prot ；
[0214]对照组2中，未给药的模型小鼠，逃避潜伏期为34.25±5.52s，ACh含量为25.61 ±3.20pmol/mg prot, AChE 活性为 1.35±0.24U/mg prot ；
[0215]试验组I中，模型小鼠给予百合花醇提物0.5g/kg，逃避潜伏期为23.25±5.85s，ACh 含量为 35.12±3.87pmol/mg prot, AChE 活性为 0.81 ±0.38U/mg prot ；
[0216]试验组2中，模型小鼠给予百合花水提物0.5g/kg，逃避潜伏期为25.62±4.89s，ACh 含量为 33.08±6.llpmol/mg prot，AChE 活性为 1.07±0.41U/mg prot ；
[0217]试验组3中，模型小鼠给予百合花石油醚提取物0.5g/kg，逃避潜伏期为29.33±6.74，ACh 含量为 30.95±5.llpmol/mg prot, AChE 活性为 1.18±0.32U/mg prot ；
[0218]对照组3中，模型小鼠给予加兰他敏2mg/kg，逃避潜伏期为19.84±4.23s,ACh含量为 37.85± 1.83pmol/mg prot，AChE 活性为 0.72±0.56U/mg proto
[0219]各组小鼠在第五天的游泳路径，如图2所示。表明百合花提取物能够显著改善东莨菪碱所致小鼠的记忆获得性障碍作用，并能有效拮抗东莨菪碱引起的脑内乙酰胆碱酯酶活力增高。通过对乙酰胆碱酯酶活性的抑制，从而达到抗老年痴呆的作用。
[0220]试验例3百合花提取物对脑卒中的改善试验
[0221]一、材料和动物
[0222]1、受试样品:
[0223]样品1:百合花醇提物；
[0224]样品2:百合花水提物；
[0225]样品3:百合花石油醚提取物；
[0226]对照品:依达拉奉(临床用抗脑卒中药物)。
[0227]2、动物:小鼠为SPF级SD雄性大鼠，体重200_220g ;武汉大学动物试验中心提供，动物合格证号为N0.00014833，生产许可证号:SCXK (鄂)2008-2004。鼠饲料，购于武汉大学试验动物中心。
[0228]二、试验方法:
[0229]1.动物模型建立:
[0230]大鼠随机分组:假手术组，即对照组I ;模型组，即对照组2 ;模型+依达拉奉组，即对照组3 ;模型+百合花醇提物组，即试验组I ;模型+百合花水提物组，即试验组2 ;模型+百合花石油醚提取物组，即试验组3。
[0231 ] 依据改良线栓MCAo模型建立脑缺血模型，除假手术组外，其余各组大鼠用10 %水合氯醛(3.5ml/kg)静脉注射麻醉。仰卧位固定，颈正中线切口，沿胸锁乳突肌内缘分离肌肉和筋膜，分离左侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)和颈内动脉(ICA)，在CCA远心端和近心端及ECA处挂线备用。用微动脉夹暂时夹闭ICA，然后近心端结扎CCA、ECA。然后在距CCA分叉部约4_处剪一小口，将拴线插入CCA后进入ICA，直至颅底，越过MCA的起始部，到达大脑前动脉(ACA)的近端，这时用绕在CCA远心端的细线轻轻系牢拴线。缝合伤口，单笼饲养观察。2h后拔线栓实现再灌注。
[0232]假手术组大鼠用10%水合氯醛(3.5ml/kg)静脉注射麻醉。仰卧位固定，颈正中线切口，沿胸锁乳突肌内缘分离肌肉和筋膜，分离左侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)和颈内动脉(ICA)后缝合上后即可。
[0233]2.检测指标:
[0234](I)神经行为学评分:
[0235]麻醉苏醒后，由一不了解分组情况的观察者进行神经行为学评分。将动物放回鼠笼，自由饮食.脑缺血再灌注后24h，由不了解分组情况的第二位观察者评估记录神经行为学评分，按Zea-Longa等的6级评分法:0级，无功能障碍；1级，不能伸展左侧前肢；2级，向左侧旋转；3级，向左侧倾倒；4级，无自主活动伴意识抑制；5级，死亡。
[0236](2) TTC 染色:
[0237]动物于栓塞后24h，麻醉，取脑。一 20度冰箱中速冻30分钟左右，切片:切成8-10片，每隔1.5mm切一片。切片置于2% TTC染色剂(2g溶于10mlPBS缓冲液)中，用锡箔纸盖住后，放入370°C温箱30min，不时翻动脑片，使均匀接触到染色液。染色后扫描仪扫描切片，用image pro plus图像处理软件计算梗死体积；
[0238]梗死体积=[(VC - VL) /V C]，VC是对照半球体积，VL是损伤半球非梗死体积。
[0239]试验组1:模型小鼠，经口给予百合花醇提物0.5g/kg，于缺血后2小时，一次给予上述药物，采用6分法进行行为学评分。于24h后，处死动物，取脑，TTC染色后，计算梗死体积；
[0240]试验组2:除将给予百合花醇提物0.5g/kg替换为给予百合花水提物0.5g/kg外，其余均与试验组I相同；
[0241 ] 试验组3:除将给予百合花醇提物0.5g/kg替换为给予百合花石油醚提取物0.5g/kg外，其余均与试验组I相同；
[0242]对照组1:假手术组小鼠，不给予药物，其他与试验组I相同；
[0243]对照组2:模型小鼠，不给予药物，其他与试验组I相同；
[0244]对照组3:除将给予百合花水提物0.5g/kg替换为给予依达拉奉6mg/kg外，其余均与试验组I相同。
[0245]三、试验结果
[0246]结果显示，对照组I中，未给药的假手术组小鼠，梗死体积为0.0110±0.004，行为学评分为0.85±0.11 ;
[0247]对照组2中，未给药的模型小鼠，梗死体积为0.3241±0.079，行为学评分为
3.43±0.52 ；
[0248]对照组3中，模型小鼠给予依达拉奉6mg/kg，，梗死体积为0.1428±0.066，行为学评分为 2.35 ± 0.14 ；
[0249]试验组I中，模型小鼠给予百合花醇提物0.5g/kg，梗死体积为0.1012±0.044，行为学评分为2.09 ± 0.45 ；
[0250]试验组2中，模型小鼠给予百合花水提物0.5g/kg，梗死体积为0.0765±0.032，行为学评分为1.46±0.23 ；
[0251]试验组3中，模型小鼠给予百合花石油醚提取物0.5g/kg，梗死体积为
0.1872±0.067，行为学评分为 2.67±0.34。
[0252]各组小鼠脑梗死体积，如图3所示。表明百合花提取物可改善脑卒中，且百合花水提物和百合花醇提物的作用明显优于其他现有文献报道的化合物或现有临床使用药物。
[0253]试验例4百合花提取物对精神分裂症的改善试验
[0254]—、材料和动物
[0255]1、受试样品:
[0256]样品1:百合花醇提物；
[0257]样品2:百合花水提物；
[0258]样品3:百合花石油醚提取物；
[0259]对照品:氯丙嗪(临床用抗精神分裂症药物)。
[0260]2、动物:采用苯丙胺诱导的精神分裂模型的小鼠。小鼠为SPF级SD雄性大鼠，体重200-220g ;武汉大学动物试验中心提供，动物合格证号为N0.00014833，生产许可证号:SCXK(鄂)2008-2004。鼠饲料，购于武汉大学试验动物中心。
[0261]二、试验方法:
[0262]试验组1:采用苯丙胺诱导的精神分裂模型的小鼠，经口给予百合花醇提物0.5g/kg，连续7天，进行旷场试验及5分法刻板行为评分；
[0263]试验组2:除将给予百合花醇提物0.5g/kg替换为给予百合花水提物0.5g/kg外，其余均与试验组I相同；
[0264]试验组3:除将给予百合花醇提物0.5g/kg替换为给予百合花石油醚提取物0.5g/kg外，其余均与试验组I相同；
[0265]对照组1:正常小鼠，不给予药物，其他与试验组I相同；
[0266]对照组2:采用苯丙胺诱导的精神分裂模型的小鼠，不给予药物，其他与试验组I相同；
[0267]对照组3:除将经口给予百合花醇提物0.5g/kg替换为腹腔注射氯丙嗪4mg/kg夕卜，其余均与试验组I相同。
[0268]三、试验结果
[0269]结果显示，对照组I中，正常小鼠，穿格次数为231.48±28.53，刻板行为评分为
1.45±0.42 ；
[0270]对照组2中，未给药的模型小鼠，穿格次数为331.48±18.53，刻板行为评分为
2.85±0.12 ；
[0271]试验组I中，模型小鼠给予百合花醇提物0.5g/kg，穿格次数为257.16±25.14，刻板行为评分为2.05 ± 0.36 ；
[0272]试验组2中，模型小鼠给予百合花水提物0.5g/kg，穿格次数为242.33±23.48，刻板行为评分为1.86±0.27 ；
[0273]试验组3中，模型小鼠给予百合花石油醚提取物0.5g/kg，穿格次数为286.75 ±30.01，刻板行为评分为 2.42 ± 0.55 ；
[0274]对照组3中，模型小鼠给予依达拉奉6mg/kg，穿格次数为240.33± 13.99，刻板行为评分为1.78±0.10。
[0275]表明百合花提取物能增加自主性活动，减轻刻板行为，改善精神分裂症状。
[0276]试验例5百合花提取物对重症肌无力的改善试验
[0277]一、材料和动物
[0278]1、受试样品:
[0279]样品1:百合花醇提物；
[0280]样品2:百合花水提物；
[0281]样品3:百合花石油醚提取物。
[0282]2、动物:采用试验性自身免疫性重症肌无力动物模型的小鼠。小鼠为SPF级SD雄性大鼠，体重200-220g ;武汉大学动物试验中心提供，动物合格证号为N0.00014833，生产许可证号:SCXK(鄂)2008-2004。鼠饲料，购于武汉大学试验动物中心。
[0283]二、试验方法:
[0284]试验组11:采用试验性自身免疫性重症肌无力动物模型的小鼠，于免疫后第10天，每日灌胃给药治疗，给予百合花醇提物0.lg/kg，直至大鼠发病高峰期第40天。使用流式细胞仪检测大鼠淋巴结中TNF-a+淋巴细胞的百分比；酶联免疫吸附法检测大鼠血清中R97-116IgG2a和IgG2b抗体的水平；
[0285]试验组12:百合花醇提物的用量为0.5g/kg，其他均与试验组I相同；
[0286]试验组21:除将给予百合花醇提物0.lg/kg替换为给予百合花水提物0.lg/kg夕卜，其余均与试验组I相同；
[0287]试验组22:除将给予百合花醇提物0.lg/kg替换为给予百合花水提物0.5g/kg夕卜，其余均与试验组I相同；
[0288]试验组31:除将给予百合花醇提物0.lg/kg替换为给予百合花石油醚提取物0.lg/kg外，其余均与试验组I相同；
[0289]试验组32:除将给予百合花醇提物0.lg/kg替换为给予百合花石油醚提取物0.5g/kg外，其余均与试验组I相同；
[0290]对照组1:采用试验性自身免疫性重症肌无力动物模型的小鼠，不给予药物，其他与试验组I相同；
[0291]对照组2:采用正常小鼠，不给予药物，其他与试验组I相同。
[0292]三、试验结果
[0293]结果显示，
[0294]对照组I中，未给药的模型小鼠，TNF-a+淋巴细胞的百分比为(4.91±0.31) %，R97-116IgG2a 抗体水平为 0.192 ±0.004，R97_116IgG2b 抗体水平为 0.536 ±0.044 ；
[0295]对照组2中，正常小鼠，TNF-a+淋巴细胞的百分比为(2.75±0.22) %，R97-116IgG2a 抗体水平为 0.143±0.002，R97_116IgG2b 抗体水平为 0.189±0.032 ；
[0296]试验组11中，模型小鼠给予百合花醇提物0.lg/kg, TNF-a+淋巴细胞的百分比为(4.45±0.35)%，R97-116IgG2a 抗体水平为 0.187±0.006，R97_116IgG2b 抗体水平为0.473±0.021 ；
[0297]试验组12中，模型小鼠给予百合花醇提物0.5g/kg，TNF-a+淋巴细胞的百分比为(3.53±0.61)%，R97-116IgG2a 抗体水平为 0.166±0.010，R97_116IgG2b 抗体水平为0.312±0.018 ；
[0298]试验组21中，模型小鼠给予百合花水提物0.lg/kg, TNF-a+淋巴细胞的百分比为(4.77±0.55)%，R97-116IgG2a 抗体水平为 0.190±0.003，R97_116IgG2b 抗体水平为0.485±0.030 ；
[0299]试验组22中，模型小鼠给予百合花水提物0.5g/kg，TNF_a+淋巴细胞的百分比为(3.69±0.41) %，R97-116IgG2a 抗体水平为 0.171±0.008，R97_116IgG2b 抗体水平为0.338±0.025 ；
[0300]试验组31中，模型小鼠给予百合花石油醚提取物0.lg/kg, TNF-a+淋巴细胞的百分比为(4.12±0.36) %，R97-116IgG2a抗体水平为 0.179±0.005，R97_116IgG2b 抗体水平为 0.442±0.015 ；
[0301]试验组32中，模型小鼠给予百合花石油醚提取物0.5g/kg，TNF-a+淋巴细胞的百分比为(3.08±0.43) %，R97-116IgG2a抗体水平为 0.156±0.007，R97_116IgG2b 抗体水平为 0.258±0.017。
[0302]表明百合花提取物可明显缓解重症肌无力大鼠的症状。
【权利要求】
1.百合花提取物在制备治疗神经系统疾病及肌无力疾病药物中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述神经系统性疾病为老年痴呆、脑卒中和精神分裂症；所述肌无力疾病为重症肌无力和进行性肌营养不良；所述百合花提取物是作为乙酰胆碱酯酶抑制剂使用的。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述百合花提取物是将百合花经溶剂提取得到的，所述溶剂为乙醇、蒸馏水或者石油醚。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述溶剂为乙醇，所述百合花提取物为百合花醇提物； 所述百合花醇提物是按如下方法制得的: 将百合花按固液比为1:5-15加入浓度为50-95%的乙醇，提取1-3次，每次提取l_3h，提取液合并，过滤，浓缩，即得百合花醇提物。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述溶剂为蒸馏水，所述百合花提取物为百合花水提物； 所述百合花水提物是按如下方法制得的: 将百合花按固液比为1:5-15加入蒸馏水，煎煮1-3次，每次煎煮l_3h，煎煮液合并，过滤，浓缩，即得百合花水提物。
6.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述溶剂为石油醚，所述百合花提取物为百合花石油醚提取物； 所述百合花石油醚提取物是按如下方法制得的: 将百合花按固液比为1:5-15加入石油醚，提取1-3次，每次提取l_3h，提取液合并，过滤，浓缩，然后加乙醇稀释，即得百合花石油醚提物。
7.如权利要求4-6任一项所述的应用，其特征在于，将所述百合花提取物制成口服制剂，所述口服制剂由以下重量份的成分制得: 80-120重量份的百合花制得的百合花提取物； 30-40重量份的淀粉； 70-80重量份的糊精； 1-3重量份的硬脂酸镁； 4-8重量份的滑石粉； 8-12重量份的乙醇。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述口服制剂为片剂或胶囊剂。
9.如权利要求4-6任一项所述的应用，其特征在于，将所述百合花提取物制成注射制剂，所述注射制剂由以下重量份的成分制得: 80-120重量份的百合花制得的百合花提取物； 与百合花的固液比为1:5-15的注射用水。
10.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述百合花提取物的用药剂量为.0.1-0.5g/kgo
【文档编号】A61P25/00GK104435581SQ201410773769
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年12月15日 优先权日:2014年12月15日
【发明者】丁虹, 陶莉, 王玉婷, 杜思达 申请人:武汉华纳联合药业有限公司