本申请要求2013年6月28日提交的美国临时申请号61/840,618的权益，其内容通过引用以其全文结合到本文中。
发明领域
本公开内容涉及一种包含钙敏感受体的肽激动剂的液体制剂，特别是涉及这样一种制剂，其在经过一段长时期的贮存后仍保持稳定。本公开内容还涉及制备和使用该制剂的方法。
发明背景
具有降低副甲状腺激素水平的活性的各种化合物已有描述。参见国际公布号WO2011/014707。在一个实施方案中，所述化合物可表示如下：
主链具有7个氨基酸，全部均呈D-构型和侧链半胱氨酸残基呈现为L-构型。氨基末端被乙酰化和羧基-末端被酰胺化。这种化合物(“AMG-416”)具有在血液透析患者中治疗继发性甲状旁腺功能亢进(SHPT)的用途。包含AMG-416的液体制剂可经静脉内给予受试者。AMG-416的盐酸盐可表示如下：
治疗肽对它们的制剂提出许多挑战。一般来说，肽，且特别是含有二硫键的那些肽，通常在水溶液中只有中等或差的稳定性。肽容易在高和低的pH值下进行酰胺键水解。二硫键即使在相当温和的条件(接近中性pH)下，也可能是不稳定的。此外，含二硫化物的不是环状的肽特别容易形成二聚体。因此，治疗肽通常以冻干形式(作为干粉或块状物)提供，用于后来的重新构成。治疗肽的冻干制剂具有提供长时间的稳定性的优点，但不太方便使用，因为它需要添加一种或多种稀释剂且由于使用不适当类型或数量的稀释剂导致存在错误的潜在风险，以及污染的风险。此外，冻干过程是耗时和昂贵的。
因此，存在对包含钙敏感受体的肽激动剂(如AMG416)的含水液体制剂的需求。在合适的贮存条件下在一段相应的时期保持稳定并适合于通过静脉内或其它胃肠外途径给予的液体制剂将是理想的。
发明简述
提供一种包含钙敏感受体的肽激动剂(如AMG416)的液体制剂。
在一个实施方案中，制剂的pH为约2.0-约5.0。在另一个实施方案中，制剂的pH为2.5-4.5。在另一个实施方案中，制剂的pH为2.5-4.0。在另一个实施方案中，制剂的pH为3.0-3.5。在另一个实施方案中，制剂的pH为3.0-4.0。在另一个实施方案中，制剂的pH为2.8-3.8。
在另一个实施方案中，制剂的pH用药学上可接受的缓冲剂维持。这样的缓冲剂包括，但不限于，琥珀酸盐缓冲剂、乙酸盐缓冲剂、柠檬酸盐缓冲剂和磷酸盐缓冲剂。在另一个实施方案中，缓冲剂是琥珀酸盐缓冲剂。制剂的pH可根据需要用酸或碱，如HCl或NaOH调节。
在另一个实施方案中，钙敏感受体的肽激动剂以0.1mg/mL-20mg/mL的浓度存在。在另一个实施方案中，肽以1mg/mL-15mg/mL的浓度存在。在另一个实施方案中，肽以2.5mg/mL-10mg/mL的浓度存在。在另一个实施方案中，肽以约1mg/mL、约5mg/mL或约10mg/mL的浓度存在。
在另一个实施方案中，AMG416以约0.1mg/mL-约20mg/mL的浓度存在。在一个实施方案中，AMG416以约1mg/mL-约15mg/mL的浓度存在。在另一个实施方案中，AMG416以约2.5mg/mL-约10mg/mL的浓度存在。在另一个实施方案中，AMG416以约1mg/mL、约2.5mg/mL、约5mg/mL或约10mg/mL的浓度存在。
在另一个实施方案中，AMG416以0.1mg/mL-20mg/mL的浓度存在。在一个实施方案中，AMG416以1mg/mL-15mg/mL的浓度存在。在另一个实施方案中，AMG416以2.5mg/mL-10mg/mL的浓度存在。在另一个实施方案中，AMG416以1mg/mL-5mg/mL的浓度存在。在另一个实施方案中，AMG416以5mg/mL-10mg/mL的浓度存在。在另一个实施方案中，AMG416以0.5-1.5mg/mL、2.0-3.0mg/mL、4.5-5.5mg/mL或9.5-约10.5mg/mL的浓度存在。
在另一个实施方案中，制剂还包含药学上可接受的张力调节剂或药学上可接受的张力调节剂的混合物。在另一个实施方案中，张力调节剂(或张力调节剂的混合物)以足以使制剂与体液(如，人血)大致等张的浓度存在。在另一方面，张力调节剂是NaCl。
在另一个实施方案中，所述制剂包含治疗有效量的钙敏感受体的肽激动剂。在一个优选的实施方案中，制剂包含治疗有效量的AMG416。
在另一个实施方案中，制剂当于2-8℃贮存多达2年时，具有少于10%的降解。在另一个实施方案中，制剂当于2-8℃贮存多达3年时，具有少于10%的降解。在另一个实施方案中，制剂当于2-8℃贮存多达4年时，具有少于10%的降解。
在另一个实施方案中，制剂当于2-8℃贮存多达2年时，具有少于8%的降解。在另一个实施方案中，制剂当于2-8℃贮存多达3年时，具有少于8%的降解。在另一个实施方案中，制剂当于2-8℃贮存多达4年时，具有少于8%的降解。
在另一个实施方案中，制剂当于室温下贮存3个月时，具有少于10%的降解。在另一个实施方案中，制剂当于室温下贮存多达6个月时，具有少于10%的降解。在另一个实施方案中，制剂当于室温下贮存多达1年时，具有少于10%的降解。
在另一个实施方案中，提供一种制剂，其包含0.5mg/mL-20mg/mL的呈水溶液形式的钙敏感受体的肽激动剂(如，AMG416)、维持制剂在约3.0-约3.5的pH的琥珀酸盐缓冲剂和使制剂为与人血大致等张的足够浓度的氯化钠。
附图简述
图1是于室温(RT)下，对AMG416的琥珀酸盐-缓冲盐水(pH4.5)溶液的纯度(%)作为时间(天)的函数所绘制的一系列图。图1A显示具有200、66、20、6.7、2.2和0.67mg/mL浓度AMG416的AMG416溶液的稳定性。在图1B中，比例扩大到更清楚地说明20mg/mL和以下的浓度的降解模式。
图2是于40℃对具有AMG416浓度在20、6.7、2.2和0.67mg/mL范围内的AMG41的琥珀酸盐-缓冲盐水(pH4.5)溶液的纯度(%)作为时间(天)的函数所绘制的图。
图3是于40℃对AMG416在琥珀酸盐-缓冲的盐水(pH2、3、4、5和6)中的溶液的纯度(%)作为时间(天)的函数所绘制的一系列图。在图3A中，AMG416的浓度是10mg/mL，而在图3B中，AMG416的浓度是2.5mg/mL。
图4是于2-8℃、RT和40℃，经28天对AMG416在琥珀酸盐-缓冲盐水中的溶液的纯度(%)作为pH的函数所绘制的一系列图。在图4A中，AMG416的浓度是10mg/mL，而在图4B中，AMG416的浓度是2.5mg/mL。
图5是一系列HPLC色谱图。图5A中的HPLC迹线是于40℃贮存27天的AMG416溶液(5mg/mL,pH2.25)(87.8%纯度)。在图5B中，比例扩大到更清楚地说明峰。
图6是一系列HPLC色谱图。图6A中的HPLC迹线是于40℃贮存27天的AMG416溶液(5mg/mL,pH3.5)(91.7%纯度)。在图6B中，比例扩大到更清楚地说明峰。
图7是于2-8℃对一系列AMG416的琥珀酸盐-缓冲盐水(pH2.25、2.5、3.0和3.5)中的溶液(5mg/mL)的纯度(%)作为时间(天)的函数所绘制的图。
图8是于RT下对一系列AMG416的琥珀酸盐-缓冲盐水(pH2.25、2.5、3.0和3.5)中的溶液(5mg/mL)的纯度(%)作为时间(天)的函数所绘制的图。
图9是于40℃对一系列AMG416的琥珀酸盐-缓冲盐水(pH2.25、2.5、3.0和3.5)中的溶液(5mg/mL)的纯度(%)作为时间(天)的函数所绘制的图。
图10是对一系列AMG416的琥珀酸盐-缓冲盐水(pH2.25、2.5、3.0和3.5)中的溶液(5mg/mL)的降解(%)作为时间(天)的函数所绘制的图。C-末端脱酰胺作用的时间过程于2-8℃(图10A)、RT(图10B)和于40℃(图10C)示出。注意y-轴的比例尺在各图中是不同的。
图11是对一系列AMG416的琥珀酸盐-缓冲盐水(pH2.25、2.5、3.0和3.5)中的溶液(5mg/mL)的降解(%)作为时间(天)的函数所绘制的一系列图。同型二聚体形成的时间过程于2-8℃(图11A)、RT(图11B)和于40℃(图11C)示出。注意图11C的y-轴的比例尺不同于图11A和11B中的比例尺。
图12是一系列琥珀酸盐-缓冲盐水溶液于2-8℃(图12A)、25℃(图12B)和40℃(图12C)贮存时，纯度(%)作为pH(2.8-3.8)、AMG416浓度(4-6mg/mL)和NaCl(0.7-1.0%)的函数所绘制的一系列图。
图13是一系列AMG416在琥珀酸盐-缓冲盐水(pH2.5、3.0、3.5)中的溶液(3.4mg/mL)于2-8℃(图13A)、25℃(图13B)和40℃(图13C)贮存的纯度(%)作为时间(月)的函数所绘制的一系列图。
发明详述
本文所使用的章节标题仅为文章结构目的并不视为限制所述的主题。
除非本文另外定义，否则结合本申请所用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的意义。此外，除非上下文中另外需要，否则单数术语应包括复数，和复数术语应包括单数。
一般来说，结合本文所述的分子生物学和蛋白质化学所用的术语以及本文所述的分子生物学和蛋白质化学的技术是本领域众所周知和通常使用的。本申请的方法和技术通常依据本领域熟知的常规方法和如贯穿本申请所引用和讨论的各种普通和更具体的参考文献所述进行，除非另外指明。参见，例如，Laszlo，基于肽的药物设计：方法和方案(Peptide-BasedDrugDesign:MethodsandProtocols),HumanaPress(2008)；Benoiton，肽合成化学(ChemistryofPeptideSynthesis),CRCPress(2005);Ausubel等,分子生物学的通用方案(CurrentProtocolsinMolecularBiology),GreenePublishingAssociates(1992)，其为了任何目的通过引用结合到本文中。纯化技术依据生产商的说明，如在本领域通常实施或如本文所述的进行。与本文所述的分析化学、合成有机化学和医学和药用化学结合使用的术语以及其实验室程序和技术是本领域熟知和通常使用的。标准技术可用于化学合成、化学分析、药物制备、制剂和递送，和治疗患者。
应该理解，本公开内容不限于本文所述的特定的方法、方案和试剂等，因为它们可以变化。本文所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方案的目的，并不意欲限制所公开内容的范围，该范围仅由权利要求书限定。
如本文所用的，在给定值或范围的上下文中的术语“约”指在给定值或范围的20%内，优选地在10%内，和更优选地在5%内的值或范围。
I.一般定义
按照惯例，如本文所用的“一”和“一个”意指“一个或多个”，除非另外特别地指明。
术语“AMG416”指具有以下化学名的化合物：含有L-半胱氨酸的N-乙酰基-D-半胱氨酰基-D-丙氨酰基-D-精氨酰基-D-精氨酰基-D-精氨酰基-D-丙氨酰基-D-精氨酰胺二硫化物，其可表示为：
术语“AMG416盐酸盐”或“AMG416HCl”是可互换的并指具有以下化学名的化合物：含有L-半胱氨酸的N-乙酰基-D-半胱氨酰基-D-丙氨酰基-D-精氨酰基-D-精氨酰基-D-精氨酰基-D-丙氨酰基-D-精氨酰胺二硫化物盐酸盐，其可表示为：
如本文所用的，术语“氨基酸”和“残基”是可互换的，并且当用于肽或多肽的上下文中时，指天然存在的和合成的氨基酸二者，以及氨基酸类似物、氨基酸模拟物和化学上类似于天然存在的氨基酸的非-天然存在的氨基酸。
术语“治疗”指在治疗或改善损伤、病变或病症中的任何成功的标记，包括任何客观或主观参数如消除、缓解、减轻体征或症状或使损伤、病变或病症更易为患者耐受；减慢退化或衰弱的速率；使得退化的最终点较不衰弱；改善患者的身体或精神健康。治疗或改善体征或症状可基于客观或主观参数；包括体检结果，例如，通过降低升高水平的副甲状腺激素(PTH)治疗SHPT。
本文所用的术语“治疗有效剂量”和“治疗有效量”意指在组织系统、动物或人中引起生物学或医学反应的量，这样的反应是研究者、医生或其他临床医师所寻找的，其包括缓解或改善被治疗疾病或紊乱的体征或症状，例如，引起升高的PTH水平的所需减少的AMG416的量。
本文所用的术语“室温”指约25℃的温度。如本文所用的，在“冷冻条件下”贮存指在2-8℃的温度下贮存。
术语“肽”、“多肽”和“蛋白”是可互换的并指氨基酸的聚合物，通常通过肽键或二硫键连接在一起。该术语也适用于氨基酸聚合物(其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的类似物或模拟物)，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。该术语还可涵盖已被修饰(例如通过加入碳水化合物残基，以形成糖蛋白)，或被磷酸化的氨基酸聚合物。肽、多肽和蛋白可通过液相合成或固相合成或通过基因工程或重组细胞产生。
肽或多肽的“变体”包含氨基酸序列，其中一个或多个氨基酸残基被插入该氨基酸序列，从该氨基酸序列缺失和/或取代到该氨基酸序列中(相对于另一个多肽序列)。变体包括融合蛋白。
肽或多肽的“衍生物”是以不同于插入、缺失或取代变体的某种方式经化学修饰的肽或多肽，例如，通过结合于另一个化学部分。这样的修饰可包括共价加入基团至肽或多肽的氨基末端和/或羧基末端，例如，肽或多肽的氨基末端的乙酰基化和/或羧基末端的酰胺化。
术语“氨基酸”包含其在本领域通常的含义。20个天然存在的氨基酸及其缩写遵循常规用法。参见，免疫学-A合成(Immunology-ASynthesis)，第二版，(E.S.Golub和D.R.Green编辑),SinauerAssociates:Sunderland,Mass.(1991)，其为任何目的通过引用结合到本文中。19个常规氨基酸(除了甘氨酸)、非天然氨基酸如[α]-,[α]-二取代的氨基酸、N-烷基氨基酸，和其它非常规氨基酸的立体异构体(如，D-氨基酸)也可以是多肽的合适的成分并包括在短语“氨基酸”中。非常规氨基酸的实例包括：同型半胱氨酸、鸟氨酸、4-羟基脯氨酸、[γ]-羧基谷氨酸、[ε]-N,N,N-三甲基赖氨酸、[ε]-N-乙酰基赖氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰基丝氨酸、N-甲酰基甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟基赖氨酸、[σ]-N-甲基精氨酸，和其它类似的氨基酸和亚氨基酸(如，4-羟基脯氨酸)。在本文使用的多肽符号中，根据标准用法和惯例，氨基末端在左边和羧基-末端在右边。
本文所用的“受试者”或“患者”可以是任何哺乳动物。在一个典型的实施方案中，受试者或患者是人。
本文所用的“缓冲剂”指组合物，其中组合物包含弱酸及其共轭碱(通常作为共轭碱盐)、弱碱及其共轭酸，或其混合物。本领域技术人员将容易地认识到可用于本发明所用制剂的各种缓冲剂。典型的缓冲剂包括，但不限于药学上可接受的弱酸、弱碱，或其混合物。示例性的药学上可接受的缓冲剂包括乙酸盐(如，乙酸钠)、琥珀酸盐(如，琥珀酸钠)。
短语“弱酸”是一种在水溶液中不完全电离的化学酸；即是说，如果酸由通式HA代表，则在水溶液中A-形成，但大量未解离的HA仍然存在。弱酸的酸解离常数(Ka)在1.8x10-16和55.5之间变化。
短语“弱碱”是一种在水溶液中不完全电离的化学碱；即是说，如果碱通常由通式B代表，则在水溶液中BH+形成，但大量未质子化的B仍然存在。产生的共轭弱酸BH+的酸解离常数(Ka)在1.8x10-16和55.5之间变化。
短语“共轭酸”是通过质子的获得或失去而相互转化的两种化合物(HX+，X)的一部分的酸成员，HX+。
短语“共轭碱”是通过质子的获得或失去而相互转化的两种化合物(HX，X-)的一部分的碱成员，X-。
短语“共轭碱盐”是包含共轭碱X-和带正电荷的抗衡离子的离子盐。
短语“缓冲剂系统”意指含有至少两种缓冲剂的混合物。
术语“q.s.”意指加入足以实现所需功能，例如，使溶液达到所需体积(即，100%)的量。
短语“张力调节剂”意指可加入到制剂中以调节制剂的张力的药学上可接受的惰性物质。适合于本发明的张力调节剂包括，但不限于，氯化钠、氯化钾、甘露醇或甘油和其它药学上可接受的张力调节剂。
II.实施方案
本公开内容涉及包含钙敏感受体的肽激动剂的液体制剂，其中制剂的pH为约2.0-约5.0。在一个优选的实施方案中，本公开内容涉及包含AMG416的液体制剂，其中制剂的pH为约2.0-约5.0。AMG416及其制备在国际专利公布号WO2011/014707中描述。例如，AMG416可经固相合成，从相应的Fmoc-保护的D-氨基酸装配。从树脂裂解后，材料可用Boc-L-Cys(NPyS)-OH处理，以形成二硫键。然后可用三氟乙酸(TFA)除去Boc基团，生成的产物经反相高压液相色谱(HPLC)纯化并经冻干分离为TFA盐形式。TFA盐可通过进行随后的盐交换程序，转化为药学上可接受的盐。这样的程序是本领域熟知的并包括例如，离子交换技术，任选地接着纯化生成的产物(例如经反相液相色谱或反渗透)。
本文公开的制剂主要是根据作为活性成分的治疗肽，AMG416进行描述。然而，技术人员容易理解，本公开内容也延伸到AMG416的变体和衍生物。
例如，在一个实施方案中，所公开的制剂也可与含有D-半胱氨酸的N-乙酰基-D-半胱氨酰基-D-丙氨酰基-D-精氨酰基-D-精氨酰基-D-精氨酰基-D-丙氨酰基-D-精氨酰胺二硫化物一起使用。在另一个实施方案中，所公开的制剂也可与含有N-乙酰基-D-半胱氨酸的N-乙酰基-D-半胱氨酰基-D-丙氨酰基-D-精氨酰基-D-精氨酰基-D-精氨酰基-D-丙氨酰基-D-精氨酰胺二硫化物一起使用。在另一个实施方案中，所公开的制剂也可与含有N-乙酰基-L-半胱氨酸的N-乙酰基-D-半胱氨酰基-D-丙氨酰基-D-精氨酰基-D-精氨酰基-D-精氨酰基-D-丙氨酰基-D-精氨酰胺二硫化物一起使用。
在另一个实施方案中，所公开的制剂也可与含有D-半胱氨酸的N-乙酰基-L-半胱氨酰基-L-丙氨酰基-L-精氨酰基-L-精氨酰基-L-精氨酰基-L-丙氨酰基-L-精氨酰胺二硫化物一起使用。在另一个实施方案中，所公开的制剂也可与含有L-半胱氨酸的N-乙酰基-L-半胱氨酰基-L-丙氨酰基-L-精氨酰基-L-精氨酰基-L-精氨酰基-L-丙氨酰基-L-精氨酰胺二硫化物一起使用。在另一个实施方案中，所公开的制剂也可与含有N-乙酰基-D-半胱氨酸的N-乙酰基-L-半胱氨酰基-L-丙氨酰基-L-精氨酰基-L-精氨酰基-L-精氨酰基-L-丙氨酰基-L-精氨酰胺二硫化物一起使用。在另一个实施方案中，所公开的制剂也可与含有N-乙酰基-L-半胱氨酸的N-乙酰基-L-半胱氨酰基-L-丙氨酰基-L-精氨酰基-L-精氨酰基-L-精氨酰基-L-丙氨酰基-L-精氨酰胺二硫化物一起使用。
在另一个实施方案中，所公开的制剂也可与含有D-半胱氨酸的N-乙酰基-D-半胱氨酰基-D-精氨酰基-D-精氨酰基-D-丙氨酰基-D-精氨酰基-D-丙氨酰基-D-精氨酰胺二硫化物一起使用。在另一个实施方案中，所公开的制剂也可与含有L-半胱氨酸的N-乙酰基-D-半胱氨酰基-D-精氨酰基-D-精氨酰基-D-丙氨酰基-D-精氨酰基-D-丙氨酰基-D-精氨酰胺二硫化物一起使用。在另一个实施方案中，所公开的制剂也可与含有N-乙酰基-D-半胱氨酸的N-乙酰基-D-半胱氨酰基-D-精氨酰基-D-精氨酰基-D-丙氨酰基-D-精氨酰基-D-丙氨酰基-D-精氨酰胺二硫化物一起使用。在另一个实施方案中，所公开的制剂也可与含有N-乙酰基-L-半胱氨酸的N-乙酰基-D-半胱氨酰基-D-精氨酰基-D-精氨酰基-D-丙氨酰基-D-精氨酰基-D-丙氨酰基-D-精氨酰胺二硫化物一起使用。
在另一个实施方案中，所公开的制剂也可与含有D-半胱氨酸的N-乙酰基-L-半胱氨酰基-L-精氨酰基-L-精氨酰基-L-丙氨酰基-L-精氨酰基-L-丙氨酰基-L-精氨酰胺二硫化物一起使用。在另一个实施方案中，所公开的制剂也可与含有L-半胱氨酸的N-乙酰基-L-半胱氨酰基-L-精氨酰基-L-精氨酰基-L-丙氨酰基-L-精氨酰基-L-丙氨酰基-L-精氨酰胺二硫化物一起使用。在另一个实施方案中，所公开的制剂也可与含有N-乙酰基-D-半胱氨酸的N-乙酰基-L-半胱氨酰基-L-精氨酰基-L-精氨酰基-L-丙氨酰基-L-精氨酰基-L-丙氨酰基-L-精氨酰胺二硫化物一起使用。在另一个实施方案中，所公开的制剂也可与含有N-乙酰基-L-半胱氨酸的N-乙酰基-L-半胱氨酰基-L-精氨酰基-L-精氨酰基-L-丙氨酰基-L-精氨酰基-L-丙氨酰基-L-精氨酰胺二硫化物一起使用。
在另一个实施方案中，所公开的制剂也可与国际专利公布号WO2011/014707的表1、表2、表3、表4、表5、表6、表7、表8、表9和/或表10中提供的一个或多个化合物一起使用。在另一个实施方案中，所公开的制剂也可与国际专利公布号WO2011/014707中描述的一个或多个化合物一起使用。
在一些实施方案中，所述制剂包含治疗有效量的活性成分(如，AMG416)。在本公开内容的制剂的任何给定实施方案中，活性成分的治疗有效量将取决于要传递至给定受试者的制剂的体积，以及受试者的年龄和体重，和被治疗的疾病或紊乱的性质。取决于剂型，在一些情况下，可在一次用药中将治疗有效量提供给患者，而在其它情况下，可需要多次给药。
本公开内容的液体制剂是适合于通过静脉内、动脉内、肌内和皮下给予的药用组合物。在一优选的实施方案中，液体制剂适合于通过静脉内或其它胃肠外途径给予。优选地，液体制剂是无菌的水性溶液。典型地，溶剂是注射级用水或水与一种或多种其它水-可混溶溶剂(如丙二醇、聚乙二醇和乙醇)的混合物。使用无菌去离子水作为溶剂是优选的。然而，可采用适合和常规用于药用制剂的其它溶剂。
制剂典型地包含约0.1mg/mL-约100mg/mL活性成分(如，AMG416)、约0.1mg/mL-约20mg/mL活性成分、约0.5mg/mL-约15mg/mL活性成分、约1mg/mL-约10mg/mL活性成分，或约2mg/mL-约5mg/mL活性成分。在一些实施方案中，制剂包含约1mg/mL活性成分、约2mg/mL活性成分、约2.5mg/mL活性成分、约5mg/mL活性成分、约10mg/mL活性成分或约20mg/mL活性成分。在另一个实施方案中，制剂包含0.1mg/mL-100mg/mL活性成分、0.1mg/mL-20mg/mL活性成分、0.5mg/mL-15mg/mL活性成分，或1mg/mL-10mg/mL活性成分，或2mg/mL-5mg/mL活性成分。在一优选的实施方案中，制剂包含1mg/mL-10mg/mL活性成分。在另一个优选的实施方案中，制剂包含2mg/mL-5mg/mL活性成分。
制剂典型具有约2.0-约5.0的pH、约2.5-约4.5的pH、约2.5-约4.0的pH、约3.0-约3.5的pH或约3.0-约3.6的pH。在一些实施方案中，制剂具有约2的pH、约2.5的pH、约3.0的pH或约3.3的pH、约3.5的pH或约4.0的pH。在一些实施方案中，制剂具有2.0-5.0的pH、2.5-4.5的pH、2.5-约4.0的pH、3.0-3.5的pH或3.0-3.6的pH。
如在实施例中更全面描述的，AMG416的稳定性取决于溶液的pH。本发明人已经发现，两个主要降解产物是由于C-末端脱酰胺作用和同型二聚体形成的结果。此外，本发明人已经发现，经这些途径降解的时间过程是pH的函数。参见实施例6。在低pH时，经C-末端脱酰胺作用的降解占优势(见图10)，而在较高的pH时，经同型二聚体形成的降解占优势(见图11)。因此，两个主要降解产物的形成在pH和降解的程度之间有相反的关系。这些相反的趋势形成pH值范围内整体稳定性数据的基础并支持将约pH3.0-3.5鉴定为AMG416溶液的最大稳定性的pH。
典型地，制剂包含维持制剂的pH在所需范围内的生理学上可接受的缓冲剂。在一个实施方案中，缓冲剂维持约2.0-约5.0的pH、约2.5-约4.5的pH、约2.5-约4.0的pH、约3.0-约3.5的pH或约3.0-约3.6的pH。在一些实施方案中，缓冲剂维持约2的pH、约2.5的pH、约3.0的pH、约3.3的pH、约3.5的pH或约4.0的pH。在一些实施方案中，缓冲剂维持2.0-5.0的pH、2.5-4.5的pH、2.5-约4.0的pH、3.0-3.5的pH或3.0-3.6的pH。
能够维持制剂的pH在上文提供的任何pH或在任何pH范围内的任何缓冲剂适合用于本公开内容的制剂，只要它不与制剂的其它成分反应，造成显著的沉淀形成，或者以其它方式使得活性成分成为化学不稳定的。用于本发明制剂的缓冲剂典型地包含选自以下的组分：琥珀酸盐、柠檬酸盐、苹果酸盐、依地酸盐、组氨酸、乙酸盐、己二酸盐、乌头酸盐、抗坏血酸盐、苯甲酸盐、碳酸盐、碳酸氢盐、马来酸盐、谷氨酸盐、乳酸盐、磷酸盐和酒石酸盐，或这些缓冲剂的混合物。在一个优选的实施方案中，缓冲剂包含琥珀酸盐，如琥珀酸钠。
选择缓冲剂的浓度以便提供pH稳定以及足够的缓冲能力。在一个实施方案中，缓冲剂以约0.5-约100mmol/L、约0.75-约50mmol/L、约1-约20mmol/L，或约10-约20mmol/L的浓度存在于制剂中。在其它实施方案中，缓冲剂以约5mmol/L、约10mmol/L、约15mmol/L或约20mmol/L存在。在其它实施方案中，缓冲剂以0.5-100mmol/L、0.75-50mmol/L、1-20mmol/L，或10-20mmol/L的浓度存在于制剂中。在一个优选的实施方案中，缓冲剂以约10mmol/L存在。在另一个优选的实施方案，缓冲剂是以约10mmol/L存在的琥珀酸盐。
从液体制剂与静脉内给药的相容性的观点来看，使液体制剂的pH尽可能地接近生理pH将是合乎需要的。具有远离生理pH的pH或为强烈缓冲的液体制剂当给予时可引起疼痛或不适。如已经讨论的，AMG416的液体制剂在生理pH或更高的pH下将不能保持长时间的稳定。因此，在一个优选的实施方案中，本公开内容的液体制剂是弱缓冲的，以致注射的量通过受试者的生理体液被迅速地中和。令人惊奇的是，良好的稳定性和良好的pH控制用低缓冲剂浓度维持。在一优选的实施方案中，AMG416的HCl盐用于制备液体制剂以最大限度地减少缓冲能力。由于HCl是强酸，它不能用作缓冲剂。这提供了超过使用弱酸，如乙酸的优点。使用AMG416的乙酸盐，例如，其本身将提供一些缓冲能力并允许较少的适应性来设置该制剂的缓冲能力，并可导致制剂更加抵抗体内的中和并因此不是良好耐受的。由于AMG416是一种聚阳离子肽，与大多数具有更中性特征的肽相比，效果会增强。
通常可取的是，经静脉内或其它胃肠外途径给予的制剂是与体液等张的。在一些实施方案中，本公开内容的制剂包含生理学上可接受的张力调节剂。可用于本公开内容的张力调节剂可包括氯化钠、甘露醇、蔗糖、右旋糖、山梨醇、氯化钾，或其混合物。在一优选的实施方案中，张力调节剂是氯化钠。
当存在张力剂时，其优选地以足以使液体制剂与体液大致等张(即，约270-约300mOsm/L)的量存在并适合于胃肠外注射到哺乳动物，如人受试者内，注射到皮内、皮下，或肌内组织或IV。等张性可通过，例如，使用蒸汽压力或冰冻式渗压计测量。取决于制剂中其它成分的浓度，氯化钠以约7.0-约10mg/mL、约7.5-约9.5mg/mL，或约8.0-约9.0mg/mL的浓度存在于制剂中。在一个实施方案中，氯化钠以约8.5mg/mL的浓度存在于制剂中。在其它实施方案中，氯化钠以7.0-10mg/mL、7.5-9.5mg/mL或8.0-9.0mg/mL的浓度存在于制剂中。
本公开内容的制剂可包括其它常规药用载体、赋形剂或辅助剂。例如，本发明的制剂可包括稳定剂(如，EDTA和/或硫代硫酸钠)或防腐剂(如，苄醇)。此外，本公开内容的制剂可包括另外的医用和/或药用剂。例如，在治疗患有CKD-MBD的血液透析患者的SHPT的方法中，AMG416可与在肾性骨营养障碍中一种或多种活性剂，如已确立治疗SHPT的维生素D疗法(如，帕立骨化醇)共同给予。
在一个实施方案中，当于约2-8℃贮存1年时，制剂具有少于5%的降解。在另一个实施方案中，当于室温下贮存1年时，制剂的降解少于5%。在另一个实施方案中，当于约2-8℃贮存1年时，制剂的降解少于10%。在另一个实施方案中，当于室温下贮存1年时，制剂的降解少于10%。在另一个实施方案中，当于约2-8℃贮存2年时，制剂的降解少于5%。在另一个实施方案中，当于室温下贮存2年时，制剂的降解少于5%。在另一个实施方案中，当于约2-8℃贮存2年时，制剂的降解少于10%。在另一个实施方案中，当于室温下贮存2年时，制剂的降解少于10%。
在一个实施方案中，提供包含0.1mg/mL-20mg/mL的治疗肽、维持制剂于2.0-5.0的pH的缓冲剂，和使制剂为大致等张的足够浓度的氯化钠的液体制剂。在另一个实施方案中，提供包含1mg/mL-15mg/mL的治疗肽、维持制剂于2.5-4.5的pH的缓冲剂，和使制剂为大致等张的足够浓度的氯化钠的液体制剂。在另一个实施方案中，提供包含2.5mg/mL-10mg/mL的治疗肽、维持制剂于2.5-4.0的pH的缓冲剂，和使制剂为大致等张的足够浓度的氯化钠的液体制剂。在另一个实施方案中，提供包含2.5mg/mL-5mg/mL的治疗肽、维持制剂于2.5-3.5的pH的缓冲剂，和使制剂为大致等张的足够浓度的氯化钠的液体制剂。在另一个实施方案中，提供包含2mg/mL-20mg/mL的治疗肽水溶液、维持制剂于约3.0-3.5的pH的琥珀酸盐缓冲剂，和使制剂为大致等张的足够浓度的氯化钠的制剂。
在一个实施方案中，提供包含0.1mg/mL-20mg/mL的AMG416、维持制剂于2.0-5.0的pH的缓冲剂，和使制剂为大致等张的足够浓度的氯化钠的液体制剂。在另一个实施方案中，提供包含1mg/mL-15mg/mL的AMG416、维持制剂于2.5-4.5的pH的缓冲剂，和使制剂为大致等张的足够浓度的氯化钠的液体制剂。在另一个实施方案中，提供包含2.5mg/mL-10mg/mL的AMG416、维持制剂于2.5-4.0的pH的缓冲剂，和使制剂为大致等张的足够浓度的氯化钠的液体制剂。在另一个实施方案中，提供包含2.5mg/mL-5mg/mL的AMG416、维持制剂于2.5-3.5的pH的缓冲剂，和使制剂为大致等张的足够浓度的氯化钠的液体制剂。在另一个实施方案中，提供包含2mg/mL-20mg/mL的AMG416的水溶液、维持制剂于约3.0-3.5的pH的琥珀酸盐缓冲剂，和使制剂为大致等张的足够浓度的氯化钠的制剂。
在一优选的实施方案中，本公开内容的制剂通过将计算产生所需pH的量的缓冲剂放入合适的容器并用注射用水(WFI)溶解，加入足以达到所需浓度的活性成分(如，AMG416)的量的材料(如，AMG416的盐酸盐)，加入经计算使生成的制剂与体液等张的量的张力调节剂(或张力调节剂的混合物)，并加入使总体积达到所需浓度所必需的量的WFI来制备。混合各成分后，将pH调节至约3.0-约3.5，并再次混合各成分。
如果需要调节以达到所需pH范围，pH值可通过合适的溶液调节；如果需要pH值降低，则用酸性溶液调节，而如果需要pH值升高，则用碱性溶液调节。合适的酸性溶液的非-限制性实例为，例如盐酸、磷酸、柠檬酸和磷酸氢钠或磷酸氢钾。合适的碱性溶液的非-限制性实例为碱金属和碱土金属氢氧化物、碱金属碳酸盐、碱金属乙酸盐、碱金属柠檬酸盐和二碱金属磷酸氢盐，例如氢氧化钠、乙酸钠、碳酸钠、柠檬酸钠、磷酸氢二钠或磷酸氢二钾，或氨水。
该程序典型地在约2-8℃至约50℃的温度下，和在大气压下进行。然后可将产生的制剂在使用前转移到单位剂量或多-剂量容器(如瓶、小管、安瓿或预装填的注射器)中贮存。
所述制剂可如上所述制备和给予。或者，制剂可在将制剂(如上所述制备)溶解、分散(等)于载体(例如输注液体)或在血液透析(如，反洗(rinse-back))期间返回到患者的血/液体中后给予。
依据本公开内容的液体制剂的制备是已知的，或对本领域技术人员而言将是显而易见的，例如，参见Remington’sPharmaceuticalSciences,MackPublishingCompany,Easton,PA,第17版,1985。
实施例
提供以下实施例，包括进行的实验和获得的结果，仅为了举例说明的目的，而不视为限制所附权利要求书的范围。
实施例1
AMG416在琥珀酸盐缓冲盐水中的溶解性
在这个研究中，AMG416在琥珀酸盐缓冲盐水中的溶解性被研究。使AMG416HCl(103mg粉末，80mg肽)溶于200μL琥珀酸钠缓冲盐水(25mM琥珀酸盐，0.9%盐水，pH4.5)中。短暂涡流后，获得具有400mg/mL的标称浓度的澄清溶液。因为溶液体积的膨胀并没有确定，AMG416的溶解性可以保守地认为是至少200mg/mL。虽然在这个实验中未确定最大溶解度，但AMG416在pH4.5的琥珀酸盐缓冲盐水中至至少200mg/mL的浓度是可溶的。
实施例2
浓度依赖的稳定性研究
在这个研究中，AMG416在琥珀酸盐-缓冲盐水(pH4.5)中的浓度范围的稳定性被研究。得自如上实施例1的200mg/mLAMG416溶液用200μL琥珀酸盐-缓冲盐水(pH4.5)进一步稀释至标称浓度200mg/mL，其用琥珀酸盐-缓冲盐水(pH4.5)系列稀释至66、20、6.7、2.2和0.67mg/mL。样品保持于室温下(即，约25℃)，等分试样以至多29天的时间间隔，经HPLC分析。覆盖浓度范围20-0.67mg/mL的第二系列的AMG416样品于40℃孵育并以相同的方式分析。
于室温和40℃，在29-天时间点的样品纯度分别在表1和2中提供。结果提供作为浓度和温度的函数的AMG416的稳定性分布。
表1
AMG416在25mM琥珀酸盐-缓冲盐水(pH4.5)中的RT稳定性
表2
AMG416在25mM琥珀酸盐-缓冲盐水(pH4.5)中的40℃稳定性
于室温下，AMG416降解作为浓度的函数的时间过程示于图1A。在图1B中，比例扩大以更清楚地说明药物浓度为20mg/mL和以下的降解模式。于40℃，AMG416降解作为浓度的函数的时间过程示于图2中。数据显示AMG416溶液稳定性与从0.67mg/mL至200mg/mL的研究范围内的浓度相关。数据也显示AMG416溶液稳定性与孵育的温度相关。
表3显示基于在室温下，在pH4.5的SBS中贮存29天的降解程度，不同浓度的AMG416溶液于室温下降解程度的预测。来自表1的室温29-天数据通过假设线性降解动力学，外推到规定的时间段。室温数据被外推至5℃。假定20℃的差异，相当于降解速率降低4-倍。外推法使用简单应用的Arrhenius方程进行，其中温度升高10℃提供反应速率的2-倍增加，假定相同的反应机制和每一个相关反应的活化能为约50kJ/mol。
阴影值表示具有少于10%的降解的浓度/贮存条件，其对液体制剂可能是优选的。
表3
AMG416溶液的稳定性预测
在表1和2中所示的数据的比较允许评价温度增加，作为预测AMG416溶液的长期稳定性的工具。从0.67至20mg/mL的数据在下表4提出，并显示于40℃降解加速，这比由Arrhenius预测的显著更高(采用上述的假设)。这提示加速的稳定性数据将预测比在实际贮存温度下将观察到的更大程度的降解。
表4
AMG416在pH4.5溶液中降解的温度和浓度依赖性
实施例3
AMG416的液体制剂在pH范围内的稳定性
在这个研究中，测定了浓度10mg/mL的AMG416的液体制剂在琥珀酸盐-缓冲盐水的pH范围内的稳定性。使AMG416HCl(257mg粉末)溶于20ml(pH4.5)琥珀酸盐缓冲盐水，提供10.0mg/ml肽浓度(调整粉末的肽含量)。将该溶液平均地分成5个4mL部分，其按需要用NaOH和HCl分别调节至pH2、3、4、5和6。从每一部分等分出3份1mL的溶液并分别于2-8℃、室温(约25℃)和40℃孵育。在每一等分液中的剩余1mL溶液用pH4.5的琥珀酸盐缓冲盐水稀释至4mL的2.5mg/mL肽浓度，经pH调节，并以相同的方式孵育。依据计划收取样品并用去离子水稀释至1.0mg/mL，以供HPLC分析。
所有待测样品在28天时间点的纯度在表5中提供(注意：对于该研究的起始纯度值是99.3%)。结果提供作为pH、温度和浓度的函数的稳定性分布。
表5
AMG416溶液在28-天时间点的纯度
作为pH函数的AMG416降解的时间过程示于图3中。在10mg/mL(图3A)和2.5mg/mL(图3B)两种溶液中，在pH3观察到最少的降解。在两种溶液中，在pH6的降解进行最快，其纯度在29天点接近50%。HPLC分析显示，在pH2的主要的降解产物不同于在大于3的pH时观察到的降解产物。在较低的pH下，降解主要是通过脱酰胺作用，经水解进行，在较高的pH下，降解主要形成同型二聚体。
作为pH函数的在28天点的稳定性分布示于图4中。可再次发现，在这组实验的10mg/mL(图4A)和2.5mg/mL(图4B)二者中，最少降解的pH是大约3.0。此外，纯度的降低在所有的pH水平与温度有关，在2-8℃孵育的样品中观察到最少的降解，而在40℃孵育的样品中观察到最大的降解。
基于在28天的降解程度，降解程度的预测如上所述计算。对于10mg/mL溶液的预测在表6中提供和对于2.5mg/mL的预测在表7中提供。阴影值指示显示小于10%的降解的情形，其对液体制剂可能是优选的。对于所有的方案而言，其中在28天的样品显示比初始数据稍高的纯度的情形表示为0.0%。
这些外推法表明，对于在pH3的2.5或10mg/mL溶液，于室温下2年后的降解少于10%。一般来说，较高的温度数据预示在2年时的降解大于较低的温度数据。因此，对于10mg/mL研究(表6)，虽然pH3从所有的温度数据预测降解少于10%，但2-8℃数据预示比较高的温度更低的降解程度，并且事实上在2-8℃，pH4数据也支持少于10%的降解。类似地，在2.5mg/mL，当从2至8℃数据外推时，预测从2-4的pH范围于室温下经2年具有少于10%的降解。
表6
基于28天的降解程度，对AMG41610mg/mL溶液的稳定性预测
表7
基于28天的降解程度，对AMG4162.5mg/mL溶液的稳定性预测
表8以与上表4类似的方式介绍这些数据的温度加速作用。这再次表明温度升高趋向于提供比经基于简单应用的Arrhenius原理的外推法期望的更大加速的降解。
表8
作为pH函数的温度加速
在每个pH值，对于3个温度的每一个的降解数据与来自其它2个温度的数据比较，以计算所观察到的加速。预测的加速经如上所述的简单应用的Arrhenius原理进行。如下所述，HPLC分析显示，在少于约3的pH下的主要降解机制不同于大于约3的pH时观察到的降解机制。
实施例4
等张赋形剂对稳定性的影响
在这个研究中，测定各种药用赋形剂对AMG416在液体制剂中的稳定性的影响。以2x等张浓度制备10mg/mL的AMG416溶液和甘露醇、甘氨酸、精氨酸、NaCl和Na2SO4的储备液。AMG416溶液和5种赋形剂溶液和去离子水的pH独立地使用HCl/NaOH调节至pH3.5。将6种溶液的每一种的500μL等分试样加入到玻璃小瓶中并将500μL的AMG416溶液加入到相同的小瓶中并充分混合。这以3份重复进行，以提供18个样品小瓶，每个含有5mg/mLAMG416和等张浓度的赋形剂(或去离子水)。这用一组调节至pH4.5的溶液重复进行，提供另外的18个样品小瓶。孵育样品并在相关时间点取出用于HPLC分析。
在56-天时间点的稳定性数据示于表9中。稳定性行为的范围被观察为赋形剂的函数。在大多数试验条件下，NaCl制剂显示最少量的降解。对于在pH3.5和4.5的2-8℃数据是例外。对于其它赋形剂观察到更多的变异性，虽然精氨酸在40℃的样品和于室温下(约25℃)在pH4.5的样品中似乎是有害的，以及硫酸钠在室温和于40℃的pH4.5的样品中似乎是有害的。
表9
5mg/mLAMG416溶液在56天的降解程度(%)
表10外推数据至于室温下贮存2年，和发现如上讨论的类似的趋势，即较高的温度贮存一般预测比经简单应用的Arrhenius原理所期望的更快的降解。
表10
于室温贮存2年后，对5mg/mLAMG416溶液预测的降解程度(%)
数据显示，氯化钠可以是用于AMG416溶液制剂的合适的张力调节剂。
实施例5
不同缓冲剂的溶液稳定性
在这个研究中，评价AMG416的液体制剂在4种不同缓冲剂中经9天的稳定性。对于4种不同的呈钠盐形式的阴离子缓冲剂：乙酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐和琥珀酸盐，制备25mM浓度，pH4.5的缓冲盐水溶液。使AMG416HCl(粉末)溶于各种缓冲溶液中，以提供2.5mg/mL溶液并用HCl/NaOH将pH调节至4.5。溶液用pH4.5缓冲剂进一步稀释至1.0mg/mL和0.25mg/mL。将各个生成的溶液分开到两个玻璃HPLC小瓶中，一个于2-8℃贮存和一个于室温下(约25℃)贮存。HPLC分析于0、4和9天进行以测定功效和纯度。
在所有时间点的大多数样品中，AMG416的纯度是100%，例外的是对于9天的柠檬酸盐样品存在几个小峰，这可能是归因于基线的变化。在所有测试的缓冲剂中，AMG416在9天的研究期间显示出良好的稳定性。
实施例6
在pH2.25、2.5、3.0和3.5的缓冲溶液中的稳定性
在这个研究中，AMG416的液体制剂在低pH条件下的稳定性被研究。琥珀酸盐-缓冲盐水(10mM,pH3.5)通过将59mg琥珀酸溶于45ml实验室(lab)处理的(去离子)水中并按需要使用1NHCl和1NNaOH调节pH至3.5，和补足至50mL来制备。以相同的方式，制备10mM(pH3.5)乳酸钠(56mg/50mL)缓冲溶液。
使AMG416HCl(128mg粉末)溶于20mL琥珀酸盐缓冲液中以提供5mg/mLAMG416溶液，将该溶液分成相等的两份10mL部分。向一份加入NaCl(90mg)，而向另一份中加入甘露醇(500mg)。每份10mL部分被再次分成相等的两份5mL部分且pH用1NHCl和1NNaOH分别调节至2.25和3.5。以相同的方式，使用乳酸盐缓冲液制备4份5mL溶液。将(8份)得到的溶液各1.0mL加入到3个血清样品小瓶中。此外，剩余的pH2.25、含有NaCl的琥珀酸盐-缓冲的AMG416溶液被调节至pH2.5并将0.5mL等分试样加入到3个血清样品小瓶中，和剩余的pH3.5的含有NaCl的琥珀酸盐缓冲溶液被调节至pH3.0，并将0.5mL等分试样加入到3个血清样品小瓶中。见表11。
在每个时间点(0、2、8、12和24周)，所有30份样品从贮存中取出，平衡至室温(约25℃)，并用水将100μL等分试样稀释至0.5mg/mL，以供RP-HPLC分析。剩余的样品重新密封并返回到其各自的贮存条件。
表11
样品号的描述
用于研究的代表性HPLC数据显示于图5和6中。图5中显示的HPLC迹线是于40℃贮存67天的pH2.25的样品(5mg/mL，87.8%纯度)。图5B显示在杂质上观察的不同尺度。图6说明增加pH至3.5对于其它等价制剂(pH3.5,40℃,5mg/mL,67天,91.7%纯度)的影响。图6B显示观察杂质的不同尺度。在先前研究中，随着pH改变，在降解产物分布中观察到明显的差异。
作为时间的函数的AMG416纯度在表12中呈现(10mM缓冲剂浓度：L=乳酸盐；S=琥珀酸盐。张力调节剂：N=0.9%NaCl；M=5%甘露醇)。注意到在时间0，所用的批次含有3.4%二聚体。由于在样品制备中的错误，14天时间点的样品26被略去。
选择的数据趋势在图7-9中以图表形式表示。
表12
5mg/mL的AMG416溶液在缓冲溶液中67天的稳定性
图7提供在冷冻条件(2-8℃)下，AMG416(5mg/mL)在琥珀酸盐-缓冲盐水中作为pH的函数的溶液稳定性。图8提供于室温下贮存后，AMG416(5mg/mL)在琥珀酸盐-缓冲盐水中作为pH函数的溶液稳定性。图9提供于40℃贮存后，AMG416(5mg/mL)在琥珀酸盐-缓冲盐水中作为pH函数的溶液稳定性。
在最晚的时间点的降解产物分布在表13中呈现，和两个主要的降解产物(C-末端脱酰胺和同型二聚体形成)出现的时间过程示于表14和15中。图10和11呈现选择的制剂(可采用一组完整的pH条件的那些制剂，即含有NaCl和琥珀酸盐，但不含乳酸盐或甘露醇的那些制剂)降解为这些单独的产物(分别C-末端脱酰胺和同型二聚体形成)的作为pH函数的时间过程。
图10表明脱酰胺作用的明确的pH依赖性，经这种途径在pH2.25比在较高的pH有显著更大的降解，和在pH和脱酰胺的量之间的直接对应。相反，在图11中呈现的同型二聚体形成显示在pH和降解程度之间的相反关系。这些相反的趋势成为在图7-9中呈现的全部稳定性数据的基础，和AMG416溶液在这组实验中的最大稳定性在3.0±0.5的pH下观察到。
稳定性和赋形剂组成之间的相关性是不太清楚的。关于缓冲剂选择(琥珀酸盐对比乳酸盐)，检查在表12-14中的数据显示，关于在pH2.25或3.5的任何主要降解产物，对于任一缓冲剂没有明确的偏爱模式。由于同型二聚体峰的较大积分，所有含有琥珀酸盐缓冲剂的样品显示在时间0比相应的乳酸盐-缓冲的样品更低的纯度。为此的理由是不清楚的，但可表明母体和二聚体作为缓冲剂的函数的相对吸光度的变化。然而，如上所注明的，随后的孵育提供在任一缓冲剂的存在下基本相同的降解速率。关于张力调节剂(NaCl或甘露醇)的选择，氯化钠在pH2.25显示提高脱酰胺的速率(见表13，于25℃样品9-12且特别是于40℃样品17-20)。然而，NaCl显示在pH3.5抑制(与甘露醇比较)对同型二聚体的降解(表14，于25℃样品13-16且特别是于40℃样品21-24)。
表13
67天后AMG416(5mg/mL)溶液的降解产物分布
10mM缓冲剂浓度：L=乳酸盐；S=琥珀酸盐。张力调节剂：N=0.9%NaCl；M=5%甘露醇)。二聚体%值反映了在减去起始值后降解产物的增加。
表14
AMG416(5mg/mL)溶液在至多67天的时间点的脱酰胺作用
10mM缓冲剂浓度：L=乳酸盐；S=琥珀酸盐。张力调节剂：N=0.9%NaCl；M=5%甘露醇)。
AMG416溶液在这组实验中的最大稳定性在3.0±0.5的pH下观察到。在pH2.5和3.5的总降解速率是相似的，但降解产物分布不同。由于观察到较大量的脱酰胺，在pH2.25的稳定性是差的。虽然赋形剂的某些作用可在稳定性分布上观察到，但当在pH3.0下配制时，数据并不表明在研究的赋形剂系统中的整体偏好。
表15
在至多67天时间点，在5mg/mL溶液中AMG416降解为同型二聚体
(10mM缓冲剂浓度：L=乳酸盐；S=琥珀酸盐。张力调节剂：N=0.9%NaCl；M=5%甘露醇)。注意降解被表示为作为用于含有适当量的二聚体的实验的API的二聚体含量(不是总二聚体)的增加。
AMG416溶液在这组实验中的最大稳定性在3.0±0.5的pH下观察到。于pH2.5或3.5配制的溶液的分析显示不同降解分布，C-末端酰胺水解是在低pH下的最大的降解产物，而在较高的pH下，同型二聚体形成较多。预测在pH3.0的液体制剂在冷冻条件下经2年的总降解为2-4%。
实施例7
稳健性研究
在这个研究中，AMG416的液体制剂在各种制备和分析条件下的稳定性被研究。准备14个制剂试验组，各组具有pH(2.7、3.3或3.9)、肽浓度(4、5或6mg/mL)和盐浓度(0.7、0.85或1.0%)的不同组合。每个制剂的渗透压保持不变(琥珀酸盐10mM)。见表16。
表16
制剂试验组
将各个制剂试验组的样品(2.1mL)分配到3mL1B型玻璃小瓶(Schott,Germany)中并密封(橡皮塞)。将各组小瓶于4℃、25℃或40℃的温度下直立存放三个月。评价pH、渗透压、AMG416百分比和降解产物经3个月的变化。
通过拟合统计学模型估算经3个因素(pH、%肽和%NaCl)限定的时间-依赖性反应表面，所述统计学模型描述对于每个HPLC反应和在每个温度，对数据的这样的表面(JMP?统计发现软件，SAS)。采用MonteCarlo模拟以产生预测的HPLC反应在设定点(pH=3.3，肽=5%和NaCl=8.5%)作为围绕设定点的因素的随机变量和随机噪声的函数的分布。
注意到pH和渗透压随时间没有显著的变化。在4℃和25℃，在该研究的整个过程长度中，纯度保持92%或更大，脱酰胺为4%或更少和同型二聚体形成为4%或更少。在40℃，纯度、脱酰胺和同型二聚体形成在1个月开始见到。然而，脱酰胺和同型二聚体形成随着pH范围变窄至3.3左右而降低，表明pH对这些降解产物的形成具有显著的影响。
基于该数据，有可能提供在pH从2.8至3.8的范围内的纯度分布的预测。如在图12中所示，在每个温度下的纯度强烈地依赖于pH，且在测试的范围内较少地依赖于肽浓度和NaCl。在冷冻条件下，pH的作用在3.3以上的值时是不太显著，但在室温(约25℃)，较高的pH值下与更快速的降解有关。治疗应用的制剂可在冷冻条件下经历长期储存。此外，也应考虑到制剂可能在生产、包装、标签和临床应用期间暴露于较高的温度。因此，在这组实验中，已观察到在2.8-3.8(3.3±0.5)的测试范围内的pH值将适合于AMG416制剂。
实施例8
AMG416的液体制剂在pH范围内的长期稳定性
在这个研究中，浓度3.4mg/mL的AMG416液体制剂的长期稳定性在琥珀酸盐-缓冲盐水的pH范围内测定。将USP纯化水(1200mL)分配到玻璃烧杯中。加入琥珀酸钠(4.05g)和氯化钠(13.5g)并搅拌以溶解。如需要时用1NNaOH和/或1NHCl将pH调节至2.5。加入AMG416HCl(5.5g粉末重量)，搅拌以溶解，和用纯化水补足至1500mL以提供3.4mg/mL溶液(AMG416)。将该溶液分成3份并分别将每份的pH调节至2.5、3.0和3.5。各溶液分别通过0.22微米PVDF滤器过滤并分配2mL至5-cc小瓶中。在加塞、密封和标签后，将小瓶放置在5℃±3、25℃±2，和40℃±2的指定的稳定室中。依据计划收取样品并用去离子水稀释至1.0mg/mL供HPLC分析。在0、1、2、3、5、12和24个月时的纯度在表17中提供(注意：对该研究的起始纯度值为99.2%)。结果提供3.4mg/mLAMG416的液体制剂作为pH和温度的函数的长期稳定性分布。
表17
AMG416溶液在至多24个月的时间点的纯度
在每个pH水平下，AMG416液体制剂纯度的时间过程示于图13中。在所有的温度下，最大的纯度在pH3.5下观察到，而最多的降解在pH2.5下观察到。此外，在所有的温度下，在pH3.0和3.5的纯度显著大于在pH2.5的纯度。因此，例如，对于冷冻样品，在24个月的纯度对于在pH3.5和3.0的溶液分别为98.3和97.7，但对pH2.5的溶液仅为94.8。此外，发现纯度的降低在所有的pH水平均与温度有关，最少的降解在2-8℃孵育的样品中观察到，而最多的降解在40℃孵育的样品中观察到。在pH2.5观察到的主要的降解产物是脱酰胺产物，而在pH3.5观察到同型二聚体。
这些数据证实，所述制剂在冷冻条件下，能够在至少两年的保存期内维持AMG416的足够的稳定性。在所有情况下观察到的降解是线性的并支持基于从较早的实验外推数据的结论。从该数据，基于不同降解途径之间的平衡，最佳的pH介于3.0和3.5之间。
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