一种匙羹藤提取物的化妆品应用的制作方法

皮肤是一种特殊的人体器官。由于皮肤覆盖整个身体的表面，因此很薄且非常广阔，对成人来说，皮肤的总表面积约为1.60m²。因此皮肤的功能是在异物侵入身体时保护深层组织免受外界环境影响，包括免疫力，温度调节，体液损失等。最后，持续经受机械应力意味着需要与极大灵活性相关的强壮的和富有凝聚力的结构。由于皮肤持续承受环境攻击，因此通过促进皮肤组成细胞的新陈代谢来保持皮肤的更新和修复是十分重要的。

在对皮肤细胞的新陈代谢和能量过程调控的研究范围内，本申请披露了匙羹藤提取物对皮肤细胞的代谢的有益效果；更具体地说，本申请公开了匙羹藤提取物能促进线粒体和增加细胞的能量水平，从而使其可防止或对抗皮肤老化的症状，并还可防止其受到外部攻击所造成的损坏，如冷、风、紫外线辐射、辐射或暴露于毒素或污染物中。

所述研究进一步公开了匙羹藤提取物的效果，如下：

-培养的人角化细胞中的三磷酸腺苷(ATP)合成；

细胞能量基是从饮食中获得的基本分子获得(碳水化合物，蛋白质，脂肪)。在线粒体上所述基本分子化合物的氧化引起能量的释放，所述能量的形式为高能量化合物，三磷酸腺苷(ATP)。

当细胞需要能量时，ATP末端磷酸键水解生成二磷酸腺苷(ADP)释放能量。根据细胞的需求，ATP不断水解，然后再生。然而，随着年龄的增长和皮肤细胞遭受各种氧化应激，线粒体的完整性和功能性受损：ATP的新合成减少。

因此，确定能够提高细胞内ATP含量的试剂和通过刺激皮肤细胞促进ATP的新合成看来是十分重要的。

下述实施例部分的结果表明匙羹藤提取物引起ATP合成的显著增加。

-在培养的人角化细胞经受或不经受氧化应激时，呼吸链复合物IV，细胞色素C氧化酶的活性：

细胞色素C氧化酶在各种皮肤和头发的细胞类型中发现；已知细胞色素C氧化酶参与线粒体呼吸链或氧化还原链的能量代谢，其控制细胞的能量水平，代谢和体内平衡。所述细胞色素C氧化酶是由红光活化的光受体：当光子被氧化还原链吸收时，通过光敏细胞的电化学势的变化和由Ca²⁺和cAMP介导的细胞内信号的转导变化，光子传送能量到呼吸系统诱导在细胞内(DNA和RNA的合成，细胞增殖活性)和以ATP形式的能源生产过程中的一系列活动。

所述细胞色素C氧化酶能够错话光子转换成分子氧这种酶可促进电子传递给转化成水分子的分子氧而不形成对细胞有害的自由基中间体，根据如下简图：

通过细胞色素C氧化诱酶将氧气诱导生产ATP和水分子的反应简图

细胞色素C，底物之一，是呼吸链的必不可少的组分。细胞色素C在线粒体功能和细胞存活中起着重要的作用。细胞色素C的主要作用是确保借助于铁原子价态变化的电子传递。细胞色素C是可溶性的，因此将电子从复合体III传递到复合体IV(细胞色素氧化酶)。然后细胞色素氧化酶将作为细胞色素氧化酶底物的电子转移到氧气。

目前大量数据使人们可断言在老化组织的线粒体中，通过诱导脂质过氧化反应，自由基对膜流动性的降低和某些如细胞色素氧化酶的转运蛋白活性的降低负有主要的责任；因此，对于能够增加细胞色素C氧化酶活性的化合物的鉴定被证明是有用的。

已被证实匙羹藤提取物对人角化细胞的细胞色素C氧化酶活性具有促进作用；此外，匙羹藤提取物的效果已在先由过氧化氢(H2O2)处理的人角化细胞上试验，所述过氧化氢(H2O2)会引起细胞色素C氧化酶活性的显著降低；随后证实匙羹藤提取物显著恢复色素C氧化酶的活性。

总之，匙羹藤提取物对于培养的人角化细胞的新陈代谢和能量过程的调控具有显著效果。

-通过测定核糖-5-磷酸的培养的人成纤维细胞的戊糖途径：

本申请试验也证实，通过引起核糖-5-磷酸合成的显著增加，匙羹藤提取物对培养的人角化细胞和成纤维细胞的新陈代谢和能量过程的调控具有一定的效果。

与此同时，参与ATP生产的糖酵解，磷酸戊糖途径是一种生产NAPDH、电子供体和核糖-5-磷酸(DNA，RNA的合成)的代谢途径，所述电子供体尤其促进细胞呼吸(Krebs循环、呼吸链)。

因此，根据前述的性质，匙羹藤提取物似乎是一种增加皮肤细胞能量代谢的有用药剂。

匙羹藤是一种生长于印度和斯里兰卡的中部和南部热带森林的原生植物；匙羹藤通常用于各种治疗用途的药物制剂，尤其是用于治疗糖尿病。

广为人知的是可将匙羹藤提取物用于组合物中以应用于皮肤，特别是因为所述组合物的着色性或其对头发生长的抑制特性(WO 2005/067953)

但是，以本申请人的理解，迄今为止从未提出并证明具有上述性质的匙羹藤提取物可作为代谢途径的活化剂以给皮肤细胞提供能量。

本发明涉及一种匙羹藤提取物或一种包括所述匙羹藤提取物的化妆品组合物的化妆品应用，所述化妆品应用用于活化皮肤细胞的能量生产代谢途径；增加ATP的合成；促进色素C氧化酶的活性；诱导核糖-5-磷酸的合成；从而对皮肤调节代谢和能量过程进行调控。

优选的，匙羹藤提取物从植物的地上部分获得，更优选的，从叶子获得，并且可用本领域技术人员的公知的提取方法制备。

根据一具体的实施例中，所述提取物可利用下述处理从匙羹藤地上部分的碎片中提取：

-干燥后研磨；

-水醇相中的固/液萃取，例如在水和C1～C4(如乙醇)的混合物中；

-粗过滤

-活性炭脱色

-以1μm为截止阈值的板过滤

-浓缩。

为了使提取物易于应用，所述提取物可溶解于化妆品用基质中，如甘油。

由此获得一种清晰的琥珀色液体提取物。

优选的，匙羹藤提取物为水醇提取物和/或通过甘油稳定。

对于上述的化妆品应用，匙羹藤提取物制备成一种化妆品组合物，所述化妆品组合物包括0.01～10％干重的匙羹藤提取物，优选0.01～5％干重，所述干重百分比是基于所述组合物的总重量。

所述组合物可以任一剂型应用于化妆品和护肤品领域，所述剂型尤其可为任选的胶凝水溶液，任选的双相洗剂分散体，油包水型乳液(O/W)或相反的水包油型乳液(W/O)，或三重乳液(W/O/W或O/W/O)或离子和/或非离子型的囊泡分散体。所述组合物使用常规方法制备。

所述组合物基本上为流体，其具有如下外观：白色或有色的面霜，软膏，乳液，洗液，精华液，糊剂或泡沫。其可随意地以气雾剂的形式应用于皮肤。其也可以固体的形式呈现，尤其是棒状形式。其可用作护肤产品和/或化妆产品。

本发明所述组合物也可含有化妆品领域的常规佐剂，例如亲水性或亲脂性的胶凝剂、亲水性或亲脂性的助剂、防腐剂、抗氧化剂、溶剂、芳香剂、填充剂、过滤器、颜料，气味吸收剂和染料。上述不同佐剂的量为相关领域中的常用量，例如组合物的总重量的0.01～20％。所述佐剂，根据其性质，可被引入到油相、水相、脂囊泡和/或成纳米粒子。总之，上述比例的佐剂可被选择以不阻碍本发明所寻求的匙羹藤提取物的特性。

根据本发明所述组合物的预期用途，匙羹藤提取物可与其他抗老化剂关联，尤其是抗皱剂、去色素剂、紧肤剂、去污剂、紧致剂、抗自由基剂和/或免疫保护剂和/或促进细胞新陈代谢的制剂(尤其是蛋白质合成)和/或细胞增生。

本申请证实匙羹藤提取物和与本发明相同的化妆品组合物可用于活化皮肤细胞的代谢路径，尤其是供应细胞能量。所述皮肤细胞表示角化细胞，纤维母细胞和黑色素细胞，优选的，所述皮肤细胞由角化细胞和纤维母细胞组成。

因此，匙羹藤提取物的应用为一种用于调理皮肤细胞和/或促进皮肤细胞的新陈代谢的制剂；因此，本发明所述提取物和/或化妆品组合物可作为一种制剂用于调理皮肤细胞和/或促进皮肤细胞的新陈代谢。

本发明所述匙羹藤提取物和/或化妆品组合物还可用于使肌肤细胞达到最佳状态，确保体内平衡，更新和修复细胞。

同样地，优选的，本发明所述匙羹藤提取物和/或化妆品组合物用于皮肤的提神、调理、新生和排毒，尤其是紧张和疲劳的皮肤；增强皮肤肤色的光泽和/或外观；也可预防和/或修复面部的疲态，如昏暗和/或暗淡的肤色；还可保护皮肤细胞和皮肤免受侵袭性环境因素的影响，例如与气候相关的因素，如冷，风，或污染物。

本发明所述匙羹藤提取物和/或化妆品组合物也用于增强皮肤肤色的颜色和/或光泽，例如防止暗淡和/或无光泽的皮肤外观。

本发明所述匙羹藤提取物和/或化妆品组合物还可用于调理眼部周围，提神疲劳的眼睛，减少眼睛下面的眼袋和阴影，通常可恢复清爽和精力充沛的脸色。

本发明所述匙羹藤提取物和/或化妆品组合物可用于提神和抗疲劳治疗。

上述申请优选面部皮肤，即脸上、脖子、肩部和/或眼部周围，但也适用于但也适用于人体特定皮肤的美容治疗。

本发明也涉及一种美容治疗方法，用于活化皮肤细胞的代谢路径供应细胞能量；皮肤的提神，调理，新生或解毒；调理眼部周围，提神疲劳的眼睛，减少眼睛下面的眼袋和阴影，通常可恢复清爽和精力充沛的脸色；本发明包括匙羹藤提取物和包含所述匙羹藤提取物的化妆品组合物的皮肤应用。

皮肤上的应用可以剂型的形式实现。例如，本发明所述组合物可仅包括皮肤上的应用或伴随皮肤按摩的应用。

本发明优选足够量的组合物实现，以处理所需处理的的整个皮肤表面。例如，包括一个常规应用，如在皮肤上的乳膏，也包括充当治疗面膜的应用。

下文所述的实施例一方面涉及匙羹藤提取物的生物效应的评价，另一方面也涉及本发明所述组合为的生物效应的评价。

实施例参考以下附图，图1、图2A、图2B和图3的直方图。所述实验组包括未经处理的对照实验，经过处理的0.125％匙羹藤叶提取物，经过处理的0.25％匙羹藤叶提取物。

图1表示ATP含量的直方图；

图2A表示含有H₂O₂的细胞色素C氧化酶的活性的的直方图；

图2B表示不含H₂O₂的细胞色素C氧化酶的活性的直方图；

图3表示核糖-5-磷酸含量的直方图。

下述的一组实施例中，实验产品为通过上述水醇萃取方法获得并用甘油稳定的匙羹藤叶提取物(1.5％干重提取物在70％/30％甘油/水混合物中)

实施例1-所述提取物在培养的人角化细胞内的ATP合成中效果研究

原料和方法

实验组：

实验组1：未经处理的对照组

实验组2：在培养基中，匙羹藤提取物的浓度稀释至0.125％

实验组3：在培养基中，匙羹藤提取物的浓度稀释至0.25％

细胞培养

角化细胞的培养使用包皮环割手术收集的人体包皮皮肤，并补充胰岛素、上表皮生长因素和垂体制剂使其在KGM2培养基(角质细胞生长培养基，KGN2，培养基)中扩增。所述试验在第3代角质细胞上进行。细胞在多孔培养皿以1×10⁵细胞的比率接种。在37℃(5％CO₂)培育24小时后，在细胞的对数生长期采用0.125％和0.25％浓度的匙羹藤提取物处理。经过24小时的处理后，对细胞取样，并进行所述ATP的测定。

ATP测定：

ATP的测定使用PROMOKINE测定试剂盒(Promocell，法国)。使用分光光度计在570nm波长下进行比色测定。

结果

表I

所得结果证明0.125％和0.25％浓度的匙羹藤提取物引起ATP合成的显著增加，分别增加了19％和22％。

实施例2-所述提取物对细胞色素C氧化酶的活性的效果研究，所述细胞色素C氧化酶为呼吸链复合物IV，其位于经受氧化应激或不经受氧化应激的培养的人角质细胞上。

原料和方法

实验组：

实验组1：未经处理的对照组

实验组2：在培养基中，匙羹藤提取物的浓度稀释至0.125％

实验组3：在培养基中，匙羹藤提取物的浓度稀释至0.25％

实验组4：经过H₂O₂处理的对照组

实验组5：在培养基+H₂O₂中，匙羹藤提取物的浓度稀释至0.125％

实验组6：在培养基+H₂O₂中，匙羹藤提取物的浓度稀释至0.25％

细胞培养

角化细胞的培养使用包皮环割手术收集的人体包皮皮肤，并补充胰岛素、上表皮生长因素和垂体制剂使其在KGM2培养基(角质细胞生长培养基，KGN2，培养基)中扩增。所述试验在第3代角质细胞上进行。细胞在多孔培养皿以1×10⁶细胞的比率接种。在37℃(5％CO₂)培育24小时后，在细胞的对数生长期采用0.125％和0.25％浓度的匙羹藤提取物单独处理或在含有H₂O₂的情况下处理。

细胞色素C氧化酶的活性评价

经过24小时的处理后，对细胞取样，冲洗并悬浮于磷酸缓冲盐溶液中。细胞色素C氧化酶的活性评价使用分析试剂盒(细胞色素C氧化酶测定试剂盒-Sigma公司)。

结果

表II

所得结果显示，与未经处理对照组相比，0.125％和0.25％浓度的匙羹藤提取物促进了人角化细胞的细胞色素C氧化酶的活性，分别增加了17％和23％。

用过氧化氢(H₂O₂)单独处理的细胞引起细胞色素C氧化酶的活性的显著降低(-34％)。当存在H₂O₂时，0.125％和0.25％浓度的匙羹藤提取物促进了恢复了细胞色素C氧化酶的活性(+13％和+16％)

总之，匙羹藤提取物对培养的人角化细胞的新陈代谢和能量过程的调控具有显著效果。

实施例3-所述提取物对人角化细胞的戊糖路径的效果研究，通过测定核糖-5-磷酸。

原料和方法：

实验组：

实验组1：未经处理的对照组

实验组2：在培养基中，匙羹藤提取物的浓度稀释至0.125％

实验组3：在培养基中，匙羹藤提取物的浓度稀释至0.25％

细胞培养

角化细胞的培养使用包皮环割手术收集的人体包皮皮肤，并补充牛血清、左旋谷酰胺和抗生素使其在RPMI 1640培养基中扩增。所述试验在第3代角质细胞上进行。细胞在多孔培养皿以1×10⁵细胞的比率接种。在37℃(5％CO₂)培育24小时后，在细胞的对数生长期采用0.125％和0.25％浓度的匙羹藤提取物处理。

核糖-5-磷酸的测定

经过24小时的处理后，对细胞取样，并对细胞沉淀物在冰浴下超声处理30s，在压力11000g、温度10℃下离心5min。上层清液转移到干净试管中。通过在试样中加入含有3μmol/l IS，随后在-20℃存储至少30min来脱蛋白，终止残余的酶活性。随后加入15μl磷酸缓冲液(pH 11.5；1mol/l)中和溶液，试样在压力21000g、温度4℃下离心5min。上层清液转移到玻璃瓶中并在注射前于-20℃的温度下储存。制备一系列的标准溶液，包含核糖-5-磷酸的浓度分别为0.625、1.25、2.5、3.75和6.25μmol/l。所述标准溶液处理方法同上。核糖-5-磷酸的浓度通过LC-MS/MS测定。

结果

表III

所得结果证明0.125％和0.25％浓度的匙羹藤提取物引起了核糖-5-磷酸合成的显著增加，分别增加了26％和33％。

总之，匙羹藤提取物对培养的人角化细胞的新陈代谢和能量过程的调控具有显著效果。

实施例4-组分组成

精华液(％)

高分子胶(0.60)

纤维素羧甲醚(0.20)

戊二醇(2.00)

氨丁三醇(0.52)

甘油&水&聚乙二醇-8&辛乙二醇&聚丙烯酸钠(5.00)

水&甘油&甘油丙烯酸/丙烯酸&共聚物(10.00)

匙羹藤(3.00)

防腐剂(QS)

络合剂(QS)

芳香剂(QS)

去离子水(QSP 100)

保湿霜(％)

十六硬脂酸酯&十二醇硫酸钠&鲸蜡硬脂醇硫酸酯钠(1.70)

氢化聚异丁烯(7.00)

异壬酸异壬酯(5.00)

甘油硬脂酸酯(5.60)

C12-15烷基苯酸酯(3.50)

聚乙二醇-甲基葡萄糖&倍半硬脂酸酯(0.50)

甘油(3.00)

高分子胶(0.25)

二氧化硅(0.15)

云母(0.10)

滑石粉(0.50)

甘油&水&聚乙二醇-8&辛乙二醇&聚丙烯酸钠(5.00)

二甲基硅氧烷&聚二甲基硅氧(0.15)

维生素E(0.20)

匙羹藤(1.00)

防腐剂(QS)

络合剂(QS)

芳香剂(QS)

去离子水(QSP 100)

保湿凝胶(％)

木薯粉(1.00)

铵&丙烯酰二甲基牛磺酸/VP&共聚物(1.00)

乙二醇(5.00)

乙基己基甘油(0.20)

水&甘油&甘油丙烯酸/丙烯酸&共聚物(5.00)

辛酸/癸酸甘油三酯(1.50)

环甲硅油(5.00)

苯基三甲基聚硅氧烷(1.00)

环戊硅氧烷&聚乙二醇/聚丙二醇-18/18二甲基硅烷(1.00)

维生素E(0.20)

匙羹藤(1.00)

乙二氨四醋酸四钠(0.05)

防腐剂(QS)

芳香剂(QS)

去离子水(QSP 100)。