具有治疗糖尿病作用的西瓜藤提取物及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种具有治疗糖尿病作用的西瓜藤提取物，该提取物来自西瓜藤醇沉水提的乙酸乙酯部位。研究发现，该提取物具有良好的降血糖活性，可应用在临床治疗糖尿病中，包括Ⅰ型糖尿病和Ⅱ型糖尿病。本发明充分利用了农作物废弃物——西瓜藤的丰富资源，为今后深入研究开发其药用价值和临床意义提供了有力理论基础，以期为临床提供一种新的具有良好治疗糖尿病作用的现代中药制剂。
【专利说明】具有治疗糖尿病作用的西瓜藤提取物及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于中药提取物【技术领域】，尤其涉及一种具有治疗糖尿病作用的西瓜藤提取物及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002]据世界卫生组织调查，目前世界糖尿病患者人数高达约1.6亿，而我国就有糖尿病人约4000多万，约占全球糖尿病人数的1/4。每年死于糖尿病并发症的患者高达10万人，且逐年成上升趋势，糖尿病已成为当前威胁人类健康的一大杀手。因此，对糖尿病的治疗以及预防显得尤为重要。糖尿病属于内分泌疾病，分为I型和II两种。其病因复杂，目前发病和发病机制尚不完全清楚，也没有特殊治疗方法，不能根治。治疗方法一般有控制饮食和遵医嘱服用降糖药或者注射胰岛素，养成良好的饮食生活习惯，适当体力活动，适当限制饮食，使体重减至正常范围，不要暴食，避免各种诱发因素等。因此，越来越多的学者把目光投向中草药研究方面，以期发现一种新型治疗糖尿病的药物。
[0003]西瓜藤，为葫芦科植物西瓜(Citrullus Ianatus)的藤茎，其作为一种农作物废弃物，资源非常丰富，世界各地均有产出。目前已经证明西瓜具有清热利湿之功效，主治水泻，痢疾，烫伤，萎缩性鼻炎等症。国内学者对西瓜瓤、西瓜皮临床疗效方面也做了大量的报道，表明其具有杀菌抗炎作用，可治疗尿毒症、肾盂肾炎、小儿鹅口疮、慢性腹泻等病症。迄今为止，尚未见有关西瓜藤治疗糖尿病有效部位的组合物研究报道和专利。
【发明内容】
[0004]本发明要解决的技术问题是提供一种具有治疗糖尿病作用的西瓜藤提取物及其制备方法和应用，以充分利用农作物废弃物——西瓜藤的丰富资源，便于今后深入研究开发其药用价值和临床意义。
[0005]为解决上述技术问`题，本发明采用以下技术方案:
[0006]具有治疗糖尿病作用的西瓜藤提取物，该提取物来自西瓜藤醇沉水提的乙酸乙酯部位。
[0007]该提取物主要包括以下十种化合物:十五烧酸(pentadecanoic acid)、十五烧酸单甘油酯(monopentadecanoin)、十九烧酸-1-甘油酯(2，3-dihydroxypropylnonadecoate)、二十四烧酸-α -单甘油酯(lignoceric acid-2, 3-dihydroxy-propanenylester)、2_[2’_ 羟基(2’R, 13Z)十六酸胺]-3_ 羟基-(2S, 3R, 4Z)-十八碳稀-1-0- β -D-批喃葡萄糖昔(lancerebroside5)、2_羟基苯甲酸(salicylic acid)、对羟基苯甲酸(4-hydroxybenzoic acid)、对羟基苯酌.(hydroquinone)、玻拍酸(succinic acid)、香草酸(vanillic acid)。
[0008]上述具有治疗糖尿病作用的西瓜藤提取物的制备方法，包括以下步骤:取西瓜藤晒干粉碎，按重量体积比5:1用体积浓度80%的乙醇溶液超声2h，然后浸泡10d，过滤，合并滤液，减压浓缩，得墨绿色浸膏，冷冻干燥得绿色粉末；按重量体积比3:50将绿色粉末分散于去离子水中，静置过夜，离心分出不溶于水的绿色黏稠固体悬浮物和水溶液；取水溶液依次用3倍体积的石油醚、乙酸乙酯萃取样品，乙酸乙酯萃取液减压浓缩，回收溶剂，蒸干，得到乙酸乙酯部位。
[0009]上述具有治疗糖尿病作用的西瓜藤提取物在制备治疗糖尿病的药物方面的应用。
[0010]糖尿病包括I型糖尿病和II型糖尿病。
[0011]药物为胶囊、颗粒剂、片剂、溶液剂、丸剂或者注射剂。
[0012]胶囊为软胶囊，颗粒剂为干混悬剂，片剂为分散片、泡腾片、咀嚼片、口崩片，溶液剂为糖浆，丸剂为浓缩丸、滴丸、微丸。
[0013]上述具有治疗糖尿病作用的西瓜藤提取物在制备辅助治疗糖尿病的保健食品方面的应用。
[0014]糖尿病包括I型糖尿病和II型糖尿病。
[0015]发明人将农作物废弃物西瓜藤中进行醇沉水提，再依次由石油醚和乙酸乙酯萃取获得乙酸乙酯部位的提取物。研究发现，该提取物具有良好的降血糖活性，可应用在临床治疗糖尿病中，包括I型糖尿病和II型糖尿病。发明人利用各种柱色谱等分离技术及重结晶等纯化手段对该提取物的化学成分进行分离，从中得到10个化合物，并综合利用现代波谱技术(11?，^，1^，10、20-匪10对 分离所得化合物的化学结构进行鉴定，首次获得西瓜藤醇沉水提的乙酸乙酯部位提取物的主要化学组成的信息。本发明充分利用了农作物废弃物一西瓜藤的丰富资源，为今后深入研究开发其药用价值和临床意义提供了有力理论基础，以期为临床提供一种新的具有良好治疗糖尿病作用的现代中药制剂。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1是西瓜藤提取物的制备工艺流程图。
[0017]图2是西瓜藤乙酸乙酯部位的化合物分离工艺流程图。
[0018]图3是对糖尿病小鼠胰腺病理形态学的影响(DBAX400)。
[0019]图4是各组动物肾脏病变情况(HE X 400)。
【具体实施方式】
[0020]一、西瓜藤提取物的制备
[0021]如图1所示，取晒干粉碎的西瓜藤10kg，按重量体积比5:1用体积浓度80%的乙醇溶液超声2h，然后浸泡10d，过滤，合并滤液，减压浓缩，得墨绿色浸膏，冷冻干燥得300g绿色粉末；按重量体积比3:50将绿色粉末分散于5000mL去离子水中，静置过夜，离心(3000rpm.min—1)分出不溶于水的绿色黏稠固体悬浮物和水溶液；取水溶液依次用3倍体积的石油醚萃、乙酸乙酯、正丁醇萃取样品，萃取液分别减压浓缩，回收溶剂，蒸干，得到石油醚部位(30g)、乙酸乙酯部位(33g)、正丁醇部位(100g)。
[0022]二、西瓜藤乙酸乙酯部位的化合物分离
[0023]如图2所示，取乙酸乙酯部分通过MCI，除去色素得到样品10g，剩下23g经硅胶(100-200 目)345g 柱层析，用氯仿-甲醇(98: 5-0: 100) (98: 5，19:1, 16: 5,3:1,2: 1,1: 1,2: 3,1: 3，甲醇)为梯度洗脱溶剂系统洗脱。氯仿-甲醇(98: 5)洗脱部分，浓缩蒸干得样品3g，反复硅胶洗脱，氯仿重结晶，得化合物1(0.04g)和化合物2(0.5g)；氯仿-甲醇(19: I)洗脱部分，浓缩回流蒸干得样品4g，经硅胶(200-300)目100g，取第29-40份，浓缩蒸干得1.5g，经洗脱剂(氯仿-甲醇(I: I))溶解过凝胶，得流份，第5~10份，氯仿重结晶，得到化合物3 (0.3g),第23-34份，氯仿重结晶，得化合物4 (0.08g),再取硅胶洗脱部位的第45-67份，经洗脱剂(氯仿-甲醇(I: I))溶解过凝胶，得流份，取第20-50份，氯仿重结晶，得化合物5 (Ig);氯仿-甲醇(16:5)洗脱部位，浓缩蒸干得样品
2.5g，经硅胶(200-300)目30g，取流分第18-25份，浓缩蒸干，经凝胶，取流份30-45，甲醇重结晶，得化合物6 (0.06g);氯仿-甲醇(3: I)洗脱部位，浓缩蒸干得样品4g，经洗脱剂(氯仿-甲醇(1:1))溶解过凝胶，取流份15-25和40-50，分别浓缩蒸干得Ig和1.5g，流分15-25经洗脱剂(氯仿-甲醇(I: I))溶解，过凝胶，取流分31-43，甲醇重结晶得化合物7 (0.05g);流分40-50经洗脱剂甲醇溶解，再过凝胶，得流分28-40，甲醇重结晶得化合物8(0.4g);氯仿-甲醇(2: 3)洗脱部分，浓缩蒸干得样品得4g，洗脱液甲醇溶解，经ODS柱洗脱，取流分37-57，浓缩蒸干得2.5g，洗脱液甲醇溶解，经凝胶柱洗脱，取流分26-46，甲醇从结晶得化合物9 (0.2g);取流分50-78，再经凝胶柱洗脱，甲醇重结晶得化合物10 (0.09g)。
[0024]利用现代波谱技术(IR，UV, MS, 1D.2D-NMR)对分离所得化合物的化学结构进行鉴定，证实西瓜藤乙酸乙酯部位的十种化合物分别为:十五烷酸(化合物I)、十五烷酸单甘油酯(化合物2)、十九烷酸-1-甘油酯(化合物3)、二十四烷酸-α -单甘油酯(化合物4)、2_[2’ -羟基(2’ R, 13Ζ)十六酸胺]-3_羟基-(2S, 3R, 4Ζ)-十八碳烯-1_0_β -D-吡喃葡萄糖苷(化合物5)、2_羟基苯甲酸(化合物6)、对羟基苯甲酸(化合物7)、对羟基苯酹(化合物8)、琥珀酸(化合物9)、香草酸(化合物10)。
[0025]三、药效学实验
[0026]实验一:西瓜藤不同提取物对四氧嘧啶致糖尿病小鼠的降血糖作用
[0027]I材料与仪器
[0028]1.1 动物
[0029]清洁级健康昆明种小鼠，雌雄各半，体重18~22g，购自广西医科大学实验动物中心，许可证号:SCXK桂2009-0058。动物分笼饲养，每笼10只，高脂饲料喂养，自由饮水，动物饲养环境温度为23~26°C。
[0030]1.2药品与试剂
[0031]西瓜藤采自广西崇左，并经广西药用植物园马小军教授鉴定为葫芦科(Cucurbitaceae)植物西瓜(Citrullus Lanatus)的藤莖。
[0032]西瓜藤不同溶剂提取物自制；格列苯脲片(广州市医药有限公司，批号:120902)；四氧嘧啶(ALX)(sigma公司产品，批号:122K2514)，临用前用生理盐水配置；水合氯醛(上海白鹤化工厂，批号:20110216) ;TG测试盒、TC测试盒:温州津玛生物科技有限公司；考马斯亮兰试剂盒、NO及iNOS试剂盒:南京建成生物工程研究所提供。
[0033]柠檬酸缓冲液的配制:将柠檬酸(FW:210.14)2.1g加入双蒸水IOOmL中配成A液。将柠檬酸钠(FW:294.10) 2.94g加入双蒸水IOOmL中配成B液。用时将A、B液按一定比例混合(1:1.32)，PH计测定ph值，调节ph=4.2，即是所需配置的柠檬酸缓冲液。
[0034]1.3 仪器
[0035]Dounce组织匀衆器(美国Wheaton公司);AE1001/10000电子分析天平(日本岛津公司);Agilent8453紫外-可见分光光度计(安捷伦公司);台式低温高速离心机(美国贝克曼库尔特公司)；Bio-tek ELX800型酶标仪(美国宝特公司);血糖测定仪(德国罗氏公司)。
[0036]2实验方法
[0037]2.1待试样品的制备
[0038]西瓜藤采自广西崇左，并经广西药用植物园马小军教授鉴定为葫芦科(Cucurbitaceae)植物西瓜(Citrullus Lanatus)的藤莖。
[0039]取晒干粉碎的西瓜藤5kg，分别用10倍、8倍量水煮沸提取2h、1.5h，合并提取液，浓缩干燥，即得水提取浸膏(1.2kg)(每克浸膏相当于4.2g生药)。
[0040]参照一、西瓜藤提取物的制备获得石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位用于下述实验。
[0041]2.2实验模型的建立
[0042]取体质量22~24g昆明种小鼠一批，雌雄各半，分笼饲养。禁食不禁水12h后，称重，编号。适应性饲养Iw后，空腹16h，腹腔内注射200mg/kg四氧嘧啶溶液(ALX)柠檬酸缓冲液(间隔48h，分两次完成)。5d后，取尾部全血，用血糖测定仪(德国罗氏)测定空腹血糖浓度。空腹血糖浓度大于llmmoL/L小鼠被认为造模成功，入选下一步实验。正常小鼠10只和糖尿病小鼠100只，分为11组，每组10只，连续灌胃15d。具体分组和灌胃剂量如下:第一组空白组(生理盐水);第二组为糖尿病模型组(生理盐水);第三组为阳性药物组(格列苯脲0.015g/kg);第四-五组为乙酸乙酯提取物高、低剂量组(20g/kg，10g/kg);第六-七组为石油醚提取物高、低剂量组(20g/kg，10g/kg);第八-九组为正丁醇提取物高、低剂量组(20g/kg, 10g/kg);第十^一组为水提取物高、低剂量组(20g/kg, 10g/kg)，灌胃体积均为 2.0mL/kgo
[0043]2.2样品的采集及测定
[0044]分别于给药前、给药后、给药第7d，15d于尾静脉取血用血糖仪测小鼠的血糖值。小鼠体质量分别于造模前、造模后，给药7d，15d各测定一次。末次给药后小鼠禁食12h，尾静脉取微血测定血糖值，作为Oh的血糖值，灌胃给以葡萄糖每千克体质量为2.0g，测定给葡萄糖0.5，l，2h后的血糖值，观察各组小鼠给葡萄糖后的血糖变化，比较各组之间是否存在差异，并用梯形面积法计算糖耐量曲线下面积(AUC)。
[0045]血糖指标检测结束后摘除眼球取血,3000rpm.mirT1，15min离心分离血清。用化学比色法测定小鼠血清TG、TC、NO和iNOS含量；用放免法测血清胰岛素。迅速摘取肝脏，制成10%匀浆测定其NO和iNOS水平。取出胰腺组织，在解剖镜下解剖胰腺组织，用福尔马林溶液固定，常规石蜡包埋，制成4 μ m石蜡切片，染色，按S-P试剂盒说明进行操作，DBA染色，苏木素复染，脱水，透明，封片，显微镜观察。
[0046]2.3统计分析
[0047]实验结果均以(~ 土s)表示，应用SPSS13.0软件包处理数据，组间显著性检验用
t检验及相关分析。
[0048]3 结果
[0049]3.1对糖尿病小鼠体质量的影响
[0050]造模成功后，各组小鼠的体质量显著下降，与空白组相比有显著性的差异(P〈0.05)。给药7d后，各组小鼠体质量变化不明显。给药15d后，乙酸乙酯高剂量组、石油醚高剂量组小鼠体质量均明显增加(p〈0.05)，结果见表1。
[0051]表1西瓜藤不同提取物对糖尿病小鼠体质量的影响
【权利要求】
1.一种具有治疗糖尿病作用的西瓜藤提取物，其特征在于该提取物来自西瓜藤醇沉水提的乙酸乙酯部位。
2.根据权利要求1所述的具有治疗糖尿病作用的西瓜藤提取物，其特征在于该提取物主要包括以下十种化合物:十五烷酸、十五烷酸单甘油酯、十九烷酸-1-甘油酯、二十四烷酸-α-单甘油酯、2-[2’ -羟基(2’ R，13Z)十六酰胺]-3-羟基-(2S，3R，4Z)-十八碳烯-l-0-β -D-吡喃葡萄糖苷、2-羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸、对羟基苯酚、琥珀酸、香草酸。
3.权利要求1所述具有治疗糖尿病作用的西瓜藤提取物的制备方法，其特征在于包括以下步骤:取西瓜藤晒干粉碎，按重量体积比5:1用体积浓度80%的乙醇溶液超声2h，然后浸泡10d，过滤，合并滤液，减压浓缩，得墨绿色浸膏，冷冻干燥得绿色粉末；按重量体积比3:50将绿色粉末分散于去离子水中，静置过夜，离心分出不溶于水的绿色黏稠固体悬浮物和水溶液；取水溶液依次用3倍体积的石油醚、乙酸乙酯萃取样品，乙酸乙酯萃取液减压浓缩，回收溶剂，蒸干，得到乙酸乙酯部位。
4.权利要求1所述具有治疗糖尿病作用的西瓜藤提取物在制备治疗糖尿病的药物方面的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于:所述糖尿病包括I型糖尿病和II型糖尿病。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于:所述药物为胶囊、颗粒剂、片剂、溶液剂、丸剂或者注射剂。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于:所述胶囊为软胶囊，所述颗粒剂为干混悬剂，所述片剂为分散片、泡腾片、咀嚼片、口崩片，所述溶液剂为糖浆，所述丸剂为浓缩丸、滴丸、微丸。
8.权利要求1所述具有治`疗糖尿病作用的西瓜藤提取物在制备辅助治疗糖尿病的保健食品方面的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于:所述糖尿病包括I型糖尿病和II型糖尿病。
【文档编号】A23L1/29GK103550280SQ201310546205
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年11月6日 优先权日:2013年11月6日
【发明者】邓家刚, 王硕, 龚小妹, 周小雷, 周丹丹, 戴航 申请人:广西中医药大学, 广西壮族自治区药用植物园