一种获得高纯高效的藻毒素降解酶的生物合成方法
【专利摘要】本发明公开了一种获得高纯高效的藻毒素降解酶（MlrA）的生物合成方法，属于生物技术应用或环境保护领域。本发明方法包括如下步骤：将如SEQIDNO.1所示的序列构建到pMAL-C2X上得到pMAL-MlrA；将pMAL-MlrA转化到大肠杆菌TB1中得到MlrA的表达菌；将MlrA的表达菌用IPTG诱导表达，收集诱导表达后的菌体，破碎后利用麦芽糖结合蛋白（MBP）标签纯化得到高纯高效的藻毒素降解酶。本发明通过优化表达载体和表达条件，获得的MBP-MlrA纯度达到90%以上，切除MBP标签后的MlrA纯度可以达到98%以上；通过本发明得到的藻毒素降解酶降解范围广，降解效率高。
【专利说明】一种获得高纯高效的藻毒素降解酶的生物合成方法
[0001]
【技术领域】 [0002]本发明涉及生物技术应用或环境保护领域，具体涉及一种获得高纯高效的藻毒素降解酶的生物合成方法。
【背景技术】
[0003]藻毒素(Microcystins，MCs)是蓝藻在生长过程中以及死亡后释放出来的危害严重的一类毒素(Duy T.N.et al.Toxicology and risk assessment of freshwater eyanobacteria (blue-green algae) toxic in water.Rev.Environ.Con tarn.Toxicaol.2000, 163，113-186)，其结构图如图1所示。MCs是一个环状七肽化合物，将整个环状多肽分为7部分:1，D丙氨酸；2，Rl ;3，D-β -甲基异天冬氨酸；4，R2 ;5，Adda ;6，D异谷氨酸；7，N-甲基脱氢丙氨酸。目前已有67种藻毒素被发现，这种不同大都是环状结构中的2、3、4和7位的氨基酸残基不同所造成的。最常见的有MC-LR和MC-RR两种，其中MC-LR的环状结构中2和4位的氨基酸残基分别为赖氨酸残基(L)和精氨酸残基(R)，MC-RR的环状结构中2和4位的氨基酸残基都为精氨酸残基(R)。MCs污染会导致水体动物的死亡，饮用被藻毒素污染的水可诱发人、畜、禽等肝损伤、导致肝癌等。
[0004]近年来，由于各地水体富营养化程度的提高，蓝藻水华现象频繁爆发，这些生长或死亡的蓝藻会释放出大量的藻毒素，对人类和环境造成的危害日益严重。MCs的去毒或解毒显得尤为迫切。同时由于人们生活水平的提高，对水体治理的安全性、有效性提出了更高的要求。
[0005]通过去除或降解藻毒素达到解毒目的的方法目前主要有:(I)物理化学降解法:通过凝固、活性炭吸收、膜处理技术或者UV/H202 ClO2降解藻毒素。凝固、活性炭吸收、膜处理技术虽然能部分降低藻毒素在水中的含量，但只能将藻毒素转移到其他的地方并不能有效的将藻毒素降解掉，且耗时耗材料。氧化降解藻毒素的方法虽然降解效率较高，价格便宜，但因为氧化剂的杀生能力强，专一性差，且容易与有机污染物反应产生有害身体健康的物质。(2)细菌降解法:该法利用细沙过滤和含有具有选择性的生物降解菌的生物膜来处理水样，该法经济，但操作繁琐，需要经常更换生物膜，且生物降解菌自身代谢需要消耗养分，容易影响生态系统的稳定性，并可能产生未知次生代谢有毒物质，造成二次污染。(3)生物酶降解法:生物降解酶可以降解藻毒素，使其转变为低毒、无毒的小分子物质，具有专一性、高效性且不会产生有毒物质等特点从而备受关注。
[0006]生物酶降解藻毒素无疑是目前有效、安全解除藻毒素对水体的污染问题的最优方法之一。1996年Bourne D.G.等报道:通过sp.对MC-LR的降解产物分析，推测降解MC-LR至少有四个酶(MlrA，MlrB, MlrC, MlrD)其中三个水解酶(MlrA，MlrB, MlrC)和一个假定的低聚肽传输因子(MlrD)，并推测出一种可能MC-LR降解途径.第一个酶MlrA是一个非常重要的酶，将环状藻毒素降解为线状藻毒素，使得藻毒素毒性降低了近 160 倍(Bourne D.G., et al.Enzymatic pathway for the bacterialdegradation of the cyanobacterial cyclic peptide toxin microcystin LR.App1.Environ.Microbiol.1996，62，4086-4094.)。2001 年 Bourne D.G.等克隆了这四个基因，并对这四个基因进行了序列测定及表征。2012年Hai Yan等}~k Sphingopyxis sp.中克隆了基因USTB-05-A，并将该基因USTB-05-A转入PGEX4T-1为载体在BL21 (DE3)进行表达，USTB-05-A 基因与已经报道的sp.ACM-3962 中的 MlrA (GeneBank N0.AF411068)核酸相似性为 92.5% (Yan H., et al, Characterization of the first stepinvolved in enzymatic pathway for microcystin-RR biodegraded by Sphingopyxissp.USTB-05.Chemosphere.2012, 87，12-18)。但是目前这些实验是在混合酶液的条件下进行的，没有得到纯酶，酶的表达量和表达活性都不高，影响了藻毒素降解酶的进一步应用。
[0007]因此如何获得高纯高效的藻毒素降解酶，是我们应用生物酶有效、安全解除藻毒素对水体污染的一个重要前提和首要问题。
【发明内容】
[0008]本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种获得高纯高效的藻毒素降解酶(MlrA)的生物合成方法。
[0009]本发明的目的通过下述技术方案实现:
一种获得高纯高效的藻毒素降解酶(MlrA)的生物合成方法，包括如下步骤:
Cl)将如SEQ ID N0.1所示的MlrA序列构建到原核表达载体pMAL_C2X上得到表达MlrA 的载体 pMAL-MlrA。
[0010](2)将PMAL-MlrA转化到大肠杆菌TBl中得到MlrA的表达菌。
[0011](3)将MlrA的表达菌用IPTG诱导表达，收集诱导表达后的菌体，破碎后利用PMAL-C2X上的融合蛋白表达标签(麦芽糖结合蛋白MBP，相对分子量42500)纯化得到高纯高效的藻毒素降解酶。
[0012]步骤(1)中所述的载体pMAL-MlrA优选通过如下步骤的方法的制备:将如SEQ IDN0.1所示的MlrA通过合成载入克隆载体pUC19中，获得pUC19_MlrA ；以pUC19_MlrA为模板，用MlrA上游引物和下游引物扩增MlrA ;通过上下游引物上的酶切位点BamH I和HindIII将MlrA构建到pMAL-C2X载体上，得到表达MlrA的载体pMAL-MlrA ；
其中，MlrA 上游引物为 5’ -GCGGATCCATGCGGGAGTTTGTCAAACAG-3’，MlrA 下游引物为 5’-CGCAAGCTTTCACGCGTTCGCGCCGGACTT-3，。
[0013]步骤(3)中所述的诱导条件优选为:诱导前菌液0D600为1.0, IPTG浓度为0.5mM,诱导表达温度为22°C，诱导时间为8小时。
[0014]步骤(3)中所述的纯化的方法优选包括如下步骤:用二次蒸馏水、0.5M的NaOH溶液、柱平衡缓冲液洗涤MBP柱，平衡纯化柱(MBP柱的再生)；将收集的诱导表达后的菌体用柱平衡缓冲液重悬，超声破碎，离心取上清，与平衡后的MBP树脂结合；将结合的混合液倒入到空柱中，先用柱平衡缓冲液冲洗使杂蛋白从树脂上脱落下来，再用洗脱缓冲液洗脱收集目的蛋白得到纯化的藻毒素降解酶MlrA ;其中，柱平衡缓冲液组分为:36mM KH2PO4,18mMK2HPO4, 200mM KCl ;洗脱缓冲液组分为:0.36g麦芽糖，柱平衡缓冲液100mL。[0015]与现有技术相比，本发明具有以下优点和效果:通过优化表达载体和表达条件，获得的藻毒素降解酶MBP-MlrA纯度达到90%以上，切除MBP标签后的藻毒素降解酶MlrA纯度可以达到98%以上，且已验证该酶可以同时降解最常见的两种藻毒素MC-LR和MC-RR，降解效率分别是41.2Pg/min/mg.pr和47.3Pg/min/mg.pr。而目前文献报道的MlrA大多为粗提液，仅降解MC-RR或者MC-LR，最新报道的USTB-05-A基因表达的蛋白降解MC-RR效率也仅为 7.6Kg/min/mg.pr (Yan H.et al., 2012)。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1是藻毒素结构图；MCs是一个环状七肽化合物，将整个环状多肽分为7部分:1，D丙氨酸；2，Rl ;3，D- β -甲基异天冬氨酸；4，R2 ;5，Adda ;6，D异谷氨酸；7，N-甲基脱氢丙氨酸；MC-LR中Rl，R2分别是亮氨酸(Leu)和精氨酸(Arg) ；MC-RR中Rl，R2都是精氨酸(Arg) ；MC-YR中Rl，R2分别是酪氨酸(Tyr)和精氨酸(Arg)。
[0017]图2是PCR筛选阳性单克隆琼脂糖凝胶电泳图；M:DL2000,1~4:阳性单克隆。
[0018]图3是诱导前不同菌液浓度条件的SDS-PAGE图；M为Marker，I和2分别是0D600达到0.6的未诱导和诱导，3和4分别是0D600达到1.0的未诱导和诱导，5和6分别是0D600达到1.4的未诱导和诱导，该实验中诱导剂IPTG浓度为0.5mM，诱导表达温度为22°C，诱导时间为8小时。
[0019]图4是不同诱导剂IPTG浓度条件的SDS-PAGE图；M =Marker, 1:未诱导，2~6:诱导剂IPTG浓度分别是0.05mM、0.5mM、l.0mM、5mM、10mM ;该实验中诱导前菌液浓度0D600 =1.0，诱导表达温度为22°C，诱导时间为8小时。
[0020]图5是不同诱导温度条件的SDS-PAGE图；M为Marker，I和2分别为16°C下诱导表达的沉淀和上清，3和4分别为`22°C下诱导表达的沉淀和上清，5和6分别是37°C下诱导表达的沉淀和上清；该实验中诱导前菌液浓度0D600 = 1.0，诱导剂IPTG浓度为0.5mM，诱导时间为8小时。
[0021]图6是诱导前菌液浓度0D600 = 1.0在0.5禮IPTG及22°C下诱导下不同诱导时间条件的SDS-PAGE图；M为Marker，I~4诱导时间分别是0h、4h、6h、8h。
[0022]图7是优化条件下表达并纯化藻毒素降解酶MlrA的SDS-PAGE图；M，Marker ;1，未诱导菌液；2，诱导菌液；3，破碎细胞后离心得到的沉淀；4，破碎细胞后离心得到的上清；5，流穿液(蛋白混合液经过结合柱没有结合部分);6，洗脱杂蛋白；7，纯化后的MBP-MlrA ;8，切除标签BMP后的MlrA。
[0023]图8是MC-RR标准曲线图。
[0024]图9是MC-LR标准曲线图。
[0025]图10是藻毒素降解酶降解MC-RR 30分钟的活性HPLC检测结果图。
[0026]图11是藻毒素降解酶降解MC-LR 30分钟的活性HPLC检测结果图。
[0027]图12是质谱分析MC-LR、MC-RR及藻毒素降解酶降解MC-LR、MC-RR的产物的结果图；A:MC-RR, MW (分子量)=1037.7 ；B:藻毒素降解酶降解MC-RR的产物，MW=1055.9 ；C:MC-LR, MW=994.6 ；D:藻毒素降解酶降解MC-LR的产物，MW=1013.6。
[0028]图13是质谱推测MlrA降解MC-LR和MC-RR的机理图；A =MC-LR的降解机理，B:MC-RR的降解机理。【具体实施方式】
[0029]以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0030]实施例1藻毒素降解酶表达载体pMAL-C2X_MlrA的构建
将MlrA (核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示)通过合成载入克隆载体pUC19中，获得pUC19-MlrA。
[0031](I)质粒的提取
取2个装有20mL LB (胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L、氨苄青霉素30mg/L)培养基的锥形瓶，将含有pUC19-MlrA、pMAL-C2X质粒的单菌落分别加入培养基中，在37°C、220rpm下过夜培养，按照SDS裂解法提取质粒。质粒提取完成后将其做好标记放入4°C冰箱等待下一步使用。
[0032](2) PCR 扩增 MlrA、MlrA 和 pMAL_C2X 的双酶切
PCR 扩增反应体系:质粒(pUC19-MlrA)l μ UlOXbuffer 5μ L.dNTPs 4yL、MlrA 上游引物I μ L、MlrA下游引物lyL、TaqDNA聚合酶I μ L、加ddH20至50yL。MlrA上游引物:5’ -GCGGATCCATGCGGGAGTTTGTCAAACAG-3’, MlrA 下游引物:5’ -CGCAAGCTTTCACGCGTTCGCGCCGGACTT-3’，下划线序列为 BamH I 和 Hind III酶切位点。
[0033]PCR 扩增条件:94°C预变性 5min ;94°C lmin,56°C lmin,72°C lmin，30 个循环；最后延伸72°C 5min。
[0034]将PCR产物MlrA通过琼脂糖凝胶电泳检测正确后，进行胶回收并用BamH I和Hind III进行双酶切。PMAL-C2X载体(该载体的融合蛋白表达标签为麦芽糖结合蛋白MBP，相对分子量42500)也用BamH I和H`ind III进行双酶切。酶切产物进行胶回收用于连接。
[0035](3)连接及转化
在EP管中分别加入酶切后的载体pMAL-C2X 2 μ L、10X T4 DNA连接酶缓冲液I μ L、T4DNA连接酶I μ L、H2O 5 μ L、酶切后的目的基因MlrA I μ L混匀，载体和目的基因的量可变化，将EP管放入16°C的恒温水浴箱中，水浴16h。这一步可将载体与目的基因连在一起。
[0036]将制得的感受态DH5 α从冰箱中拿出放于冰上冻融，加入10 μ L连接产物，将EP管重置于冰中30min，然后放入到42°C的水浴中，放置90s，再放入冰中，静置5min。每管加入600 μ L LB培养基，在摇床中37°C、180rpm培养60~90min ;然后4000rpm离心，取600 μ L上清，将沉淀轻轻混匀，涂在含氨苄青霉素30mg/L的LB平板上，在37 °C恒温箱中培养13~16h。
[0037](4)单克隆检测
将上步平板上长出的单菌落，活化于含氨苄青霉素30mg/L20mL LB培养基的烧瓶中37°C、220rpm培养16h。取菌液3 μ L进行PCR验证(图2)，分别取质粒(pUC19_MlrA) 3 μ L和水3 μ L进行PCR做阳性和阴性对照，将PCR产物用琼脂糖凝胶电泳检测，若菌液扩增出的条带与质粒pUC19-MlrA扩增出的条带分子量相同,则初步证明连接成功。
[0038]将正确条带所对应的菌液重新活化，保菌送去测序，测序序列结果显示载入的MlrA片段长度为1008bp，在NCBI中通过BLAST进行比对，比对一致表明载体pMAL-C2X-MlrA 构建成功。[0039]实施例2藻毒素降解酶的表达纯化 (I)诱导条件的优化
对诱导前菌液浓度、诱导剂IPTG浓度、诱导表达温度、诱导时间进行了优化提取大肠杆菌DH5 α中的PMAL-C2X-MlrA质粒，将提取的质粒转入TBl感受态中。将含有目的基因的表达菌活化于含氨苄青霉素30mg/L的20mL LB培养基的烧瓶中37°C、220rpm培养16h，取活化后的菌液按2.5%的接种量接种于500mL LB培养基中，选择不同的诱导条件进行诱导表达。诱导表达后收集菌体，通过SDS-PAGE检测目的蛋白表达情况，以确定最优的诱导条件。结果如图3~6所示，最后确定最优的诱导条件为:诱导前菌液0D600为
1.0，诱导剂IPTG浓度为0.5mM，诱导表达温度为22°C，诱导时间为8小时。
[0040](2)诱导菌株的准备
将含有目的基因的表达菌活化于含氨苄青霉素30mg/L的20mL LB培养基的烧瓶中37°C、220rpm培养16h，取活化后的菌液按2.5%的接种量接种于500mL LB培养基中，培养到0D600 1.0的时候，加入IPTG至终浓度0.5mM，22°C、220rpm诱导8小时，用高速冷冻离心机(J-26XP, Beckman) 12000rpm、4°C离心收集诱导后的菌。
[0041](3) MBP柱的再生
首先用二次蒸馏水洗5个柱体积，后用0.5M的NaOH溶液洗涤3个柱体积，注满NaOH浸泡30min，再用0.5M的NaOH溶液洗涤I~2个柱体积，再用二次蒸馏水洗涤10个柱体积，直至柱子里不再有NaOH溶液，然后用柱平衡缓冲液(36mM KH2PO4,18mM K2HPO4, 200mM KCl)洗涤5个柱体积，平衡纯化柱。
[0042](4)蛋白纯化 纯化蛋白所用缓冲液:`
柱平衡缓冲液:36mM KH2PO4,18mM K2HPO4, 200mM KCl ；
洗脱缓冲液:0.36g麦芽糖，柱平衡缓冲液100mL。
[0043]将诱导后的细菌沉淀放在冰上冻融，用30mL柱平衡缓冲液悬浮细菌，超声破碎(运行3秒，停3秒，180个循环)至溶液变为半透明状态为止，然后用高速冷冻离心机(J-26XP, Beckman) 12000rpm, 4°C离心40min,取上清用取上清用0.45 μ m的滤膜过滤。
[0044]将过滤好的上清用再生好的MBP柱树脂4°C结合2h，2h后将粗酶与树脂的混合液倒入空柱中，待其全部加入柱子中后用柱平衡缓冲液冲洗树脂使杂蛋白从树脂上脱落下来，用考马斯亮蓝来检验杂蛋白的量，待考马斯亮蓝不显色后说明杂蛋白已基本洗干净。最后在树脂中加入5mL洗脱缓冲液，然后用一干净浓缩管收集目的蛋白同样用考马斯亮蓝检验目的蛋白。在4°C下4000rpm离心,浓缩蛋白直至蛋白浓度达到lmg/mL以上,用甘油1:1混合蛋白存放入_20°C保存。优化条件下获得纯化蛋白的SDS-PAGE结果如图7所示，目的蛋白MBP-MlrA纯度在90%以上，通过与蛋白Marker的对照可以看出，蛋白的单体分子量为66 KDa左右，MBP (麦芽糖结合蛋白)标签蛋白大小约为40 KDa，所以去掉标签蛋白藻毒素降解酶的单体分子量为36 KDa左右，与根据藻毒素降解酶酶的氨基酸(序列如SEQ ID N0.2所示)计算得到的基本符合，切除MBP标签后的MlrA蛋白纯度在98%以上。
[0045]实施例3藻毒素降解酶的活性检测
(I)色谱柱的清洗平衡
先打开高效液相色谱仪(安捷伦1200 LC)用含甲醇的水溶液从100%~2%梯度洗脱色谱柱2次，最后用60%甲醇洗至基线，待基线走平20min之后准备样品。
[0046](2)样品的检测 样品信息 上样缓冲液为0.05mol/L磷酸盐缓冲液，调至pH=7.0 ;藻毒素MC-LR、MC-RR标准品浓度为 10Pg/mL,用甲醇稀释至 5.0Pg/mL、1.0Pg/mL、0.5Pg/mL、0.25Pg/mL ；甲醇为 HPLC 色谱纯Fisher实验室分析试剂4L ;水为二次蒸馏水，所有样品都需要用0.22 μ m的滤膜过滤，并用超声波清除里面溶解的气泡。
[0047]检测条件
进样量为IOyL,流动相为60%甲醇，柱温为25°C，流速为0.8mL/min，检测波长为238鹽。仪器为 HPLC (安捷伦 I2OO LC)，柱子为 Eclipse XDB-C18 色谱柱(4.6mmX l5mm)。
[0048]检测标准品238nm处吸收峰面积，制定藻毒素标准品的标准曲线，计算出峰面积与样品浓度的关系(图8，图9)。
[0049]进样检测:
I)取200 μ L磷酸盐缓冲液于ImL的液相小瓶中，进样一次做对照组，看基线是否平稳。
[0050]2)取190 μ L磷酸盐缓冲液、10 μ L (10 μ g/mL)藻毒素于ImL的液相小瓶中，进样两次做底物对照，看基线是否平稳；记录底物的出峰时间和峰面积。
[0051]3)取 182 μ L 磷酸盐缓冲溶液、10 μ L (10 μ g/mL)藻毒素、8 μ L (0.06mg/mL)上述制备的藻毒素降解酶，混合均匀。放入30°C水浴中计时IOmin后测定藻毒素峰面积变化，30min、50min后分别再次检测峰面积变化，以确定藻毒素降解酶的活性，及是否降解完全。结果如图10和图11所示，酶反应时间为30min。制备的藻毒素降解酶降解效率分别是41.2M-g/min/mg.pr 和 47.3M-g/min/mg.pr。
[0052](3)降解产物的鉴定
将用上述制备的藻毒素降解酶降解的MC-LR、MC-RR进行质谱检测，检测图如(图12)，根据降解产物的分子量，推测MlrA降解MC-LR、MC-RR的机理如图13所示。
[0053]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种获得高纯高效的藻毒素降解酶的生物合成方法，其特征在于包括如下步骤: (1)将如SEQID N0.1所示的MlrA序列构建到原核表达载体pMAL_C2X上得到表达MlrA 的载体 pMAL-MlrA ； (2)将pMAL-MlrA转化到大肠杆菌TBl中得到MlrA的表达菌； (3)将MlrA的表达菌用IPTG诱导表达，收集诱导表达后的菌体，破碎后利用pMAL_C2X上的融合蛋白表达标签纯化得到高纯高效的藻毒素降解酶。
2.根据权利要求1所述的获得高纯高效的藻毒素降解酶的生物合成方法，其特征在于: 步骤(1)中所述的载体pMAL-MlrA通过如下步骤的方法的制备:将如SEQ ID N0.1所示的MlrA通过合成载入克隆载体pUC19中，获得pUC19_MlrA ；以pUC19_MlrA为模板，用MlrA上游引物和下游引物扩增MlrA ;通过上下游引物上的酶切位点BamH I和Hind III将MlrA构建到pMAL-C2X载体上，得到表达MlrA的载体pMAL-MlrA ； 其中，MlrA 上游引物为 5’ -GCGGATCCATGCGGGAGTTTGTCAAACAG-3’，MlrA 下游引物为 5’-CGCAAGCTTTCACGCGTTCGCGCCGGACTT-3，。
3.根据权利要求1所述的获得高纯高效的藻毒素降解酶的生物合成方法，其特征在于: 步骤(3)中所述的诱导条件为:诱导前菌液0D600为1.0，IPTG浓度为0.5mM，诱导表达温度为22°C，诱导时间为8小时。
4.根据权利要求1所述的获得高纯高效的藻毒素降解酶的生物合成方法，其特征在于: 步骤(3)中所述的纯化的方法包括如下步骤:用二次蒸馏水、0.5M的NaOH溶液、柱平衡缓冲液洗涤MBP柱，平衡纯化柱；将 收集的诱导表达后的菌体用柱平衡缓冲液重悬，超声破碎，离心取上清，与平衡后的MBP树脂结合；将结合的混合液倒入到空柱中，先用柱平衡缓冲液冲洗使杂蛋白从树脂上脱落下来，再用洗脱缓冲液洗脱收集目的蛋白得到纯化的藻毒素降解酶MlrA ;其中，柱平衡缓冲液组分为:36mM KH2PO4,18mM K2HPO4, 200mM KCl ;洗脱缓冲液组分为:0.36g麦芽糖，柱平衡缓冲液100mL。
【文档编号】C12N9/52GK103555696SQ201310546005
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年11月6日 优先权日:2013年11月6日
【发明者】冯玲玲, 万坚, 李俊, 吴迪, 苏佳丽, 任彦亮, 肖闪 申请人:华中师范大学