从血液中分离循环肿瘤细胞的方法
【专利摘要】本发明公开了一种从血液中分离循环肿瘤细胞的方法，该方法包括如下步骤：A.将血液样品与能够特异性结合循环肿瘤细胞表面独特抗原的抗体-标记单链多核苷酸复合物混合并孵育；B.将孵育后的血液样品流经微流控芯片，芯片的微通道内至少有一个表面负载有单链多核苷酸，通过多核苷酸与抗体-标记单链多核苷酸复合物中的标记单链多核苷酸的特异性结合将循环肿瘤细胞从血液中分离出来并固定在芯片表面，以实现循环肿瘤细胞与血液样品的分离。本发明中的芯片的微通道具有特殊的几何结构，能够增加血液中细胞与微通道表面接触的几率，从而提高循环肿瘤细胞的捕获效率，且芯片无需进行抗体负载，整个捕获过程操作简便，同时芯片也易于长期保存。
【专利说明】从血液中分离循环肿瘤细胞的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物与医学检测，涉及一种从混合细胞群体中分离稀有细胞的方法，特别涉及一种从血液样品中分离循环肿瘤细胞的方法。
【背景技术】
[0002]稀有细胞是指生物样本中存在的数量稀少却具有重要生物学功能或临床检测意义的细胞，如人外周血中的循环肿瘤细胞、循环内皮细胞、被病毒感染的细胞，以及实体肿瘤中的肿瘤干细胞等。由于稀有细胞数量极其稀少，对其检测犹如大海捞针，而对其进一步的分析就更加困难，因此急需发展能够高效、快速的将稀有细胞从复杂生物样本中分离出来的方法与工具。 [0003]人外周血中的循环肿瘤细胞(CTC)是一类具有代表性的稀有细胞，它是指自发或因诊疗操作由肿瘤病灶播散进入外周血循环的肿瘤细胞，并在一定条件下可发展为肿瘤转移性病灶(Racila E, Euhus D, Weiss AJ, et al.Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.1998,95, 4589-4594 ；Pantel K，Brakenhoff RH，Nat.Rev.Cancer2004，4，448-456 ；Zhe XN，Cher ML, Bonfil RD, Am.J.Cancer Res.2011，1，740-751 ；Butler TP，Gullino PM, CancerRes.1975,35,512-516) o由于超过90%的癌症死亡是由转移造成的(Mehlen P，PuisieuxA，Nat.Rev.Cancer2006，6，449-458)，而循环肿瘤细胞是肿瘤转移灶的直接来源(DawoodS，Cristofanilli M，Curr.Treat Options Oncol.2007，8，89-95 ;Fidler IJ，Nat.Rev.(68^^1^2003,3,453-458),因此从血液中检测循环肿瘤细胞越来越引起人们的重视。目前已有证据显示检测外周血中的循环肿瘤细胞数目可用于实体瘤患者的预后以及预测化疗的有效性，包括乳腺癌(Cristofanilli M，BuddT，Ellis MJ，et al.N.Engl.J.Med.2004,351，781-791 ;Smerage JB，Hayes DF，Cancer Invest.2008，26，109-114)、前列腺癌(Moreno JG, Miller MC，Gross S，et al.Urology2005，65，713-718 ;De Bono JS，ScherHI，Montgomery RB，et al.Clin.Cancer Res.2008，14，6302-6309 ；Scher HI，Jia XY，DeBono JS, et al.Lancet Oncol.2009，10，233-239)、结肠癌(Sastre J, Maestro ML, PuenteJ，et al.Ann.0ncol.2008，19，935-938)、肾细胞癌(Bluemke K，Bilkenroth U，MeyeA，etal.Cancer Epidemiol.Biomarkers Prev.2009，18，2190-2194)，黑色素瘤(Palmieri G，Satriano SM，Budroni M，et al.BMC Cancer.2006，6，266 ；Mocellin S，Hoon D，AmbrosiA，et al.Clin.Cancer Res.2006，12，4605-4613)等。进一步运用循环肿瘤细胞负荷作为潜在预测指标来指导实体瘤患者的病程分期和复发监控已成为癌症研究中一个活跃而重要的课题(Pachmann K，Dengler R, Lobodaseh K, et al.J.Cancer Res.Clin Oncol, 2008,134,59-65)o
[0004]循环肿瘤细胞在外周血中含量极少，每10ml血液可能仅含几个到几十个循环肿瘤细胞，却有多达约1亿个白细胞和500亿个红细胞(Zhe XN, Cher ML，Bonfil RD，Am.J.Cancer Res.2011，1,740-751)，因此从外周血中快速、高效的分离循环肿瘤细胞是后续对循环肿瘤细胞计数、以及分子、功能分析的前提。目前循环肿瘤细胞的分离方法主要可分为两类。一类是基于循环肿瘤细胞与血液中其他细胞物理性质的差异，如密度(Rosenberg R,Gertler R, Friederichs J, et al.Cytometry2002，49，150-158)、大小(VonaG，Sabile A，Louha M，et al.Am.J.Pathol.2000，156，57-63 ；Zheng S，Lin H，Liu J-Q，et al.J.Chromatogr.A.2007，1162，154-161 ；Tan SJ，Yobas L, Lee GYH，et al.2009，11，4,883-892 ;美国专利申请20060254972 ;美国专利7，846，393)等的不同从而实现循环肿瘤细胞与其他细胞的分离。然而血液中的血细胞数量巨大，其密度、大小的分布很宽，而循环肿瘤细胞又具有较大的异质性，因此通过细胞物理性质差异分离循环肿瘤细胞往往会混入大量的白细胞，获得的样品纯度很低，难以进行后续分析。另一类循环肿瘤细胞捕获方法主要基于其表面与血细胞不同的独特抗原，通过针对循环肿瘤细胞表面独特抗原的抗体或核算适配体实现循环肿瘤细胞的捕获并与血液中其他细胞分离。目前可选择的抗原包括上皮细胞抗原EpCAM，器官特异性标志物(如PSA、CEA和HER-2)，EMT标志物等(Trzpis M，McLaughlin PM, De Leij LM，Harmsen MC，Am.J.Pathol.2007，171，386-395 ;美国专利申请 20130209493)，这一方法的富集效率可达(1-20) X 104 倍(Paterlin1-BrechotP, BenaliNL，Cancer Lett.2007，253，180-204)，同时也存在可用于捕获循环肿瘤细胞的核算适配体(美国专利申请20130035630)。其中最具代表性的技术是已被美国FDA批准应用于检测转移性乳腺癌、前列腺癌及结直肠癌患者外周血中循环肿瘤细胞的CellSearchTM系统(Cristofanilli M，Budd T,Ellis MJ，et al.N.Engl.J.Med.2004，351，781-791 ；RiethdorfS，Fritsche H，Muller V，et al.Clin.Cancer Res.2007，13，920-928 ；Cohen SJ, PuntCJA，Iannotti N，et al.J.Clin.0ncol.2008，26，3213-3221)，这一系统运用标记有针对EpCAM抗体的磁性颗粒进行血液中循环肿瘤细胞的捕获，但其捕获效率较低，存在血细胞的非特异性吸附，且这一方法捕获的循环肿瘤细胞已丧失活性，难以进行信号通路与功能性分析，无法对其进行体外培养。近年来通过将微流控芯片技术与抗体捕获相结合发展出了一系列的循环肿瘤细胞芯片捕获技术，通过特殊几何设计的微通道大大增加了细胞与负载有抗体的捕获表面的碰撞几率以提闻循环肿瘤细胞的捕获效率，如微柱阵列芯片(NagrathS,Sequist LV,Maheswaran S, et al.Nature2007,450,1235-1239 ；Maheswaran S,SequistLV, Nagrath S, et al.N.Engl.J.Med.2008，359，366-377)、具有周期性表面凹凸结构的“鱼骨型”芯片(Stott SL，Hsu C-H, Tsukrov DI，et al.Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.2010,107,18392-18397)等，同时保持了循环肿瘤细胞的活性。但是，基于微流控芯片与抗体的捕获方法的捕获效率仍有待于进一步提高，捕获到细胞的纯度较低，存在大量白细胞的非特异性吸附，且这些方法由于需要对芯片进行抗体修饰，其操作较为繁琐，并且负载了抗体的芯片不易长期保存。
【发明内容】
[0005]本发明的目的，就是为了提供一种从混合细胞群体中分离稀有细胞的方法，特别是从血液样品中分离循环肿瘤细胞的方法。
[0006]为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案:一种从血液样品中分离循环肿瘤细胞的方法，包括如下步骤:
[0007]A、将经抗凝处理的血液样品与能够特异性结合循环肿瘤细胞表面独特抗原的抗体-标记单链多核苷酸复合物混合并孵育；[0008]B、将孵育后的血液样品流经微流控芯片，芯片的微通道内至少有一个表面负载有单链多核苷酸，该单链多核苷酸能够与抗体-标记单链多核苷酸复合物中的标记单链多核苷酸特异性结合，并通过这种特异性结合将循环肿瘤细胞从血液中分离出来并固定在芯片表面以实现循环肿瘤细胞与血液样品的分离。
[0009]上述方法中，所述抗体-多核苷酸复合中的单链多核苷酸与负载于芯片微通道表面的单链多核苷酸能够特异性结合并形成稳定的双链结构，优选的，两条单链多核苷酸中至少有连续的10个核苷酸互补，更优选的，至少有连续的20个核苷酸互补。
[0010]上述方法中，所述抗体-标记单链多核苷酸复合物中的标记单链多核苷酸通过共价键与抗体直接相连，或者抗体与标记单链多核苷酸通过共价键或其他作用力共同连接在纳米粒子上。
[0011]上述方法中，所述针对循环肿瘤细胞表面独特抗原的抗体-标记单链多核苷酸复合物可以是一种，也可以是针对不同抗原的多种抗体-标记单链多核苷酸复合物。
[0012]上述方法中，所述芯片微通道中负载多核苷酸的表面为二氧化硅、硅片或通过沉积了金属氧化物纳米线、纳米带等微结构而产生的粗糙化的表面。
[0013]上述方法中，所述芯片微通道表面上负载多核苷酸的方式可通过静电作用或共价作用。
[0014]上述方法中，所述微流控芯可以通过并联的组合形式从而能够处理更大量的血液样品，以及通过串联的组合形式提闻血液中循环肿瘤细胞的捕获效率。
[0015]上述方法中，所述微流控芯片具有使所述微流控芯片具有使流经该芯片的血液中的细胞增加与负载有单链多核苷酸表面接触几率的几何结构，该几何结构包括周期性的微柱阵列结构、具有周期性表面凹凸的“鱼骨型”结构或表面沉积有纳米线、纳米带等微结构基底。
[0016]上述方法中，所述的血液样品流经微流控芯片的流速为每小时100微升至10毫升。
[0017]与现有技术相比，本发明具有以下的优点和特点:
[0018]1)本发明不同于以往的将抗体固定在微通道表面进行捕获，而是将抗体与细胞混合，抗体与稀有细胞表面的特异性抗原结合，同时这些抗体上连有标记单链多核苷酸，可以被微通道表面负载的与之能够特异性结合的单链多核苷酸所捕获。这将原来细胞表面的抗原与微通道表面抗体间的相互结合转化成细胞表面结合的抗体上的多核苷酸与微通道表面负载的多核苷酸之间的相互结合。后者相互结合的能力高于前者，因此稀有细胞更容易被捕获。
[0019]2)由于稀有细胞数目极少，而大量无关细胞(如血液中的红细胞、白细胞)在微通道表面、尤其是在负载了抗体的表面的非特异性吸附导致捕获到的细胞纯度很低，而且由于这些非特异性细胞占据了部分表面导致可用于捕获的表面减少，捕获率降低，同时容易粘附样本中的其他细胞，使纯度进一步降低。本发明中的芯片负载了多核苷酸，带负电，能够与细胞表面的负电相排斥，因而能够降低非特异性吸附，提高捕获到细胞中稀有细胞的纯度。
[0020]3)本发明只需对芯片进行简单的多核苷酸负载，而无需进行复杂的抗体负载，因此整个操作较为简便，且由于负载多核苷酸的芯片在真空或氮气保护下可在室温或4度长期保存，比负载了抗体的芯片保存更容易，保存时间更长。
[0021]4)美国专利申请US20090017455与中国专利申请200780036725.4采用了抗
体-标记单链多核苷酸复合物与基底多核苷酸特异性结合在基底上构建抗体阵列，捕获溶液中的能与该抗体结合的细胞。其与本发明的不同之处在于:第一、本发明将抗体-标记单链多核苷酸复合物先与细胞混合，然后再与基底多核苷酸结合，而以上专利申请中先将抗体-标记单链多核苷酸复合物与基底多核苷酸结合，然后再去结合溶液中的细胞，与传统的在表面构建抗体阵列用于捕获溶液中细胞的方法并无本质区别，而相比之下本发明对于溶液中细胞的捕获效率更高；第二、以上专利申请是将细胞与固定在基底上的抗体-多核苷酸复合物做静态孵育，而本发明是将抗体-标记单链多核苷酸复合物与细胞混合后在一定流速下通过微流控芯片，该芯片中具有能增加细胞与微通道表面碰撞几率的特殊几何设计，大大提闻了细胞的捕获效率。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1是血液中循环肿瘤细胞的捕获过程示意图。
【具体实施方式】
[0023]本发明一种从血液样品中分离循环肿瘤细胞的方法，包括如下步骤:
[0024]A、将经抗凝处理的血液样品与能够特异性结合循环肿瘤细胞表面独特抗原的抗体-标记单链多核苷酸复合物混合并孵育；
[0025]B、将孵育后的 血液样品流经微流控芯片，芯片的微通道内至少有一个表面负载有单链多核苷酸，该单链多核苷酸能够与抗体-标记单链多核苷酸复合物中的标记单链多核苷酸特异性结合，并通过这种特异性结合将循环肿瘤细胞从血液中分离出来并固定在芯片表面以实现循环肿瘤细胞与血液样品的分离。
[0026]图1是血液中循环肿瘤细胞的捕获过程示意图，其中，1为血液样品中的循环肿瘤细胞，2为血液中除循环肿瘤细胞外的其他细胞，3为捕获抗体-标记单链多核苷酸复合物，4为表面负载的单链多核苷酸,5为能够负载多核苷酸的表面,如表面修饰氨基的玻璃或娃片，6为具有周期性凹凸结构的微流控芯片。经抗凝处理的血液样品中存在少量的循环肿瘤细胞1与大量的其他细胞2，血液样品与抗体-标记单链多核苷酸复合物3混合并孵育，孵育后的血液样品流经具有特殊几何结构的微流控芯片6，芯片的微通道表面5负载有单链多核苷酸4，该多核苷酸能够与抗体-标记单链多核苷酸复合物3中的标记多核苷酸特异性结合，从而将循环肿瘤细胞1与血液样品中的其他细胞2分离并固定在芯片表面5。
[0027]本发明的工作原理是，当肿瘤细胞与负载有针对其表面抗原的抗体表面接触时，其接触面积较小，作用力较弱，而当肿瘤细胞先与抗体-多核苷酸复合物结合，再与负载了互补多核苷酸的表面接触，由于每个抗体上可连接多条标记多核苷酸，且在基底上负载多核苷酸的密度也大于负载抗体，因此肿瘤细胞有更大的几率被基底上负载的多核苷酸所捕犾。
[0028]下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。
[0029]实施例1微流控芯片基底负载多核苷酸
[0030]将序列如SEQ ID N0.1所示的多核苷酸溶于纯水，配成浓度400 μ Μ的溶液，再与二甲基亚砜(DMSO)按体积比2:1稀释为终浓度267 μ Μ的溶液。同时，将用于灌注多核苷酸的聚二甲基硅氧烷PDMS(RTV615，购自通用电气公司)微流控芯片贴在多聚赖氨酸玻璃(购自赛默飞世尔科技Thermo Fisher Scientific公司)上，放在烘箱中80°C处理2小时。处理结束后，采用恒流泵灌注浓度为267 μ Μ的多核苷酸溶液，灌满后放于干燥箱中干燥，待通道中液体完全干后，揭下微流控芯片，将玻璃置于烘箱中80°C处理4小时，然后用纯水快速清洗出去玻璃表面的盐和溶剂残余，氮气吹干 。
[0031]实施例2 “鱼骨型” CTC捕获芯片的制作
[0032]将具有周期性表面凹凸结构的“鱼骨型”PDMS芯片(制作方法见Wang，S.T.；Liu,K.；Liu, J.A.et al,.Angew.Chem.1nt.Ed.2011，50，3084-3088)贴在负载有多核苷酸的多聚赖氨酸玻璃上，确保“鱼骨型”芯片的微通道与基底多核苷酸区域重合，将芯片放于烘箱中80°C处理2小时，处理完毕后待芯片恢复至室温后用夹具固定。“鱼骨型”芯片有一个入口和一个出口，通道呈连续的S型，宽度1mm，整体长度为200mm，芯片的横截面呈周期性的凹凸结构，由两层SU8光刻胶制备而成，下层光刻胶厚度为70 μ m,上层光刻胶厚度为35 μ m，上层的鱼骨图形呈周期性排列，“鱼骨”宽度为35μπι，水平夹角为45度，周期性间隔为100 μ m, 一组共20条“鱼骨”。
[0033]实施例3 “鱼骨型”芯片捕获血液中的稀有肿瘤细胞
[0034]首先在“鱼骨型”芯片中通过恒流泵灌注3%牛血清白蛋白(BSA)，室温静置1小时对芯片进行封闭。将结肠癌肿瘤细胞HCT116悬浮与细胞培养基中，用细胞膜红色荧光探针Dil (购自碧云天)染成红色，然后取1000个HCT116细胞与1毫升经抗凝处理的健康人的全血混合，同时加入1微升lmg/ml的上皮细胞粘附分子(EpCAM)-标记单链多核苷酸复合物(序列如SEQ ID N0.2所示，其中序列的5端，即左端标记氨基，将单链多核苷酸标记在抗体上使用美国solulink公司的试剂盒Antibody-01 igonucleotide All-1n-0neConjugation Kit),充分混合半小时后采用注射器和恒流泵以lmL / h的流速通过“鱼骨型”PDMS芯片。灌注结束后，通过恒流泵用细胞培养基进行清洗除去多余血液，同时避光收集流经芯片的血液。最后，使用活细胞工作站对“鱼骨型”芯片中肿瘤细胞进行计数以计算捕获率，更准确的，可对流经芯片的血液进行红细胞裂解(红细胞裂解液购自碧云天)，然后对其中未被芯片捕获的肿瘤细胞进行计数，从而可以更准确的计算捕获率。通过长度为200_微通道的芯片的捕获率为61 %，如果连续流经两个相同的“鱼骨型”芯片，即捕获通道长度达到400mm时，捕获率可达89 %。
[0035]实施例4纳米“鱼骨型” CTC捕获芯片的制作与血液中肿瘤细胞的捕获
[0036]利用电纺丝技术可以在“鱼骨型”芯片的基底表面沉淀纳米结构，使之粗糙化，从而增加CTC与基底碰撞时被捕获的效率。电纺丝(Electrospinning)技术是将强电场作用于聚合物溶液，使之形成丝状喷射流，可以在收集表面形成直径为纳米级别的纤维。在本实施例中，使用正硅酸乙酯(TE0S)与聚乙烯吡咯烷酮(PVP)聚合物溶液，通过施加15KV的高压电场，使聚合物溶液呈丝状喷射，在硅片表面“纺”出PVP-Si02纳米线，经过400°C退火后，在光滑的硅片表面形成具有一定粗糙度的Si02纳米纤维结构(Zhang，N.；Deng, Y.；Tai,Q.;etal.，Adv.Mater.2012，24，2756-2760)。在纳米纤维表面负载多核苷酸、制作“鱼骨型”捕获芯片以及从血液中捕获肿瘤细胞的实验同实施例1、2、3，纳米“鱼骨型” CTC捕获芯片的捕获效率可达65% (200mm长的通道)，如果连续流经两个相同的“鱼骨型”芯片，即捕获通道长度达到400mm时，捕获率达到92%。
[0037] 实施例5针对血液中肿瘤细胞表面多个特异性标志物的捕获
[0038]实施例3中使用了针对血液中肿瘤细胞表面特异性的上皮细胞粘附分子EpCAM的抗体进行捕获，由于结肠癌细胞HCT116表面除了表达EpCAM以外，还同时表达EGFR与CD44，因此同时针对多个表面特异性抗原进行的捕获可进一步提高捕获效率，尤其是可以捕获不表达或低表达EpCAM的HCT116细胞。【具体实施方式】同实施例3，唯一不同的是将加入1微升浓度为lmg / ml的EpCAM-标记单链多核苷酸(序列如SEQ ID N0.2所示)复合物改为加入浓度为lmg/ml的EpCAM-标记单链多核苷酸(序列同上)复合物、浓度为lmg /ml的EGFR-标记单链多核苷酸(序列同上)复合物与浓度为lmg / ml的⑶44-标记单链多核苷酸(序列同上)复合物各1微升，其捕获效率可提升至67%，如果连续流经两个相同的“鱼骨型”芯片，即捕获通道长度达到400mm时，捕获率为98%。
【权利要求】
1.一种从血液中分离循环肿瘤细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤:A、将经抗凝处理的血液样品与能够特异性结合循环肿瘤细胞表面独特抗原的抗体-标记单链多核苷酸复合物混合并孵育；B、将孵育后的血液样品流经微流控芯片，芯片的微通道内至少有一个表面负载有单链多核苷酸，该单链多核苷酸能够与抗体-标记单链多核苷酸复合物中的标记单链多核苷酸特异性结合，并通过这种特异性结合将循环肿瘤细胞从血液中分离出来并固定在芯片表面以实现循环肿瘤细胞与血液样品的分离。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的血液样品是指经过抗凝处理的全血样本，其体积为1毫升至10毫升，抗凝剂包括乙二胺四乙酸、柠檬酸或肝素。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗体-标记单链多核苷酸复合物中的标记单链多核苷酸与负载于芯片微通道表面的单链多核苷酸能够特异性结合并形成稳定的双链结构，两种单链多核苷酸中至少有连续的10个核苷酸互补，或者至少有连续的20个核苷酸互补。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗体-标记单链多核苷酸复合物中的标记单链多核苷酸通过共价键与抗体直接相连，或者抗体与标记单链多核苷酸通过共价键或其他作用力共同连接在纳米粒子上。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述能够特异性结合循环肿瘤细胞表面独特抗原的抗体-标记单链多核苷酸复合物可以是一种，也可以是针对不同抗原的多种不同的抗体-标记单链多核苷酸复合物。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述芯片微通道内负载多核苷酸的表面为二氧化硅、硅或通过沉积 金属氧化物纳米线、纳米带而产生的粗糙化的表面。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述芯片微通道表面通过静电作用或共价作用负载多核苷酸。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微流控芯通过并联组合使用或通过串联组合使用。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微流控芯片具有使流经该芯片的细胞增加与负载有单链多核苷酸表面接触几率的几何结构，该几何结构包括周期性的微柱阵列结构、具有周期性表面凹凸的“鱼骨型”结构或表面沉积有纳米线、纳米带的基底。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的血液样品流经微流控芯片的流速为每小时100微升至10毫升。
【文档编号】C12N5/09GK103642755SQ201310546026
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2013年11月6日 优先权日:2013年11月6日
【发明者】施奇惠, 邓宇亮, 张瑜, 孙帅 申请人:上海交通大学