用于检测革兰阴性杆菌常见碳青霉烯酶基因的lamp引物、试剂盒及其检测方法
【专利摘要】本发明公开了用于检测革兰阴性杆菌常见碳青霉烯酶基因的LAMP引物、试剂盒及其检测方法。本发明LAMP引物中，KPC和NDM引物组可检测到除NDM-10以外的所有亚型，IMP和VIM引物组可检测到国内外常见亚型。本发明建立的LAMP试剂盒用于联合检测KPC、NDM、IMP和VIM基因，可涵盖非发酵菌和肠杆菌科细菌常见的碳青霉烯酶基因，可准确快速的进行常见碳青霉烯酶基因的筛查，对于及时发现并进一步控制碳青霉烯酶基因在肠杆菌科细菌中传播导致的暴发流行具有重大的临床意义。本发明试剂盒检测灵敏度高，KPC、NDM、IMP和VIM基因的最低检测极限均可达到100CFU/反应。
【专利说明】用于检测革兰阴性杆菌常见碳青霉烯酶基因的LAMP引物、
试剂盒及其检测方法
【技术领域】[0001]本发明属于细菌耐药基因检测【技术领域】，特别涉及用于检测KPC、NDM、IMP和VIM基因的LAMP引物、试剂盒及其检测方法。
【背景技术】[0002]碳青霉烯类抗生素是目前抗菌谱最广，抗菌活性最强的非典型b_内酰胺类抗菌药物。由于其对b-内酰胺酶稳定和毒性低的特点，该类药物已经成为目前治疗多种细菌感染的主要抗菌药物之一。然而，随着其临床应用日益广泛，碳青霉烯类抗生素不可避免地出现细菌耐药现象，这些菌株也大都表现为泛耐药。近年来，耐碳青霉烯的非发酵菌甚至肠杆菌科细菌的报道都越来越多，对于这种耐药菌株的快速检测并预防其流行在临床工作中极为重要。[0003]近几年对于耐药性的调查研究显示，产碳青霉烯酶是细菌对碳青霉烯类抗生素耐药的主要原因。对于这类产酶菌株的监测最快速有效的方法是检测其耐药基因。针对临床常见且水解活性强的碳青霉烯酶进行分子生物学方法检测其相关基因成为急需的实验室技术。KPC (Klebsieila pneumoniae carbapenemase,KPC)是引起肠杆菌科细菌对碳青霉烯耐药的主要原因，而NDM (New Delhi metallo-b_lactamase)是引起世界关注的新发现的强水解活性的碳青霉烯酶，IMP和VIM (Verona integron-encoded MBL)是临床中常见的具有强水解碳青霉烯活性的金属b-内酰胺酶。上述四个基因可以涵盖非发酵菌和肠杆菌科细菌常见碳青霉烯酶基因，进行快速检测对于及时发现并进一步控制这类细菌的流行有很重要的临床意义。[0004]目前用于检测碳青霉烯酶基因的主要技术是PCR，如多重PCR，荧光定量PCR。但这些方法或操作不够简化快捷，或检测成本高需要特殊仪器设备。而近几年新兴起的基因扩增方法，环介导等温扩增方法(Loop-Mediated Isothermal Amplification, LAMP),主要是针对目的基因的6个区域设计4条特异性引物及2条辅助成环引物，在恒温条件下即可完成核酸扩增反应，且可以达到成本低，操作简便，检测时间短，灵敏特异的检测目的基因。这项技术自发现起已广泛用于检测细菌领域，并有相关专利获得授权。虽国内已有发明利用LAMP方法检测NDM-U申请号20111029784.4)，但由于NDM基因因存在位点的突变，有多个亚型，此发明不能满足NDM基因所有型别的检出。而且也没有MP、VIM, KPC基因的检测。因此，对于碳青霉烯酶基因的检测是不够全面的。本发明更是针对上述四个基因国内临床常见亚型的基因保守区设计特异的LAMP引物，以便能更敏感特异的检出相应的基因片段。在引物设计的基础上，我们基于LAMP的方法建立了一种能对同一标本的KPC、NDM、IMP和VIM四种碳青霉烯酶基因进行检测的试剂盒。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一组用于检测细菌常见碳青霉烯酶基因(KPC、NDM、IMP和VM)的LAMP引物，并建立一种常见碳青霉烯酶基因的LAMP检测试剂盒及其检测方法，以灵敏特异、简便快速的检测细菌常见碳青霉烯酶基因。
[0006]本发明所采取的技术方案是:
用于检测革兰阴性杆菌常见碳青霉烯酶基因的LAMP引物，包括KPC引物组、NDM引物组、IMP引物组和VM引物组，其核苷酸序列分别如下所示:
1)KPC引物组:
外引物:
【权利要求】
1.用于检测革兰阴性杆菌常见碳青霉烯酶基因的LAMP引物，包括KPC引物组、NDM引物组、IMP引物组和VIM引物组，其核苷酸序列分别如下所示: 1)KPC引物组: 外引物:
KF3:GTATCGCCGTCTAGTTCTG (SEQ ID N0.1),
KB3:TGAATGAGCTGCACAGTG (SEQ ID N0.2)； 内引物:
KFIP:AATGGTTCCGCGACGAGGCTGTCTTGTCTCTCATGGC (SEQ ID N0.3),
KBIP:GGACTTTGGCGGCTCCATGCGCGGTAACTTACAGTT (SEQ ID N0.4)； 环引物:
KLoopF:GGCAGAAAAGCCAGCCAG (SEQ ID N0.5),
KLoopB:CGATGGATACCGGCTCAG (SEQ ID N0.6)； 2)NDM引物组: 外引物:
NF3:AACACAGCCTGACTTTCG (SEQ ID N0.7)，
NB3:GCTCATCACGATCATGCT (SEQ ID N0.8)； 内引物:
NFIP:ATGTCGGTGCCGTCGATCCCCGCTCAAGGTATTTTACC (SEQ ID N0.9)，
NBIP:GCTTTTGGTGGCTGCCTGATCACCGAGATTGCCGAG (SEQ ID N0.10)； 环引物:
NLoopF:GATATTGTCACTGGTGTGGC (SEQ ID N0.11)，
NLoopB:GGACAGCAAGGCCAAGTC (SEQ ID N0.12)； 3)MP引物组: 外引物:
IF3:GGGCGTTGTTCCTAAACA (SEQ ID N0.13)，
IB3:GCTTGAACCTTACCGTCTT (SEQ ID N0.14)； 内引物:
IFIP:ACGTTCCACAAACCAAGTGACTGGTTGTTCTTGTAGATGCTGA (SEQ ID N0.15)，
IBIP:CAGCACGGGCGGAATAGAGGCTCATTAGTTAATTCAGACGC (SEQ ID N0.16)； 环引物:
ILoopF:TTAGCCGTAAATGGAGTGTCAA (SEQ ID N0.17)，
ILoopB:TGGCTTAATTCTCAATCCATCC (SEQ ID N0.18)； 4)VM引物组: 外引物:
VF3:CTTCGGTCCAGTAGAACTCT (SEQ ID N0.19),
VB3:GTGTGCTTGAGCAAGTCT (SEQ ID N0.20)； 内引物:
VFIP:TCGCACAACCACCATAGAGCGCATTCGACCGACAACTT (SEQ ID N0.21)，
VBIP:GTTGTCACGCACGTCTGCGAATCCGCTCAATGGAGG (SEQ ID N0.22)；环引物:
2.用于检测革兰阴性杆菌常见碳青霉烯酶基因的LAMP试剂盒，其特征在于:该试剂盒包括权利要求1所述的LAMP引物。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于:该试剂盒包括以下组份:(1)权利要求1所述的LAMP引物；(2) 2X反应缓冲液；(3) DNA Bst聚合酶；(4)荧光指示剂或显色剂；(5)阳性对照；(6)阴性对照。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于:2X反应缓冲液包括:40mMTris-HCl(pH 8.8),20mM KCl, 16mM MgSO4, 20mM (NH4) 2S04,0.2v/v% Tween-20，0.8M 甜菜碱，2.8mMdNTPs。
5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于:阳性对照为分别为KPC、NDM、IMP和VIM基因阳性的四种DNA模板；阴性对照为灭菌双蒸水。
6.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于:荧光指示剂为Syto-9，显色剂为SYBR-Green。
7.利用权利要求2~6任意一项所述的试剂盒检测革兰阴性杆菌常见碳青霉烯酶基因的方法，包括以下步骤: 1)提取待检样本DNA; 2)恒温扩增反应:配制反应体系:2X反应缓冲液12.5iil、DNA Bst聚合酶8U、KPC或NDM或MP或VM引物组、荧光指示剂0.5 U 1、待检样本DNA模板I y 1、用灭菌双蒸水补齐至25iU，同时设置阳性对照和阴性对照；最后加入20 Ul无菌石蜡油，混匀，离心，将反应管置于突光定量PCR仪，63°C扩增反应50分钟,于每分钟末进行突光收集； 3)结果判断:呈S型扩增曲线，且起峰时间小于40分钟，判定为阳性。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于:反应体系中，KPC引物组或NDM引物组或IMP引物组或VM引物组的外引物各为5pmol、内引物各为40pmol、环引物各为20pmol。
9.利用权利要求2~6任意一项所述的试剂盒检测革兰阴性杆菌常见碳青霉烯酶基因的方法，包括以下步骤: 1)提取待检样本DNA; 2)恒温扩增反应:配制反应体系:2X反应缓冲液12.5iil、DNA Bst聚合酶8U、KPC引物组或NDM引物组或MP引物组或VM引物组、待检样本DNA模板I y 1、用灭菌双蒸水补齐至25iU，同时设置阳性对照和阴性对照；加入20 Ul无菌石蜡油，混匀，离心，然后于反应管盖内侧加I U I显色剂；将反应管置于金属浴中，63°C扩增反应40分钟； 3)结果判断:反应完成后，将反应液与显色剂混匀，呈现绿色为阳性，呈现橙色为阴性。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于:反应体系中，KPC引物组或NDM引物组或IMP引物组或VM引物组的外引物各为5pmol、内引物各为40pmol、环引物各为20pmol。
【文档编号】C12Q1/68GK103614465SQ201310545991
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2013年11月6日 优先权日:2013年11月6日
【发明者】芮勇宇, 程灿灿, 郑芬, 孙静静 申请人:南方医科大学