包含黄柏酮的组合物及在皮肤抗老化应用中使用该组合物的方法与流程

本文描述了包含黄柏酮(bacunone)的组合物及它们在抑制皮肤蛋白羰基化的方法中的用途，以及改善皮肤外观或改善至少一种皮肤老化迹象例如皮肤泛黄的方法。
背景技术：
：氧化应激与在被称为蛋白羰基化的反应中活性氧的非酶性生成有关。蛋白羰基化是用于描述一种过程的术语，在该过程中，反应活性的醛或酮通过氧化被引入到蛋白中。羰基蛋白(proteincarbonyl)已被证明是蛋白氧化的主要产物并可通过以下方式形成：蛋白的氧化裂解、氨基酸残基的直接氧化或与脂质过氧化衍生的醛的共价反应。蛋白羰基化是由于氨基酸侧链的直接金属催化氧化(初级蛋白羰基化)或反应活性的醛与氨基酸侧链加成(次级蛋白羰基化)导致的。因此，已知的是，外源性的反应活性醛例如丙烯醛是从香烟烟雾衍生的。然而，反应活性醛也可内源性形成，例如，在人体中随处可见的多不饱和脂肪酸的氧化降解可导致形成各种醛，例如丙烯醛和4-羟基壬烯醛(4-HNE)。先前已经报道，初级蛋白羰基化在活性氧(ROS)信号传导机制中起着重要作用。具体地，初级蛋白羰基化介导细胞信号传导并且初级蛋白羰基化是可逆的。初级蛋白羰基化涉及氨基酸侧链的直接金属催化的氧化，尤其是在以下4种敏感的氨基酸残基上：脯氨酸、精氨酸、赖氨酸和苏氨酸。脯氨酸或精氨酸侧链的氧化导致谷氨酸半醛的形成，而赖氨酸氧化产生氨基己二酸半醛，从而将羰基引入到蛋白质结构中。氧化还将苏氨酸侧链的羟基基团转化成羰基，形成2-氨基-3-酮丁酸。次级蛋白羰基化机制包括反应活性醛与赖氨酸、组氨酸和半胱氨酸残基侧链的迈克尔加成反应，以及还原糖与赖氨酸和精氨酸上的氨基形成希夫碱，导致渐进性糖化终极产物的增加。羰基蛋白存 在于各种氧化应激和病症中。除了灭活的蛋白，羰基化的细胞蛋白经历蛋白酶体依赖性降解。初级蛋白羰基化被认为在氧化应激过程中起着标记受损蛋白从而将它们从生物系统中清除的重要作用。已有充分证明的是，羰基蛋白的产生是氧化应激的标志，所述氧化应激为例如由于外源性因素，如由紫外线照射或外用氧化性化学制品所诱导的，或由于内源性因素，即由脂质过氧化物的降解衍生出的反应活性羰基进行的化学攻击。光损伤的面部皮肤具有各种独特的特征，例如黑斑、皱纹和下垂。老年人，尤其是亚洲人，随着光老化肤色往往会变泛黄。在中国人中，面部泛黄意味着暗淡或不粉嫩。光损伤或老化的常见临床迹象包括皮肤呈现特有的蜡黄或黄色外观。已经表明，皮肤的羰基化既发生在皮肤的表皮层也发生在真皮层。此外，皮肤的羰基化经常会造成面临氧化应激的皮肤组织和结构的显著性光损伤，如果没有长期的预防或治疗，会导致不可逆的变色：面部泛黄。因此，非常需要能够抑制或预防蛋白羰基化的抗老化组合物和方法以改善皮肤外观或改善至少一种皮肤老化迹象(例如皮肤泛黄)并增强面部皮肤的皮肤亮度。技术实现要素：一个实施方案涉及具有降低或抑制蛋白羰基化活性的局部组合物，其基本上由以下组成：有效降低或抑制蛋白羰基化的量的约75-100％纯的黄柏酮；美容上可接受的媒介物；和任选地，一种或多种美容成分，其选自：醇、脂肪、油、表面活性剂、脂肪酸、硅油、湿润剂、保湿剂、粘度调节剂、乳化剂、稳定剂、着色剂和香料；和/或皮肤美白剂，其选自：酪氨酸酶抑制剂、自由基清除剂及它们的混合物。另一个实施方案涉及具有降低或抑制蛋白羰基化活性的局部组合物，其由以下组成：有效降低或抑制蛋白羰基化的量的约90％纯的黄柏酮；美容上可接受的媒介物；和任选地，一种或多种美容成分，其选自：醇、脂肪、油、表面活性剂、脂肪酸、硅油、湿润剂、保湿剂、粘度调节剂、乳化剂、稳定剂、着色剂和香料；和/或皮肤美白剂，其选自：酪氨酸酶抑制剂、自由基清除剂及它们的混合物。在所述组合物中，所述黄柏酮是从至少一种以下植物的提取物中纯化得 到的，所述植物选自：吴茱萸(Evodiarutaecarpa)、白藓皮(Dictamnicortex)、黄柏皮(Phellodendriamurensiscortex)、佛手(Citrisarcodactylisfructus)、枳实(Aurantiifrusctusimmaturus)和香橼(Citrifructus)。将吴茱萸提取物相对于吴茱萸碱、吴茱萸次碱和柠檬苦素中至少一种的含量进行标准化。在该组合物中，所述黄柏酮是约99.99％纯的黄柏酮活性物。该组合物是选自以下的制剂：霜剂、软膏剂、泡沫剂、洗剂、硬膏剂、片剂、颗粒剂或乳剂。在该组合物中，有效降低或抑制蛋白羰基化的量为约10-1000mg。在该组合物中，所述黄柏酮占该组合物的大约1-99％w/w。可选择地，所述黄柏酮占该组合物的大约1-75％w/w。或者，所述黄柏酮占该组合物的大约50-70％w/w。另一实施方案涉及局部组合物，其包含美容上可接受的媒介物和一定量的至少90％纯的黄柏酮，其中所述黄柏酮占该组合物的大约1-99％w/w。其他实施方案涉及改善皮肤外观或改善至少一种皮肤老化迹象的方法，该方法包括将组合物以美容上有效的量局部施用至皮肤，所述量足以改善皮肤外观或至少一种皮肤老化迹象，其中所述组合物包含一定量的约75-100％纯的黄柏酮、美容上可接受的媒介物，和任选地，一种或多种美容成分，其选自：醇、脂肪、油、表面活性剂、脂肪酸、硅油、湿润剂、保湿剂、粘度调节剂、乳化剂、稳定剂、着色剂和香料；和/或皮肤美白剂，其选自：酪氨酸酶抑制剂、自由基清除剂及它们的混合物。在该方法中，所述组合物是选自以下的产品形式：气溶胶、霜、乳液、固体、液体、分散体、泡沫、凝胶、洗液、摩丝、软膏、粉末、贴片、润发油、溶液、泵喷雾、棒、小毛巾及它们的组合。另一实施方案涉及美白皮肤的方法，其包括将本文所述组合物局部施用至皮肤，其中该组合物的施用量和持续时间足以可见地(visibly)美白皮肤。另一实施方案还涉及提亮皮肤的方法，其包括将本文所述组合物局部施用至皮肤，其中该组合物的施用量和持续时间足以可见地提亮皮肤。其他实施方案涉及本文所述的局部组合物在制备具有降低或抑制蛋白羰基化活性的美容剂中的用途。另一实施方案涉及预防、改善或减少至少一种皮肤老化迹象的方法，其包括将本文所述的组合物施用至该皮肤，其中该组合物的施用量和持续时间足以预防、改善或减少至少一种皮肤老化迹象。附图说明图1描绘的曲线图显示了黄柏酮在HepG2细胞中的低细胞毒性-CTG。图2描绘的曲线图显示了黄柏酮在HepG2细胞中对蛋白羰基化的剂量依赖性抑制。发明详述应理解的是，本发明并不限于本文所述的具体组合物、方法或方案。此外，除非另外限定，本文所用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属
技术领域：
普通技术人员通常所理解的相同的含义。也应当理解，本文所用的术语仅用于描述具体实施方案且并不旨在限制本发明的范围，而本发明的范围仅通过权利要求进行限定。本发明是基于一项出人意料的发现，即，黄柏酮作为皮肤美白剂具有积极的效果而且无毒(图1)且对蛋白羰基化具有抑制作用(图2)。如图2所示，随着黄柏酮剂量的增加蛋白羰基化受到抑制。因此，本文描述了组合物及其在皮肤的抗老化、美白或提亮方法中的用途，所述组合物包含足以实现降低或抑制蛋白羰基化的量的经纯化的黄柏酮。定义除非另有说明，所有百分比和比例都以重量计。术语“组合物”是指治疗、改善、促进、增强、管理、控制、维持、优化、修正、降低、抑制或预防与自然状态、生物过程或疾病或障碍有关的具体状态的产品。术语“组合物”包括但不限于，药品(即，药物)、非处方药(OTC)、美容品、食品、食品成分或膳食补充剂组合物，其包含有效量的经纯化的化合物、提取物、天然复合物、其至少一种成分或它们的混合物。示例性的组合物包括霜、美容水、面膜(pack)或粉或乳剂、洗剂、搽剂、泡沫剂、片剂、硬膏剂、颗粒剂或软膏剂形式的组合物。本文所用术语“提取物”是指包含植物的活性物质成分的固体、半流体或液体物质或制剂，例如浓缩形式的吴茱萸。术语“提取物”旨在不仅包括使用溶剂从植物中制出的粗制提取物，还包括该粗制提取物在该溶剂中的馏分，所述溶剂选自：水、1至4个碳原子的低级醇(例如甲醇、乙醇、丁醇等)、乙烯、丙酮、己烷、乙醚、氯仿、乙酸乙酯、乙酸丁酯、二氯甲烷、N,N- 二甲基甲酰胺(DMF)、二甲亚砜(DMSO)、1,3-丁二醇、丙二醇和它们的组合。只要能确保活性成分的提取和保存，则可采取任何提取方法。本文与黄柏酮连用的术语“纯化的”是指通过将黄柏酮从植物提取物的剩余组分中物理分离出来所制备的黄柏酮。各种纯化方法均是已知的且可用于获得纯黄柏酮。例如，可使用诸如分馏或亲和纯化的方法。作为纯化过程的结果，黄柏酮可以为至少约10％纯；或者，至少约20％纯；或者，至少约30％纯；或者，至少约40％纯；或者，至少约50％纯；或者，至少约60％纯；或者，至少约70％纯；或者，至少约80％纯；或者，至少约90％纯；或者，至少约95％纯；或者，至少约99％纯；但是优选约75％-100％纯。本文所用术语组合物、提取物、提取物混合物、提取物组分和/或活性剂或活性成分的“有效量”或“治疗有效量”是指在一定剂量有效且持续足够长时间以实现所需结果的量。例如，所述“有效量”或“治疗有效量”是指当将本发明的组合物、提取物、提取物混合物、提取物组分和/或活性剂或活性成分给药于受试者(例如，哺乳动物，例如人)，则所述组合物、提取物、提取物混合物、提取物组分和/或活性剂或活性成分的量足以在受试者中产生治疗效果，例如降低或抑制蛋白羰基化、皮肤抗老化、提高或改善皮肤美白和/或提亮、减少或淡化黑斑等。构成“有效量”或“治疗学上有效的治疗”的本公开组合物、提取物、提取物混合物、提取物组分和/或活性剂或活性成分的量将依据活性剂或化合物、所治疗的病症及其严重性、给药方式、治疗持续时间或待治疗受试者的年龄而变化，但是其可由本领域普通技术人员根据自身知识和本公开的内容进行常规确定。术语“预防、改善或减少至少一种老化迹象”和“预防、改善或减少老化迹象”在本文中可互换使用以表明预防、阻止、逆转、缓解、减少和/或降低老化迹象。老化的代表性迹象包括，但不限于，皮肤泛黄、褶(line)、细纹、皱纹、鱼尾纹、黑眼圈、瑕疵、老人斑、妊娠纹或它们的组合。“改善皮肤的外观”和“改善皮肤的美观”在本文中可互换使用以指代皮肤的外观的美学改善。代表性的改善可包括，但不限于，与肤色、色调、肌理、闪耀、亮度、光泽、白度、干净度、厚度、弹性、韧性、保湿性、光滑度、轮廓、硬度、紧致、弯曲性、柔软性、敏感性、毛孔大小或它们的组合有关的有利的特性和/或性质。这些术语还可用于指代对不利的皮肤状况的改善。受所述不利的皮肤状况影响、导致所述不利的皮肤状况或由所述不利 的皮肤状况所引起的代表性的不利状态包括，但不限于，皮肤老化、牛皮癣、湿疹、皮脂溢出、皮炎、晒伤、雌激素失调、色素沉着过多、色素沉着不足、变色、发黄、雀斑、皮肤萎缩、皮肤发疹、皮肤脆性、干燥、触觉粗糙、龟裂、下垂、变薄、增生、纤维化、毛孔粗大、橘皮组织形成、瘀伤、粉刺形成、细胞凋亡、细胞分化、细胞去分化、肿瘤诱导或肿瘤进展的预防、病毒感染、真菌感染、细菌感染、蜘蛛状血管病(毛细血管扩张症(telangectasia))、多毛症、红斑痤疮、瘙痒症、胼胝、疣、鸡眼或它们的组合。术语“药学上可接受的”是指适用于与人和低等动物组合接触且没有过度毒性、不相容性、不稳定性、刺激性等的那些药物、药品、提取物或惰性成分，其与合理的利益/风险比相称。术语“给药”和“施用”的定义是通过本领域已知的途径将组合物提供至受试者，所述途径包括但不限于静脉内、动脉内、口服、胃肠外、含服、局部、透皮、直肠、肌内、皮下、骨内、透粘膜或腹膜内给药途径。在优选实施方式中，以局部途径给药组合物是合适的。本文所用术语“受试者”或“个体”包括可给药该组合物的哺乳动物。哺乳动物的非限制性实例包括人、非人灵长类动物、啮齿类动物(包括转基因和非转基因小鼠)等。在一些实施方式中，所述受试者是哺乳动物，且在一些实施方式中，所述受试者是人。黄柏酮黄柏酮(CAS:751-03-1)是具有分子量454.52的化合物(即，植物成分)，其可提取自芸香科吴茱萸(EvodiarutaecarpaBENTHAM)(芸香科)。例如，芸香科的果实可用EtOH提取，得到吴茱萸的提取物(“吴茱萸提取物”)，其可用作黄柏酮化合物的来源，而所述黄柏酮化合物用在本发明的独特组合物中。术语“黄柏酮”是指植物成分以及植物提取物或天然复合物。黄柏酮(C26H30O7)的示例性结构如下所示：黄柏酮可商业购自各种来源，包括ChemStrongScientificCo.，Ltd或ChengduBiopurifyPhytochemicalsLtd。此外，黄柏酮可从以下植物的提取物中纯化，所述植物包括，例如吴茱萸、白鲜(芸香科)的干燥根皮、黄柏(PhellodendronamurenseRupr.)(Fam.Rutaceae)的干皮、川黄柏(PhellodendronchinenseSchneid.)(Fam.Rutaceae)的干皮、柑橘属金桔(Citrussp.Fortunellamargarita)、香肉果(Casimiroaedulis)、佛手、枳实和香橼。在一些方面，植物的花、头状花序或果实，或叶子用作提取物的来源。当被提取后，可将该提取物标准化为活性标记化合物。例如，可将黄柏提取物相对于小檗碱、巴马丁、柠檬苦素和黄柏酮中至少一种的浓度进行标准化。各种纯化和提取技术在下文中进行更加充分的讨论或为本领域已知的。示例性的提取工艺在一个实施例中，本发明独特组合物中所使用的提取物和/或活性化合物可使用有机溶剂提取技术获得。在另一实施例中，使用H2O、H2O-EtOH、H2O-MeOH或H2O-丙酮等作为溶剂的溶剂连续分馏可用于获得在本发明独特组合物中使用的提取物和/或活性化合物。还可使用全水-乙醇提取技术(totalhydro-ethanolicextractiontechnique)来获得本发明独特组合物中使用的提取物和/或活性化合物。通常，这称为一次性提取。在此工艺中产生的提取物将含有存在于所提取的物质中的各种各样的植物化学物质，包括脂溶性和水溶性物质。在收集提取物溶液后，将溶剂蒸发，得到所述提取物。还可将全乙醇提取用于本发明。这种技术使用的是乙醇，而不是水-乙醇作为溶剂。该提取技术得到的提取物除了包含水溶性化合物外，还可包含脂溶性和/或亲脂性化合物。可用于获得在本发明中使用的提取物和/或活性化合物的提取技术的另一实例是超临界流体二氧化碳提取(SFE)。在这个提取步骤中，待提取的物质未暴露于任何有机溶剂。相反，该提取溶剂是二氧化碳，含有或不含调节剂，并且在超临界条件下(>31.3℃且>73.8巴)。本领域技术人员将理解，可改变温度和压力条件以获得最佳产率的提取物。这一技术得到脂溶性和/或亲脂性化合物的提取物，类似于上述全己烷和乙酸乙酯提取技术。本领域技术人员将理解，还有许多其他的提取和纯化工艺可用于获得在实施本发明中所使用的提取物和/或活性化合物，所述工艺为本领域已知的和在各个专利和出版物中所描述的工艺。例如，以下参考文献中所描述的提取操作可用在本发明的实施中，将这些参考文献引入本文作为参考：Murga等人，“Extractionofnaturalcomplexphenolsandtanninsfromgrapeseedsbyusingsupercriticalmixturesofcarbondioxideandalcohol.”J.AgricFoodChem.2000August:48(8):3408-12；Hong等人，“Microwave-assistedextractionofphenoliccompoundsfromgrapeseed.”NatProdLett.2001；15(3):197-204；Ashraf-Khorassani等人，“Sequentialfractionationofgrapeseedsintooils,polyphenols,andprocyanidinsviaasinglesystememployingCO2-basedfluids.”J.AgricFoodChem.，2004May5；52(9):2440-4。根据本发明的一个实例，黄柏酮提取物可通过将吴茱萸果实用70％EtOH提取来制备。最终提取物具有>5.0％的含水量从而制得天然提取率为植物：成品＝5-7:1的植物提取物。然后将该黄柏酮提取物进行测定并相对于活性标记物的含量例如吴茱萸碱、吴茱萸次碱、小檗碱、巴马丁和柠檬苦素的含量进行标准化。然后将所述黄柏酮活性物通过溶剂-水分配进行纯化，例如二氯甲烷-水、乙酸乙酯-水、正丁醇-水系统。可选择地，所述黄柏酮活性物可用不同的色谱法进行纯化，例如大孔树脂、硅酮树脂、MCI树脂、凝胶等。此外，所述黄柏酮活性物可用制备型色谱、半制备型色谱(例如制备型HPLC、半制备型HPLC)等进行纯化。此外，所述黄柏酮活性物可用高速反流色谱进行纯化。组合物可将黄柏酮配制到组合物中。具体地，一些实施方案涉及具有降低或抑制蛋白羰基化活性的组合物，其包含有效降低或抑制蛋白羰基化的量的黄柏酮。一些其他实施方案涉及用于皮肤美白和/或皮肤提亮的组合物，其包含有效美白或提亮皮肤的量的黄柏酮。一些其他实施方案涉及抗皮肤老化的组合物，其包含有效预防或治疗皮肤老化的量的黄柏酮。一些实施方案涉及降低或抑制蛋白羰基化的组合物，其包含有效降低或抑制蛋白羰基化的量的黄柏酮，其中黄柏酮为至少约75％纯。或者，在该组合物中，黄柏酮为至少约80％纯；或者，至少为约85％纯；或者，至少约90％纯；或者，至少约95％纯；或者，至少约96％纯；或者，至少约97％纯；或者，至少约98％纯；或者，至少约99％纯；或者，在该组合物中，黄柏酮为约99.99％纯。黄柏酮占该组合物的大约至少50％w/w，更优选地，占该组合物的大约至少55％w/w、占该组合物的大约至少60％、占该组合物的大约至少65％w/w、占该组合物的大约至少70％w/w、占该组合物的大约至少75％w/w、占该组合物的大约至少80％w/w、占该组合物的大约至少85％w/w、占该组合物的大约至少90％w/w、占该组合物的大约至少95％w/w、占该组合物的大约至少99％w/w。或者，黄柏酮占该组合物的大约1-99％w/w；或者，黄柏酮占该组合物的大约1-90％w/w；或者，黄柏酮占该组合物的大约1-75％w/w；或者，黄柏酮占该组合物的大约50-70％w/w。在该组合物中，黄柏酮可以约0.001％至约10％的量存在。当然，本领域技术人员将理解，结合到该组合物中的黄柏酮的量可取决于经标准化的标记物的含量。例如，对于从吴茱萸提取物制备的黄柏酮，标记物可为吴茱萸碱、吴茱萸次碱和/或柠檬苦素。因此，如果将黄柏酮标准化为约40％标记化合物，则上述黄柏酮的量将被减半。例如，可将黄柏酮提取物标准化为约0.5％、1.0％、1.5％、2.0％、2.5％、3.0％、3.5％、4.0％、4.5％、5.0％、5.5％、6.0％、6.5％、7.0％、7.5％、8.0％、8.5％、9.0％、9.5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％标记化合物含量。该组合物可具有约6.0至约8.0的pH，或者该组合物可具有基本上中性的pH。在一些实施方案中，其中使用了黄柏酮的组合物具有大体上中性的 pH。一些实施方案涉及用于增强皮肤美白或提亮的组合物。该组合物包含有效量的黄柏酮以增强皮肤美白或提亮。该组合物可包含美容上可接受的媒介物。一些其他实施方案涉及增强皮肤美白或提亮的方法，其包括向受试者给药包含黄柏酮提取物的组合物，其中所述组合物降低或抑制皮肤的蛋白羰基化，从而增强皮肤美白或提亮。可将本发明组合物配制在可接受的载体、媒介物或赋形剂中，并可将其制备、包装并标记为美容品或药品，用于受试者的皮肤美白或提亮中。在一些实施方案中，黄柏酮占该组合物的大约50-70％w/w，而载体、媒介物或赋形剂占该组合物的大约50-30％w/w。通常，所述组合物包含美容上可接受的媒介物。适用于本发明全部实施方案的美容上可接受的媒介物的实例包括，但不限于，水；甘油；各种醇(例如乙醇、丙醇)；植物油；矿物油；硅油；脂肪醚；脂肪酸酯；脂肪醇；二醇；聚二醇或它们的任意组合。配制方法是本领域熟知的且被公开于，例如，Remington'sPharmaceuticalSciences,Gennaro,MackPublishingCo.,EastonPa.,1990中，将其引入本文作为参考。在一些实施方案中，该组合物还可包含一种或多种美白剂来提高该组合物的美白效果。示例性的美白剂包括所有已知的美白剂和将来可被研发的那些。优选地，所述美白剂选自：酪氨酸酶抑制剂、自由基清除剂及它们的混合物。合适的酪氨酸酶抑制剂的实例包括，但不限于，曲酸及其衍生物、熊果苷及其衍生物、甘草提取物及其衍生物、抗坏血酸及其衍生物和氢醌及其衍生物。合适的自由基清除剂的实例包括，但不限于，甘草提取物及其衍生物、维生素E及其衍生物、维生素A及其衍生物、维生素C及其衍生物、迷迭香提取物及其衍生物和超氧化物歧化酶。优选的美白剂选自：曲酸、曲酸衍生物、熊果苷、熊果苷衍生物、熊果提取物、柠檬提取物、黄瓜提取物、维生素C及其衍生物、针叶樱桃提取物和针叶樱桃发酵物。维生素C衍生物非排他性实例为，例如，L-抗坏血酸的烷基酯，例如L-抗坏血酸棕榈酸酯、L-抗坏血酸异棕榈酸酯、L-抗坏血酸二棕榈酸酯、L-抗坏血酸异硬脂酸酯、L-抗坏血酸二硬脂酸酯、L-抗坏血酸二异硬脂酸酯、L-抗坏血酸肉豆蔻酸酯、L-抗坏血酸异肉豆蔻酸酯、L-抗坏血酸2-乙基己酸 酯、L-抗坏血酸-二-2-乙基己酸酯、L-抗坏血酸油酸酯和L-抗坏血酸二油酸酯；L-抗坏血酸的磷酸酯，例如L-抗坏血酸基-2-磷酸酯和L-抗坏血酸基-3-磷酸酯；L-抗坏血酸的硫酸酯，例如L-抗坏血酸基-2-硫酸酯和L-抗坏血酸基-3-硫酸酯；与碱土金属(例如钙和镁)形成的盐。它们可以单独使用或以两或更多种的混合物形式使用。当将黄柏酮与任何已知的美白剂混合时，所述黄柏酮与已知的美白剂的比例为约1:100至约100:1，优选为约1:50至约50:1，更有选为约1:10至约10:1。最优选地，黄柏酮与已知美白剂的比例为约1:5至约5:1。本发明的组合物可制成各种形式。例如，它们可以是美容制剂的形式，例如霜、美容水、面膜或粉的形式，或为乳剂、洗剂、搽剂、泡沫剂、片剂、硬膏剂、颗粒剂、气溶胶喷雾剂、凝胶剂、摩丝、香膏剂或软膏剂的形式。在各制剂中，可结合各种已知的常规美容成分。例如，可包含美容成分如醇、脂肪、油、表面活性剂、脂肪酸、硅油、湿润剂、保湿剂、粘度调节剂、乳化剂、稳定剂、着色剂和香料。一些其他实施方案涉及组合物，可将其配制成适用于局部施用至皮肤的任意方便形式。合适的乳剂包括水包油、油包水和硅包水(water-in-silicone)乳剂。在一些实施方案中，提供了一种改进类型的美白皮肤组合物，其包含皮肤美白剂，其中所述改进在于添加了黄柏酮。所述组合物可包含美容上可接受的媒介物。本发明组合物可局部给药。该组合物可根据需要每天给药一次、给药多次或以任意合适的给药方案进行给药，从而实现所需效果。该组合物可连续给药或间歇给药。方法本文所述的组合物可用于各种美容和/或药物应用，包括抑制或降低蛋白羰基化和/或增强或改善皮肤美白、提亮和亮白。一些实施方案涉及美白皮肤的方法，其包括将上述任意组合物及其任意组合局部施用至皮肤。一些具体实施方案涉及美白皮肤的方法，其包括将组合物局部施用至皮肤，所述组合物包含有效降低或抑制皮肤中的蛋白羰基化的量的黄柏酮。该组合物的施用量和持续时间足以可见地美白皮肤。在含有一种或多种美容成分的局部美白皮肤用美容组合物中，所述美容成分选自：醇、脂肪、油、表面活化剂、脂肪酸、硅油、湿润剂、保湿剂、粘度调节剂、乳化剂、稳定剂、着色剂和香料，所述改进在于包含有效量的黄柏酮以美白皮肤。在该方法中，局部施用的频率将取决于多种因素，包括所期望的对蛋白羰基化的抑制程度及黄柏酮在该组合物中的含量。一种合适的示例性给药方案包括每日两次施用至皮肤，早晚各施用一次。其他实施方案涉及改善皮肤外观或至少一种皮肤老化迹象的方法，所述方法包括向皮肤局部施用美容上有效量的足以改善该皮肤的外观或至少一种皮肤老化迹象的组合物，其中所述组合物包含一定量的约75-100％纯的黄柏酮；美容上可接受的媒介物；和任选地，一种或多种美容成分，其选自：醇、脂肪、油、表面活性剂、脂肪酸、硅油、湿润剂、保湿剂、粘度调节剂、乳化剂、稳定剂、着色剂和香料；和/或皮肤美白剂，其选自：酪氨酸酶抑制剂、自由基清除剂及它们的混合物。在该方法中，所述组合物是选自以下的产品形式：气溶胶、霜、乳液、固体、液体、分散体、泡沫、凝胶、洗液、摩丝、软膏、粉末、贴片、润发油、溶液、泵喷雾、棒、小毛巾及它们的组合。一些实施方案涉及本文所述的局部组合物在制备具有降低或抑制蛋白羰基化活性的美容剂中的用途。一些其他实施方案涉及预防、改善或减少至少一种皮肤老化迹象的方法，其包括将上述任意组合物施用至皮肤，其中该组合物的施用量和持续时间足以预防、改善或减少所述至少一种皮肤老化迹象。代表性的老化迹象包括，但不限于，皮肤泛黄、褶、细纹、皱纹、鱼尾纹、黑眼圈、瑕疵、老人斑妊娠纹或它们的组合。实施例实施例1：在HepG2细胞中，通过(CTG)发光细胞存活力测试对黄柏酮进行细胞毒性/安全性评估为了确定黄柏酮的细胞安全性，进行了如下测试。根据制造商的说明书进行(CTG)发光细胞存活力测试(获自Promega)，以根据所存在的ATP(代谢活性细胞的指示剂)的定量来确定培 养基中的活细胞数。在该测试中使用的是具有相同梯度浓度(100、33.3、11.1、3.7、1.23、0.41、0.14、0.05、0.02(ug/mL))的99.99％纯的黄柏酮和氢醌(用作参照)。该测试是使用HepG2细胞进行的。通过CTG进行的基于细胞的安全性评估，黄柏酮显示无细胞毒性(参见表1)。表1.该结果如图1所示。实施例2：黄柏酮被证明在HepG2细胞中剂量依赖性降低蛋白羰基化为了确定黄柏酮是否影响蛋白羰基化，进行以下基于细胞的测试，该测试使用OxiSelectTMProteinCarbonylELISA试剂盒(CellBiology#STA-310)。HepG2细胞(ATCC)用于该测试。将细胞以每孔100,000个细胞接种于板中并将该测试板(获自Costa的96孔板)在37℃，5％CO2的潮湿条件下孵育24小时。测试了0ug/mL、33ug/mL、100ug/mL和300ug/mL的黄柏酮。将0ug/mL、33ug/mL、100ug/mL和300ug/mL的维生素C(公知的蛋白羰基化抑制剂)在该测试中用作阳性抑制剂对照。根据板图(platemap)制备参照物和测试化合物溶液(200x)。将黄柏酮溶于MEM(最低基础培养基)中并将其加至如上所述的在处理前24小时被接种的HepG2细胞中。该测试化合物的最终浓度为1x(表2)。然后将该板在37℃，5％CO2的潮湿条件下培养72小时。表2.化合物处理参照物/化合物(200×)7μL/孔培养基133μL/孔共计140μL/孔反应体系参照物/化合物(10×)10μL/孔细胞体积90μL/孔总计100μL/孔在第3天，将培养基从细胞中除去。将孔用HBSS(汉克氏平衡盐溶液)洗涤两次。将100μM8-OH喹啉和100μMFeCl3加至孔中并将该板孵育1小时。然后将细胞用HBSS洗涤一次。洗涤步骤之后，将新鲜的培养基加到各孔中。然后将该板在37℃，5％CO2的潮湿条件下孵育72小时。第4天，将培养基从细胞中除去并将该细胞用HBSS洗涤两次。将100μLHBSS(含有混合剂(市售可得的蛋白酶抑制剂混合物片剂(Roche#04693124001))加至各孔中。然后将该板在-80℃放置30分钟，解冻并重复冷冻/解冻步骤至少3次。然后将细胞溶解液混合并测试25μL的细胞溶解产物以确定蛋白质浓度。表3显示BCA试剂盒的制备，从而在第4天确定蛋白质浓度。表3.试剂A0.2ml试剂B9.8ml总计10.0ml然后调整蛋白质浓度。接着将100μL样品(使用经诱导的BSA稀释液)加至该96孔蛋白结合板并在4℃孵育过夜。在第5天，进行ELISA测试。将孔用250μL1XPBS(磷酸盐缓冲盐水)/孔洗涤3次。然后将过量的洗液从各孔中除去。将100μLDNPH(二硝基苯基肼)操作溶液加至各孔(表4)并将板在室温避光培养45分钟。表4.然后将孔用250μL1XPBS/乙醇(1:1)洗涤5次，在定轨摇床上孵育5分钟(表5)。表5.然后将该孔用250μL1XPBS洗涤2次。将200μL阻断液加至各孔(表6)并在将该板室温在定轨摇床上孵育1-2小时。表6.然后将该孔用250μL1X洗涤缓冲液洗涤3次(表7)，每次洗涤之间进行彻底抽吸。表7.接下来，将100μL抗-DNP(抗-二硝基苯基肼)抗体加入各孔(表8)并将该板在室温在定轨摇床上孵育1小时。表8.接下来，将条形孔洗涤3次(1*洗涤缓冲液)。将100μL与次级抗体结合的稀HRP加至所有孔并将该板在室温在定轨摇床上孵育1小时。参见表9。表9.接下来，将该条形孔洗涤5次(1*洗涤缓冲液)。将底物溶液温热至室温 并将100μL该底物溶液加至各孔。然后将该条形孔孵育15分钟。通过将100μL终止液加至各孔来使该酶反应终止。一旦颜色随着时间减退，立即读取结果。结果如表10和图2中所示。表10.黄柏酮的平均蛋白羰基化抑制率为1.6％、23.6％、37.75％、39.15％；维生素C的羰基化抑制率为-3.05％、31.05％、55.35％和62.65％。这表明，在HepG2细胞中，相比于已知的阳性对照维生素C而言，黄柏酮具有极好的抑制蛋白羰基化的效力。这还表明了可使用含有黄柏酮的产品来提亮皮肤和抗老化。因此，前述详尽的描述应被认为是说明性的而非限制性的，且应理解，所附权利要求，包括所有等效内容，均旨在限定本发明的主旨和范围。当前第1页1 2 3