一种抗皮肤光老化制剂及其应用的制作方法

一种抗皮肤光老化制剂及其应用的制作方法
【专利摘要】本申请公开了一种含有王浆酸（10-HDA）的抗皮肤光老化制剂，同时，还公开了10-HDA在制备护肤品、化妆品和药妆品中的应用。本申请提供的抗光老化制剂，能够明显提高UVA照射后的细胞的活性，抑制UVA诱导产生ROS，抑制UVA诱导的细胞衰老，具有显著的抗光老化的作用。其作用机制的研究显示，本申请抗光老化制剂中含有的10-HDA能够抑制p-JNK和p38?MAPK信号通路的活化，减少UVA诱导的MMP-1和MMP-3的表达，从而增加细胞中的胶原蛋白含量，是一种有效的抗皮肤光老化的制剂。
【专利说明】一种抗皮肤光老化制剂及其应用
【技术领域】
[0001]本申请涉及抗皮肤衰老制剂领域,特别是涉及王衆酸在抗皮肤光老化制剂,如抗光老化护肤品、化妆品、药妆品中的应用。
【背景技术】[0002]皮肤老化主要包括内源性老化和外源性老化。外源性老化是指皮肤受环境因素影响而引起的衰老变化，因以紫外线(Ultraviolet, UV)福射的影响为主，故又称为光老化。长波紫外线(UVA)和中波紫外线(UVB)均可造成光老化。由于UVB对皮肤的灼伤作用较UVA强1000倍，长期以来UVB—直被认为是导致光老化的主要光谱。然而，最近的研究表明UVA才是引起皮肤光老化的主要光谱。
[0003]皮肤光老化的主要临床表现是皮肤皱纹、粗糙、干燥、松弛、毛细血管扩张、脆性增加和色素沉着。长期日光照射可影响皮肤的多种细胞成分和组织结构改变，其中最具特征性的变化是真皮细胞外基质成分的改变。真皮细胞外基质包括胶原纤维、弹力纤维、氨基多糖和蛋白多糖等，其中I型胶原蛋白是其主要结构蛋白。在光老化皮肤，I型与III型胶原纤维减少、紊乱，弹性纤维变性、变粗，聚集成块，氨基多糖裂解，导致皮肤松弛、皱纹的发生。
[0004]皮肤光老化的发生机制尚未完全明了，但是基质金属蛋白酶(Matrixmetalloproteinases,MMPs)表达增高或活性增强是胶原纤维等基质成分降解的重要机制。MMPs是一组含锌蛋白酶家族，由MMP-1、MMP-2、MMP-3等25名成员组成。根据其底物特异性以及它们分泌后是可溶性蛋白还是细胞膜结合蛋白将其分为胶原酶类、明胶酶类、基质溶素和膜型MMPs。在正常人体皮肤表达的19种MMPs中，只有三种对UV照射做出反应而被显著诱导，即MMP-1、MMP_3和MMP-9。UV照射24小时后，MMP-1和MMP-3 mRNA水平显著增高，而MMP-9 mRNA水平仅有适度增高。
[0005]UV照射诱导的MMPs在皮肤光老化真皮细胞外基质成分的降解过程中发挥着重要的作用。紫外线照射皮肤后可诱导角质形成细胞和成纤维细胞分泌多种基质金属蛋白酶酶原，并通过调节酶原的活化及基质金属蛋白酶抑制剂的表达使其转化成有活性的MMPs。活化的MMPs可以降解几乎所有的真皮细胞外基质成分，引起皮肤松弛、皱纹形成等皮肤光老化改变。
[0006]不同类型的MMP降解不同的真皮基质蛋白。例如，MMP-1降解1、11和III型胶原蛋白，MMP-9降解IV、V胶原蛋白和明胶，而MMP-3则有更广泛的底物特异性，它可以降解多种类型的胶原蛋白以及基质分子，如蛋白多糖、层粘连蛋白和纤维连接蛋白。对于胶原蛋白，尤其是I型和III型胶原蛋白，首先由MMP-1启动胶原纤维断裂，然后被升高的MMP-3和MMP-9进一步降解。因此，长期的UV照射会导致MMPs产生过量，继而降解胶原蛋白等细胞外基质成分，引起皮肤松弛、皱纹形成等皮肤光老化改变。
[0007]在人皮肤，UV可诱导表皮的角质形成细胞和真皮的成纤维细胞表达MMPs，其中角质形成细胞是MMPs的主要细胞来源。UV照射诱导MMPs基因表达涉及复杂的细胞信号通路，其中最重要的就是MAPK和NF- K B信号通路，前者与转录因子AP-1的活化有关，后者与转录因子NF-κ B的活化有关。活化的AP-1和NF-κ B可分别与多种MMPs启动子的AP-1和NF- K B位点结合而诱导MMPs的表达。已经证实，UV激活的AP-1刺激角质形成细胞和成纤维细胞MMP-1和MMP-3的转录。由于MMP-1和MMP-3两者启动子具有相似的结构，UVB照射后活化的AP-1分别与MMP-1和MMP-3启动子的AP-1位点结合导致MMP-1和MMP-3的转录。UV照射引起的活性氧(Reactive oxygen species, ROS)的产生被认为是激活上述两条信号通路的一个始动环节。[0008]综上所述，UV照射可通过激活复杂的信号通路诱导MMPs的活化，进而降解真皮细胞外基质成分导致皮肤光老化，因此阻断这些信号通路的始动环节或者关键环节便能抑制MMPs活化达到抗光老化的作用。近年来，MMPs被认为是一个有前景的抗光老化治疗靶点。研发有效的MMPs抑制剂已经成为一个重要的研究热点。到目前为止，已经有大量来自于天然生物的MMPs抑制剂被研究开发。它们分别以R0S、MAPK通路、NF- κ B通路或多个环节为靶点达到抗光老化的作用。以ROS为靶点的MMPs抑制剂如白绒水龙骨叶提取物、叶黄素、小珊瑚藻等。这些物质可通过清除ROS而抑制MMPs的表达。以MAPK通路为靶点的MMPs抑制剂如岩藻依聚糖、反式玉米素等可通过阻断UV介导的MAPK通路以抑制MMPs的表达。以NF- κ B通路为靶点的MMPs抑制剂如虫草素、木兰醇等可通过抑制UV介导的NF- κ B通路抑制MMPs的表达。
[0009]王衆酸(化学名:10_羟基 _2_ 癸烯酸，10-hydroxy-2-decenoic acid, 10-HDA)是工蜂的舌腺、上颚腺等腺体分泌的一种天然物质，是蜂王浆中特有的一种不饱和脂肪酸。由德国科学家D.J.郎格在1921年首次发现。自那以后，关于王浆酸的研究被陆续报道，揭示王浆酸具有医疗保健效果，在急性辐射损伤方面具有显著疗效。但是，抗急性辐射和抗光老化是完全不同的概念，两者的作用机制也完全不同，因此，目前在王浆酸的抗光老化方面尚未有相关的研究报道。

【发明内容】

[0010]本申请的目的是提供一种新的抗皮肤光老化制剂，以及10-HDA在制备抗光老化护肤品、抗光老化化妆品、抗光老化药妆品中的应用。
[0011]为了实现上述目的，本申请采用了以下技术方案:
[0012]本申请公开了一种抗皮肤光老化制剂，其抗光老化的主要活性物质包括王浆酸。需要说明的是，本领域技术人员可以理解，该抗皮肤光老化制剂中还含有其它药学上可以接受的载体、溶剂，或者还可含有护肤、美肤的常用添加剂等。
[0013]进一步的，上述抗光老化制剂中10-HDA的含量为0.5-1.5mmol/L。
[0014]本申请还公开了上述抗皮肤光老化制剂在抗光老化护肤品、抗光老化化妆品或抗光老化药妆品中的应用。
[0015]具体的，本申请公开了一种抗光老化护肤品，其抗光老化的主要活性物质包括王浆酸。
[0016]进一步的，上述护肤品中王浆酸的含量为0.5-1.5mmol/L。
[0017]具体的，本申请还公开了一种抗光老化化妆品，其抗光老化的主要活性物质包括
王浆酸。[0018]进一步的，上述化妆品中王浆酸的含量为0.5-1.5mmol/L。
[0019]具体的，本申请还公开了一种抗光老化药妆品，其抗光老化的主要活性物质包括
王浆酸。
[0020]进一步的，上述药妆品中王浆酸的含量为0.5-1.5mmol/L。
[0021]由于采用以上技术方案，本申请的有益效果在于:
[0022]本申请提供了一种新的抗光老化制剂，其中含有10-HDA。实验结果表明，10-HDA可明显提高UVA照射后的细胞的活性，抑制UVA诱导产生R0S，抑制UVA诱导的细胞衰老，具有显著的抗光老化的作用。研究显示，本申请的抗光老化制剂中含有的10-HDA能够抑制P-JNK和p38 MAPK信号通路的活化，减少UVA诱导的MMP-1和MMP-3的表达，从而增加细胞中的胶原蛋白含量，是一种有效的抗皮肤光老化的制剂。
【专利附图】

【附图说明】
[0023]图1是本申请实施例中王浆酸对经过UVA照射后的细胞的活力测定结果；
[0024]图2是本申请实施例中王浆酸对活性氧的影响结果；
[0025]图3是本申请实施例中王浆酸的抗光老化效果检测；
[0026]图4是本申请实施例中王浆酸对胶原蛋白的影响结果；
[0027]图5是本申请实施例中 荧光定量PCR检测的王浆酸对MMP-1的mRNA表达的影响
结果;
[0028]图6是本申请实施例中荧光定量PCR检测的王浆酸对MMP-3的mRNA表达的影响
结果;
[0029]图7是本申请实施例中蛋白质免疫印迹检测的王浆酸对MMP-1蛋白的影响结果；
[0030]图8是本申请实施例中蛋白质免疫印迹检测的王浆酸对MMP-3蛋白的影响结果；
[0031]图9是本申请实施例中蛋白质免疫印迹检测的王浆酸对JNK蛋白的影响结果；
[0032]图10是本申请实施例中蛋白质免疫印迹检测的王浆酸对p38蛋白的影响结果。
【具体实施方式】
[0033]本申请的发明人通过一系列的实验证实了 10-HDA能够抑制UVA诱导的细胞毒性以及ROS的产生、抑制UVA诱导的成纤维细胞衰老、抑制p-JNK和p38MAPK信号通路的活化、减少UVA诱导的MMP-1和MMP-3的表达，增加细胞上清液中的胶原蛋白含量。
[0034]在上述研究的基础上，本申请的发明人提供了一种含有10-HDA的新的抗皮肤光老化制剂。该抗皮肤光老化制剂将10-HDA添加到医学上可接受的溶剂载体(如液体石蜡等)中制备而成，以用于皮肤的抗光老化。
[0035]进一步的，本领域技术人员可以理解，鉴于10-HDA的抗光老化作用，能够很容易的将10-HDA或上述的抗皮肤光老化制剂添加到护肤品、药妆品或其它化妆品中，以制备出含10-HDA的具有抗光老化作用的护肤品、药妆品或其它化妆品。
[0036]此外，10-HDA除了用于上述的护肤品、化妆品和药妆品以外，本领域技术人员可以理解，10-HDA还可以制作成其他药学上可以接受的制剂，以用于抗皮肤光老化的治疗或美容；或者10-HDA与其它适用于局部施用到皮肤上的载体制备成具有抗光老化作用的组合物。[0037]下面通过具体实施例并结合附图对本申请作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。
[0038]实施例一王浆酸(10-HDA)的抗光老化作用
[0039]( I)人皮肤成纤维细胞培养
[0040]实验方法:取儿童包皮环切术后的包皮组织，分离获得纯化的人成纤维细胞，将细胞培养于含10%的特级胎牛血清(FBS)和青链霉素的DMEM培养液中，置于含5% CO2的37 °C培养箱中培养。
[0041](2) UVA 照射
[0042]实验方法:当成纤维细胞长满至80%~90%汇合时予以UVA照射。将细胞从培养箱取出，吸弃培养基，用37°C预热的磷酸盐缓冲液(PBS)洗2次。每孔加入等量的薄层PBS，然后用不同剂量的UVA照射。照射后立即吸弃PBS溶液，加入新鲜配制的正常培养液，置于95%的湿度、5% CO2的37 °C培养箱中培养。本例中正常培养液即含10%的特级胎牛血清(FBS)和青链霉素的DMEM培养液。
[0043](3)细胞活力测定
[0044]实验方法:为了检 测10-HDA是否可以抑制UVA诱导的细胞毒性，本例用CCK-8试剂(Dojindo，日本)测定细胞活力。实验分成3组:空白对照组、UVA照射组和10-HDA组，每组设3个复孔。空白对照组:正常培养液培养；UVA照射组:用4J/cm2 UVA照射，照射后换正常培养液培养；10-HDA组:用4J/cm2UVA照射，照射后用含lmmol/L 10-HDA的培养液培养。将成纤维细胞按5 X IO3细胞/孔密度接种于96孔培养板中，每孔添加100 μ I培养液，接种24h后UVA照射组和10-HDA细胞分别给予4J/cm2 UVA照射，照射后，各组细胞按照上述条件加入含或不含10-HDA的培养液，分别选取培养24h、48h后进行测试。测试时在每孔中加入10 μ I的CCK-8试剂，在酶联免疫检测仪上测定450nm吸光度。实验重复三次。
[0045]结果:如图1所示，其中A为空白对照组结果，B为UVA照射组结果，C为10-HDA组结果，其中设定空白对照组的吸光度表示100%的细胞活性，B、C各组的吸光度与A组的吸光度比值表示各组的细胞相对活性；其中白色柱表示培养24h后的检测结果，黑色柱表示培养48h后的检测结果。与空白对照组相比，UVA照射组的细胞活力下降，提示UVA照射对细胞产生毒性，而用10-HDA处理的细胞其活力较高，提示10-HDA可以抑制UVA诱导的细胞毒性。10-HDA处理48h后，10-HDA组的细胞活性明显增高，与UVA照射组相比差异有统计学意义(P < 0.05)。
[0046](4)活性氧(ROS)水平测定
[0047]实验方法:实验分成3组:空白对照组、UVA照射组和10-HDA组。空白对照组:正常培养液培养；UVA照射组:用4J/cm2 UVA照射，照射前用正常培养液培养；10-HDA组:细分为3个浓度组，UVA照射前分别加入不同浓度的10-HDA (0.5mmol/L、lmmol/L、1.5mmol/L)作用24h，再用4J/cm2 UVA照射。将细胞接种于12孔板中，培养24h后换液，10-HDA组添加含10-HDA的培养液，空白对照组和UVA照射组则用正常培养液培养。培养24h后予以4J/cm2 UVA照射，照射完立即加入Iml含10 μ mol/L H2DCFDA荧光探针的溶液(用预热的PBS溶液新鲜配制)，37°C避光孵育30min，孵育完加入Iml预热的PBS溶液洗2次以去除残留的H2DCFDA,加入不含酚红的0.25%的胰酶37°C消化3min，显微镜下观察到细胞回缩、脱落时，立即加入含10% FBS但不含酚红的DMEM培养液终止消化，将细胞悬液转移至不透明的96孔培养板中，在荧光酶标仪检测荧光强度，激发波长为490nm，发射波长为510_570nm。
[0048]结果:如图2所示，其中A为空白对照组、B为UVA照射组、C、D、E分别为10-HDA组中0.5mmol/L、lmmol/L、l.5mmol/L浓度的10-HDA。UVA照射组细胞内的ROS水平是空白对照组的1.4倍左右，两者比较差异有高度统计学意义(P〈0.01)，提示UVA照射可以诱导成纤维细胞内产生R0S。用0.5mmol/L-l.5mmol/L的10-HDA处理后细胞内的ROS水平可呈剂量依赖性下降，与UVA照射组相比差异具有统计学意义(P〈0.05)，提示10-HDA处理细胞后可以抑制UVA诱导的ROS。
[0049](5)细胞衰老β -半乳糖苷酶(SA- β -gal)染色
[0050]实验方法:实验分成3组:空白对照组、UVA照射组和10-HDA组。空白对照组:正常培养液培养；UVA照射组:用4J/cm2 UVA照射，照射后换正常培养液培养；10_HDA组:细分为3个浓度组，用4J/cm2 UVA照射，照射后分别加入不同浓度的10_HDA(0.5mmol/L、ImmoI/L、1.5mm0l/L)。将细胞接种于12孔板中，培养24h，予以4J/cm2 UVA照射，照射后采用含10-HDA或不含10-HDA的培养液培养24h后进行SA-β -gal染色。染色步骤如下:吸弃培养基，PBS溶液洗I次，加入500 μ I预配好的固定液室温固定15min。固定后用Iml的PBS溶液洗2次，然后加入500 μ I预配好的染液，37°C孵育24-36h。β -半乳糖苷酶染色阳性细胞率计算方法:每组在200Χ镜下连续选取四个视野，阳性细胞为蓝色，即衰老细胞，阳性细胞率=阳性细胞数/细胞总数X 100%。
[0051]结果:如图3所示，其中A为空白对照组、B为UVA照射组、C、D、E分别为10-HDA组中0.5mmol/L、lmmol/L、l.5mmol/L浓度的10-HDA。与空白对照组相比，UVA照射组SA- β -gal染色阳性细胞明显增加，差异有高度统计学意义(P〈0.01 )，提示UVA照射可以诱导成纤维细胞衰老。从图中可以看出，细胞用0.5mmol/L 10-HDA处理后SA-β-gal染色阳性细胞与UVA照射组相比有下降，统计分析显示，lmmol/L 10-HDA处理后SA-β -gal染色阳性细胞与UVA照射组相比下降具有统计学意义，1.5mmol/L 10-HDA处理后SA-β -gal染色阳性细胞与UVA照射组相比下降显著。细胞用(0.5-1.5mmoI/DlO-HDA处理后细胞衰老的数量呈剂量依赖性下降，提示10-HDA处理细胞后可以抑制UVA诱导的细胞衰老。
[0052](6)胶原蛋白含量测定
[0053]实验方法:实验分成两大组，第一大组无UVA照射，第二大组给予UVA照射。每一大组均细分为2组:对照组和10-HDA组。对照组:正常培养液培养；10-HDA组:培养液中含lmmol/L 10-HDA。将成纤维细胞接种于6孔板中，培养24h后第二大组用4J/cm2 UVA照射，照射后改用含或不含10-HDA的新鲜培养基继续培养48h后检测上清液的胶原蛋白含量。第一大组除了不用UVA照射，其他操作同第二大组。胶原蛋白含量测定的详细步骤如下:收取细胞上清液，低速离心(500g,5min) I次,再高速离心(12000rpm, IOmin) I次以去除杂质。取800 μ I离心后的上清液转移至低蛋白粘附的离心管中，加入160 μ I的胶原蛋白分离和浓缩试剂，将离心管放入含冰水混合物的容器中，4°C孵育过夜。孵育后小心取出并离心(12000rpm, IOmin),小心吸弃上清液，加入800 μ I Sircol染液,镟润振荡混匀，在摇床上室温轻轻摇晃30min,离心(12000rpm, IOmin),小心吸弃上清液,加入250 μ I的碱试剂，漩涡振荡混匀，混匀后取200 μ I混合液至96孔酶标板中，在酶联免疫检测仪上测定570nm吸光度。每组设两个复孔，实验重复三次。
[0054]结果:如图4所示，其中A对照组、B为10-HDA组，白色柱表示未经UVA照射，黑色柱表示经过UVA照射。采用Sircol胶原蛋白分析试剂盒检测细胞上清液中的可溶性胶原蛋白。细胞经UVA照射后加入含有IO-HDA的培养液孵育48h后测定。与空白对照组相比，细胞用lmmol/L IO-HDA处理后上清液中的胶原蛋白含量增加。与空白对照组相比，UVA照射组的胶原蛋白含量增加，提示UVA可以增加成纤维细胞培养液中的胶原蛋白含量。与UVA照射组相比，IO-HDA组上清液中的胶原蛋白含量增加。
[0055](7)荧光定量PCR
[0056]实验方法:采用荧光定量PCR检测基质金属蛋白酶-1 (MMP-1)和MMP-3mRNA的水平。实验分成两大组，第一大组无UVA照射，第二大组给予UVA照射。每一大组均细分为2组:对照组和10-HDA组。对照组:正常培养液培养；10-HDA组:培养液中含lmmol/L10-HDA。取第3-8代成纤维细胞按I X IO5细胞/孔的密度接种于6孔板中，每孔加2ml的培养液，培养24h后给予4J/cm2 UVA照射，照射24h后提取细胞总RNA及合成cDNA，然后采用两步法PCR反应程序进行荧光定量PCR反应。反应结束后确认荧光定量PCR的扩增曲线和融解曲线，以GAPDH为内参照基因，结果分析采用国际通用的2-Λ ACt方法。
[0057]细胞总RNA提取采用实验室常规的RNA提取方法，RNA存储于_80°C备用。以提取的细胞总cRNA为模板采用实验室常规方法合成cDNA，合成的cDNA存储于_20°C备用。
[0058]突光定量PCR 反应体系:2 XPremix Ex Taq? II 10.0 μ 1、10 μ M 上游引物0.8 μ 1、10 μ M下游引物0.8 μ 1、cDNA模板IOOng,补充灭菌去离子水至20 μ I。其中SYBR荧光染料为常规实时荧光PCR所使用的荧光染料，上游和下游引物参见表1。
[0059]反应条件，95°C预变性30sec，然后进入40个循环:95°C 5sec、60°C 20sec。反应完成后进行融解曲线分析。
[0060]表1荧光定量PCR扩增引物
基因名引物序列产物长度
~上游:V-CTCGCCACAACTGCCAAMG-y
MMP-1103 bn
下游:5f-CTGTCCCTGAACAGCCCAGTACTTA-yp
[0061]上游:5,-ATTCCATGGAGCCAGGCTTTC-:r
ΜΜΡ-3138 bn
下游:5'- CATTTGGGTCAAACTCCAACTGTG'VF
…—η 上游:5,-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC'V,…
GAPDH 下游:5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3'i38bp
[0062]结果:如图5和图6所示，图5是MMP-1的检测结果，图6是MMP-3的检测结果，其中，A为空白对照组，B为10-HDA组，白色柱表示未经过UVA照射，黑色柱表示经过UVA照射。荧光定量PCR结果显示，UVA照射组细胞内的MMP-1和MMP_3 mRNA水平分别是空白对照组的3.7倍和5.9倍，与空白对照组比较差异均有高度统计学意义(P〈0.01 )，提示UVA照射可以诱导成纤维细胞表达MMP-1和MMP-3 mRNA。与UVA照射组相比，细胞用10-HDA处理后细胞的MMP-1和MMP-3 mRNA水平下降，提示10-HDA处理细胞后可以抑制UVA诱导的MMP-1 和 MMP-3 mRNA 的表达。
[0063](8)蛋白质免疫印迹(Western blot):
[0064]实验方法:采用Western blot检测MMP-1、MMP-3、JNK和p38 MAPK蛋白的水平。实验分成两大组，第一大组无UVA照射，第二大组给予UVA照射。每一大组均细分为2组:对照组和10-HDA组。对照组:正常培养液培养；10-HDA组:培养液中含lmmol/L 10-HDA。取第3-8代成纤维细胞按I X IO5细胞/孔的密度接种于6孔板中，每孔加2ml的培养液，培养24h后给予4J/cm2 UVA照射。检测MMP-1和MMP-3蛋白水平时在UVA照射后培养24h提取细胞总蛋白，检测JNK和p38 MAPK蛋白水平时则在UVA照射后培养1.5h提取细胞总蛋白。每组收集等量的蛋白样品，将收集的蛋白样品上样到SDS-PAGE胶加样孔内，然后进行电泳、转膜、封闭以及孵育一抗(鼠抗人MMP-1抗体、鼠抗人MMP-3抗体、兔抗人P-JNK抗体、兔抗人t-JNK抗体、兔抗人p-p38 MAPK抗体和兔抗人t-p38 MAPK抗体)。孵育二抗后进行显色(辣根过氧化物酶标记的二抗)。显色后将胶片进行扫描，将扫描后的图片用凝胶图象处理系统ImageJ软件分析条带的密度，以内参基因β _actin作校正计算目的蛋白的相对表达量。
[0065]结果:如图7-10所示，图7为MMP-1的检测结果，图8为MMP-3的检测结果，图9为JNK的检测结果，图10为p38的检测结果，其中为I凝胶图像，II为定量分析柱图；A为对照组，B为10-HDA组，白色柱表示未经UVA照射，黑色柱表示经过UVA照射。与空白对照组相比，UVA照射组细胞内的MMP-1、MMP-3、p-JNK和p-p38 MAPK蛋白水平明显增加，提示UVA照射可以诱导成纤维细胞表达MMP-l、MMP-3、p-JNK和p-p38 MAPK蛋白的表达。UVA照射的细胞用10-HDA处理后MMP-1、MMP-3、p-JNK和p-p38 MAPK蛋白水平下降，提示10-HDA处理细胞后可以抑制UVA诱导的MMP-1、MMP-3、p-JNK和p-p38 MAPK蛋白的表达。
[0066]本例中，上述(3)至(8)的验证实验都重复至少3次；并采用SPSS13.0统计软件对实验中获得的各组数据进行方差分析，两组间比较再用方差分析中的LSD检验。实验数据以均数土标准差(means土SD)表不。
[0067]本例的上述(3)至(8)的实验结果表明，10-HDA可以抑制UVA诱导的细胞毒性、抑制UVA诱导的细胞衰老、抑制UVA诱导ROS的产生，并增加胶原蛋白含量，说明10-HDA具有抗光老化的作用，其机制与抑制JNK and p38 MAPK信号通路的活化而减少MMP-1和MMP-3表达有关。因此，10-HDA是一种有效的抗皮肤光老化物质。
[0068]实施例二含王浆酸(10- HDA)的抗光老化制剂
[0069]将10-HDA与硬脂酸、液体石蜡等乳化剂混合制成10-HDA乳液。选择24个健康成人，将含有10-HDA的乳液或空白对照(不含10-HDA)分别涂在右手臂内侧的两个地方，每天使用乳液三次，连续使用15天，在实验的开始用紫外线照射手臂，每隔三天照一次，共照二次，分别在照射后第1、3、5、7、10、15天观察局部红斑和色素沉着情况。
[0070]结果显示，在照射后第1、3、5、7天紫外线照射处皮肤均可见红斑，10-HDA乳液涂抹处的红斑面积和颜色均较空白对照涂抹处轻。在照射后第10、15天紫外线照射处均可见褐色的色素沉着，10-HDA乳液涂抹处的色素沉着面积和颜色均较空白对照涂抹处轻。因此10-HDA乳液可以减轻紫外线照射皮肤后引起的红斑和色素沉着。可见，长期使用含10-HDA这一成分的化妆品后可以改善皮肤光老化的临床症状，起到淡化皱纹，减少色素沉着、毛细血管扩张，增加皮肤弹性，使皮肤更加紧致、细腻，并可预防脂溢性角化病、光线性肉芽肿、日光性角化病、恶性黑色素瘤、基底细胞癌和鳞状细胞癌等皮肤病的发生。
[0071]需要说明的是，本领域技术人员可以理解，鉴于10-HDA的抗皮肤光老化作用，本领域技术人员能够很容易的将10-HDA添加到护肤品、药妆品或其它化妆品中，以制备出含10-HDA的具有抗光老化作用的护肤品、药妆品或其它化妆品。
[0072]本例中将10-HDA制成乳液，具有良好的抗光老化效果。本领域技术人员可以理解，上述溶剂、载体、或IO-HDA的剂型并不构成对本申请的限制；在不脱离本申请的基本构思的情况下还可以制备出若干的含10-HDA的组合物，只要该组合物被用于抗皮肤光老化的美容或治疗中均在本申请的保护范围内。
[0073]以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属【技术领域】的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前 提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本申请的保护范围。
【权利要求】
1.一种抗皮肤光老化制剂，其特征在于:含有王浆酸。
2.根据权利要求1所述的抗皮肤光老化制剂，其特征在于:所述王浆酸的含量为0.5-1.5mmol/L。
3.根据权利要求1或2所述的抗皮肤光老化制剂在抗光老化护肤品、抗光老化化妆品或抗光老化药妆品中的应用。
4.一种抗光老化护肤品，其特征在于:含有王浆酸。
5.根据权利要求4所述的抗光老化护肤品，其特征在于:所述王浆酸的含量为0.5-1.5mmol/L。
6.一种抗光老化化妆品，其特征在于:含有王浆酸。
7.根据权利要求6所述的抗光老化化妆品，其特征在于:所述王浆酸的含量为0.5-1.5mmol/L。
8.一种抗光老化药妆品，其特征在于:含有王浆酸。
9.根据权利要求8所述的抗光老化药妆品，其特征在于:所述王浆酸的含量为`0.5-1.5mmol/L。`
【文档编号】A61K8/365GK103505374SQ201210206686
【公开日】2014年1月15日 申请日期:2012年6月20日 优先权日:2012年6月20日
【发明者】郑锦芬 申请人:郑锦芬, 陆春, 深圳市神蜂科技开发有限公司