本发明涉及医药领域，具体涉及一种具有抗氧化活性的裸花紫珠提取物。
背景技术：
裸花紫珠(Callicarpa nudiflora Hook.et Arn.)为马鞭草科紫珠属植物，产自我国海南、广西、广东，印度、越南、马来西亚等地也有分布，其根、叶可入药，具有收敛止血、消炎解毒等功效。现有文献报道的裸花紫珠的药理活性部位多为醇提物和水提物，活性主要包括止血、抗炎、增强免疫、细胞毒活性和抗菌五个方面。然而裸花紫珠不同部位和不同化学成分的功效差异明显，目前裸花紫珠成分抗氧化活性研究还比较少，如《七种紫珠属植物水提物中总黄酮、总酚酸及其抗氧化活性的测定》(广西植物，2012年32(6)：845-848)、《5种紫珠属药材中总酚、总黄酮与其抗氧化活性的相关性研究》(中国实验方剂学杂志，2013年19(20)：55-60)都公开了紫珠属黄酮类和酚酸类是抗氧化作用的主要物质，《从裸花紫珠中分离得到3种具有抗氧化活性的呋喃木质素》(国际中医中药杂志2015年02期：164-164)公开了三种具有抗氧化活性的化合物，但是前两篇文献所用样品是紫珠属植物的粗提物，后一篇文献所用样品分离出来的单个化合物，这些现有技术对于裸花紫珠抗氧化作用的药效物质基础的研究来说尚未浅显，而且获得较高抗氧化活性的有效部位并开发成终端产品具有非常重要的意义。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种具有抗氧化活性的裸花紫珠提取物。本发明的目的通过以下技术方案实现：
一种具有抗氧化作用的裸花紫珠提取物，由以下步骤制备：
(1)取裸花紫珠药材，粉碎成粗粉，加入80-95％乙醇加热回流提取1-3次，得提取液；
(2)提取液过滤，所得滤液加入石油醚或乙酸乙酯任意一种萃取或者分别用石油醚、乙酸乙酯萃取，分离，收集水溶性部分，浓缩干燥，即得。
进一步的，上述裸花紫珠提取物，由以下步骤制备：
(1)取裸花紫珠药材，粉碎成粗粉，加入90-95％乙醇加热回流提取1-3次，得提取液，滤过，回收乙醇浓缩成浸膏；
(2)步骤(1)所得浸膏均匀分散于水中，加入石油醚、乙酸乙酯任意一种萃取或者分 别用石油醚、乙酸乙酯萃取，分离，收集水溶性部分，浓缩干燥，即得。
更进一步的，上述裸花紫珠提取物，由以下步骤制备：
(1)取裸花紫珠药材，粉碎成粗粉，加入95％乙醇加热回流提取3次，得提取液，滤过，回收乙醇浓缩成浸膏；
(2)步骤(1)所得浸膏均匀分散于水中，加入石油醚或乙酸乙酯萃取，分离，收集水溶性部分，浓缩干燥，即得。
在上述方案的基础上，进一步优化的裸花紫珠提取物的制备步骤为：
(1)取裸花紫珠药材，粉碎成粗粉，加入90-95％乙醇加热回流提取1-3次，得提取液，滤过，回收乙醇浓缩成浸膏；
(2)步骤(1)所得浸膏均匀分散于水中，分别用石油醚、乙酸乙酯萃取，分离后收集水溶性部分，浓缩干燥。
进一步的，上述裸花紫珠提取物，由以下步骤制备：
(1)取裸花紫珠药材，粉碎成粗粉，加入95％乙醇加热回流提取3次，得提取液，滤过，回收乙醇浓缩成浸膏；
(2)步骤(1)所得浸膏均匀分散于水中，分别用石油醚、乙酸乙酯萃取，分离后收集水溶性部分，浓缩干燥。
作为方案优选方式，本发明中所述步骤(1)裸花紫珠浸膏的制备方法为：取裸花紫珠药材，粉碎成粗粉，加入90-95％乙醇加热回流提取1-3次，提取液滤过，合并，滤液浓縮至相对密度1.04－1.06的清膏(60℃)，加入浓缩液总重4％－6％的1％的壳聚糖醋酸溶液，搅匀，冷却，静置16－24小时，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.06～1.10(60℃)的清膏，加入DM-130树脂，静态吸附20-24h，滤过，滤液浓缩成浸膏。其中1％壳聚糖醋酸溶液的配制：取1g壳聚糖溶于100ml纯化水中，加入冰醋酸配制成含1％醋酸浓度的壳聚糖溶液，静置，备用。
本发明中所述浸膏为相对密度1.25－1.35(60℃)的稠膏。
为了更好的理解本发明，将通过以下实验说明本发明的技术效果。
(1)裸花紫珠提取物和裸花紫珠单体化合物的制备
裸花紫珠药材10kg，粉碎成粗粉，用95％乙醇加热回流提取3次，提取液过滤后减压浓缩成浸膏得裸花紫珠醇提物(2.6kg)，浸膏均匀分散于水中，分别用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，得到石油醚部位(166g)、乙酸乙酯部位(560g)、正丁醇部位(240g)和剩余的水溶性部位组分(1660g)。
裸花紫珠单体化合物：石油醚部位经MCI、反复硅胶柱层析及重结晶等方法分离得到化 合物1(5-羟基-3,7,3',4'-四甲氧基黄酮，125mg)和化合物2(5,4'-二羟基-3,7,3'-三甲氧基黄酮，360mg)。乙酸乙酯部位经MCI、正相硅胶、C18柱层析等方法分离得到化合物3(木犀草素，120mg)。正丁醇部位经MCI、正相硅胶、C18柱层析和HPLC制备分离得到化合物4(木犀草素-4'-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，42mg)、化合物5(木犀草素-3'-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，10mg)、化合物6(木犀草苷，135mg)、和化合物7(毛蕊花糖苷，240mg)。所有化合物均通过NMR、MS和文献对照等进行结构鉴定。
(2)抗氧化能力测定
DPPH·溶液配制：精密称取DPPH·19.716mg，无水乙醇溶解并定容至500mL容量瓶中，摇匀即得0.1mmol/L的储备液。
提取物测试液配制及加样：分别精密称取一定量的裸花紫珠醇提物和4个部位萃取物，无水乙醇溶解完全并定容至容量瓶中，摇匀即得一定浓度的提取物测试液。按表1的体系进行加样：以梯度方式吸取的提取物测试液，加蒸馏水至2mL，每份测试液做一个平行，分别加入0.1mmol/L DPPH·溶液2mL，摇匀，37℃避光水浴30min后于517nm处测定吸光度值。
单体测试液配制及加样：分别精密称取一定量的裸花紫珠7个主要成分，精密移液枪加入无水乙醇，超声溶解，配成一定浓度的单体测试液。按表2的体系进行加样：以梯度方式吸取的单体测试液，加无水乙醇至500μL，再分别加入0.1mmol/L DPPH·溶液500μL，摇匀，37℃避光水浴30min后于517nm处测定吸光度值。
表1裸花紫珠提取物清除DPPH·实验反应体系
表2裸花紫珠单体清除DPPH·实验反应体系
DPPH自由基清除率(％)＝[A0-(As-Ac)]/A0×100％，再以样品各浓度为横坐标，相应的清除率为纵坐标，作回归曲线，并计算出半数清除浓度(IC50值)。
公式中，A0—蒸馏水+DPPH溶液的吸光度值
As—样品溶液+DPPH溶液的吸光度值
Ac—样品溶液+无水乙醇的吸光度值
(3)裸花紫珠提取物的抗氧化活性
以抗坏血酸(Vc)作为阳性对照，对裸花紫珠醇提物及其4个不同萃取部位进行抗氧化活性测定，结果见表3。醇提物和4个部位均显示出不同程度的抗氧化活性，且在所设浓度范围内，呈现出浓度依赖性(相关系数在0.9900以上)。4个部位的抗氧化能力随着极性变大逐渐增强：石油醚部位＜乙酸乙酯部位＜正丁醇部位＜水部位，醇提物的抗氧化能力介于石油醚部位和乙酸乙酯部位之间。
表3裸花紫珠提取物抗氧化能力
(4)裸花紫珠单体的抗氧化活性
以抗坏血酸(Vc)作为阳性对照，对裸花紫珠7个单体进行抗氧化活性测定，结果见表4。7个单体均显示出不同程度的抗氧化活性，并且在所设浓度范围内，呈现出浓度依赖性。在7个单体中，从正丁醇部位分离得到的毛蕊花糖苷(7)、木犀草苷(6)和从乙酸乙酯部位分离得到的木犀草素(3)具有明显的抗氧化活性，抗氧化能力分别是阳性对照Vc的3倍、2.3倍和1.5倍；从正丁醇部位分离得到的木犀草素-4'-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(4)、木犀草素-3'-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(5)具有一定的抗氧化能力；从石油醚部位分离得到的5-羟基-3,7,3',4'-四甲氧基黄酮(1)和5,4'-二羟基-3,7,3'-三甲氧基黄酮(2)抗氧化能力则很弱。
表4裸花紫珠单体抗氧化能力
裸花紫珠的化学成分有黄酮及苷类、三萜及苷类、二萜、苯乙醇苷类、酚酸类、甾体类、鞣质、挥发油等，目前已从中分离得到100余个化合物。裸花紫珠醇提物及其4个萃取部位均显示出了不同程度的抗氧化活性，其中水部位活性最强，这与其含有鞣质、皂苷等大极性成分有关，而其它部位的抗氧化活性与各自含有的主要成分的活性相对应，表明裸花紫珠中的抗氧化成分为鞣质类、酚酸类、黄酮类等多羟基化合物。通过对单体化合物与不同活性部位的比较，表明裸花紫珠的抗氧化作用是多成分协同作用的结果。通过试验对比研究，以石油醚和/或乙酸乙酯萃取后，分离获得的水部位的抗氧化活性较强。在后期进一步的研究中，对通过特定工艺所获得的裸花紫珠提取物再进行萃取分离后，其抗氧化活性显著提升，使用壳聚糖醋酸溶液和DM-130树脂通过吸附、聚合、沉淀、分离等方式，将裸花紫珠粗提物中粘液质、多糖、色素等非活性成分和可能对抗氧化作用起拮抗作用的成分除去，进一步富集和纯化活性成分，提高单位提取物的生物活性，为后续新产品的研究和开发奠定物质基础。
本发明的有益效果：(1)获得抗氧化活性较强的活性部位；(2)制备方法操作简便。
具体实施方式
实施例1
取裸花紫珠药材10kg，粉碎成粗粉，加入95％乙醇加热回流提取1次，得提取液，滤过，回收乙醇缩成浸膏(相对密度1.30－1.35，60℃)；浸膏均匀分散于水中，加入石油醚萃取，分离，收集水溶性部分，浓缩干燥，即得。
实施例2
取裸花紫珠药材10kg，粉碎成粗粉，加入90％乙醇加热回流提取2次，合并提取液，过滤后所得滤液加入石油醚萃取，分离，收集水溶性部分，浓缩干燥，即得。
实施例3
取裸花紫珠药材10kg，粉碎成粗粉，加入80％乙醇加热回流提取3次，合并提取液，滤过，所得滤液加入石油醚萃取，分离，收集水溶性部分，浓缩干燥，即得。
实施例4
取裸花紫珠药材10kg，粉碎成粗粉，加入90％乙醇加热回流提取3次，合并提取液，滤过，回收乙醇缩成浸膏(相对密度1.30－1.35，60℃)；浸膏均匀分散于水中，加入乙酸乙酯萃取，分离，收集水溶性部分，浓缩干燥，即得。
实施例5
取裸花紫珠药材10kg，粉碎成粗粉，加入95％乙醇加热回流提取1次，得提取液，过滤后所得滤液加入乙酸乙酯萃取，分离，收集水溶性部分，浓缩干燥，即得。
实施例6
取裸花紫珠药材10kg，粉碎成粗粉，加入90％乙醇加热回流提取2次，合并提取液，滤过，回收乙醇缩成浸膏(相对密度1.30－1.35，60℃)；浸膏均匀分散于水中，分别用石油醚、乙酸乙酯萃取，即用石油醚萃取、分离，收集水溶性部分A，再用乙酸乙酯萃取水溶性部分A，分离，收集水溶性部分B，浓缩干燥，即得。
实施例7
取裸花紫珠药材10kg，粉碎成粗粉，加入95％乙醇加热回流提取1次，得提取液，滤过，回收乙醇缩成浸膏(相对密度1.25－1.30，60℃)；浸膏均匀分散于水中，分别用石油醚、乙酸乙酯萃取，即用石油醚萃取、分离，收集水溶性部分A，再用乙酸乙酯萃取水溶性部分A，分离，收集水溶性部分B，浓缩干燥，即得。
实施例8
取裸花紫珠药材10kg，粉碎成粗粉，加入90％乙醇加热回流提取2次，提取液滤过，合并，滤液浓縮至相对密度1.04－1.06(60℃)，加入浓缩液总重4％的1％的壳聚糖醋酸溶液，搅匀，冷却，静置20小时，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.06～1.10(60℃)的清膏，加入DM-130树脂，静态吸附24h，滤过，滤液浓缩至相对密度1.30－1.35(60℃)的浸膏；
所得浸膏，均匀分散于水中，分别用石油醚、乙酸乙酯萃取，即用石油醚萃取、分离，收集水溶性部分A，再用乙酸乙酯萃取水溶性部分A，分离，收集水溶性部分B，浓缩干燥，即得。
实施例9
取裸花紫珠药材10kg，粉碎成粗粉，加入95％乙醇加热回流提取3次，提取液滤过，合并，滤液浓縮至相对密度1.04－1.06(60℃)，加入浓缩液总重6％的1％的壳聚糖醋酸溶液，搅匀，冷却，静置16小时，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.06～1.10(60℃)的清膏，加入DM-130树脂，静态吸附20h，滤过，滤液浓缩至相对密度1.30－1.35(60℃)的浸膏；所得浸膏均匀分散于水中，加入乙酸乙酯萃取，分离，收集水溶性部分，浓缩干燥，即得。
实施例10
取裸花紫珠药材10kg，粉碎成粗粉，加入95％乙醇加热回流提取3次，提取液滤过，合并，滤液浓縮至相对密度1.04－1.06(60℃)，加入浓缩液总重6％的1％的壳聚糖醋酸溶液，搅匀，冷却，静置16小时，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.06～1.10(60℃)的清膏，加入DM-130树脂，静态吸附20h，滤过，滤液浓缩至相对密度1.30－1.35(60℃)的浸膏；所得浸膏均匀分散于水中，加入石油醚萃取，分离，收集水溶性部分，浓缩干燥，即得。
同上述发明内容中裸花紫珠提取物抗氧化能力测定的实验方法，实施例1-10的结果见下 表