本发明涉及医药领域，具体涉及一种具有抗炎活性的裸花紫珠提取物。
背景技术：
：裸花紫珠(CallicarpanudifloraHook.etArn.)为马鞭草科紫珠属植物，产自我国海南、广西、广东，印度、越南、马来西亚等地也有分布，其根、叶可入药，具有收敛止血、消炎解毒等功效。现有文献报道的裸花紫珠的药理活性部位多为醇提物和水提物，活性主要包括止血、抗炎、增强免疫、细胞毒活性和抗菌五个方面。然而裸花紫珠不同部位和不同化学成分的功效差异明显，目前对裸花紫珠成分抗炎活性研究还比较少，如《裸花紫珠抗炎作用及增强免疫功能的实验研究》(广东微量元素科学，2006，13(8)：39-41)、裸花紫珠总黄酮的抗炎、止血作用研究(现代中西医结合杂志，2009,18(6):3161-3162)，裸花紫珠5_羟基_3_7_3_4_四甲氧基黄酮抗炎作用研究(海南医学院学报，2014，20(11):1460-1462)，这类研究或者是以裸花紫珠的粗提物，或者是以裸花紫珠分离出来的单个化合物为研究对象，这些现有技术对于裸花紫珠抗氧化作用的药效物质基础的研究来说尚未浅显，而且获得较高抗炎活性的有效部位并开发成终端产品具有非常重要的意义。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种具有抗炎活性的裸花紫珠提取物。本发明的目的通过以下技术方案实现：一种具有抗炎作用的裸花紫珠提取物，其特征在于含有24～36％的黄酮类化合物、0.8％～3％的苯乙醇苷类化合物、15％～27％的二萜类化合物。所述黄酮类化合物含有木犀草苷、木犀草素-4'-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、木犀草素-3'-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、木犀草素、5,4'-二羟基-3,7,3'-三甲氧基黄酮、5-羟基-3,7,3',4'-四甲氧基黄酮其中的一种或多种；所述苯乙醇苷类化合物含有毛蕊花糖苷、连翘酯苷中的一种或两种；所述二萜类化合物含有紫珠酸B(callicarpicacidB)、7α-乙酰基山达海松酸(7α-acetoxysandaracopimaricacid)、山达海松酸(sandaracopimaricacid)中的一种或多种。本发明所述具有抗炎作用的裸花紫珠提取物，可以由以下步骤制备：(1)取裸花紫珠药材，粉碎成粗粉，加入90-95％乙醇加热回流提取1-3次，得提取液，过滤后所得滤液浓缩成浸膏A；(2)步骤(1)所得浸膏A均匀分散于水中，依次加入石油醚、乙酸乙酯萃取，除去溶剂，分别得到石油醚萃取有效部位B、乙酸乙酯萃取部位C；(3)将有效部位B与有效部位C以重量比为1～3:1的比例混合，即得。有效部位B、C均以同等相对密度(1.30－1.35，60℃)的浸膏或者干燥粉末混合。作为上述方案的优选之一，所述步骤(1)浸膏A的制备方法为：取裸花紫珠药材，粉碎成粗粉，加入95％乙醇加热回流提取3次，得提取液，过滤后所得滤液减压浓缩得浸膏(相对密度1.30－1.35，60℃)。作为上述方案的优选之一，所述步骤(1)浸膏A的制备方法为：取裸花紫珠药材，粉碎成粗粉，加入90-95％乙醇加热回流提取1-3次，提取液滤过，合并，滤液浓縮至相对密度为1.04－1.06(60℃)的清膏，加入浓缩液总重4％－6％的1％的壳聚糖醋酸溶液，搅匀，冷却，静置16－24小时，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.06～1.10(60℃)的清膏，加入DM-130树脂，静态吸附24h，滤过，滤液浓缩至相对密度1.30－1.35(60℃)的浸膏。上述方案中所述步骤(3)中有效部位B与有效部位C以重量比优选为为2.5:1。上述1％壳聚糖醋酸溶液的配制方法为：取1g壳聚糖溶于100ml纯化水中，加入冰醋酸配制成含1％醋酸浓度的壳聚糖溶液，静置，备用。本发明中所述浸膏为相对密度1.30－1.35(60℃)的稠膏。为了更好的理解本发明，将通过以下实验说明本发明的技术效果。(1)裸花紫珠提取物制备裸花紫珠药材10kg，粉碎成粗粉，用95％乙醇加热回流提取，得提取液，过滤后减压浓缩成浸膏，浸膏均匀分散于水中，依次用适量的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，萃取液浓缩干燥后，得到石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水4个部位的萃取物，真空干燥，备用。对照品毛蕊花糖苷(1)、木犀草苷(2)、木犀草素-3'-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(3)、木犀草素-4'-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(4)、木犀草素(5)、5,4'-二羟基-3,7,3'-三甲氧基黄酮(6)、5-羟基-3,7,3',4'-四甲氧基黄酮(7)均为从裸花紫珠中分离得到，均通过NMR、MS和文献对照等进行结构鉴定。(2)一氧化氮(NO)生成抑制活性测定小鼠巨噬细胞RAW264.7在37℃、5％CO2的培养箱中常规培养于DMEM培养液中。实验时将细胞浓度调整至3×104/mL后接种至96孔板，贴壁后，给药组分别加入裸花紫珠萃取物(25μg/mL)或对照化合物(25μM)干预细胞2h，再加入诱导剂LPS(终浓度1μg/mL)，阴性对照组加入等量的DMEM培养基，培养24h后，吸取上清液，加入Griess试剂，混匀，避光静置10min，于550nm处测定吸光度值。NO生成抑制率(％)＝(1-给药组NO浓度均数/阴性对照组NO浓度均数)×100％。(3)裸花紫珠提取物和化合物对LPS诱导RAW264.7细胞NO生成的影响如表1所示，裸花紫珠醇提物的石油醚和乙酸乙酯部位在25μg/mL的浓度下显示出对激活状态RAW264.7细胞NO释放的抑制活性，两者的抑制活性均大于醇提物，其中乙酸乙酯部位的抑制作用稍强于石油醚部位，而正丁醇部位和水部位的抑制率低于醇提物，未显示出明显的抑制活性。裸花紫珠6个黄酮类主成分在25μM的浓度下显示出不同程度的抑制作用，其中木犀草苷活性最高，其次是木犀草素和木犀草素-4'-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，5,4'-二羟基-3,7,3'-三甲氧基黄酮则最弱。表1裸花紫珠提取物和对照化合物对LPS诱导RAW264.7细胞NO生成的影响(4)液质联用技术鉴定活性部位主要化学成分对裸花紫珠的石油醚和乙酸乙酯活性部位进行HPLC-DAD-ESI-MS测试，综合分析其紫外吸收、相对分子质量和碎片离子等信息以及对照品质谱信息，对主要色谱峰进行鉴定和归属，见附图1。从乙酸乙酯部位鉴定6个黄酮和1个苯乙醇苷类成分，从石油醚部位鉴定了2个黄酮和3个二萜成分，分析结果见表2。以峰面积归一法测得乙酸乙酯部位的成分和含量为：木犀草苷、木犀草素-4'-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、木犀草素-3'-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、木犀草素、5,4'-二羟基-3,7,3'-三甲氧基黄酮、5-羟基-3,7,3',4'-四甲氧基黄酮为黄酮类成分，含量为43.8％，毛蕊花糖苷为苯乙醇苷类成分，含量为3.5％，乙酸乙酯部位收率为4.2％；石油醚部位的成分和含量为：5,4'-二羟基-3,7,3'-三甲氧基黄酮、5-羟基-3,7,3',4'-四甲氧基黄酮为黄酮类成分，含量为20.2％，callicarpicacidB、7α-acetoxysandaracopimaricacid、sandaracopimaricacid.为二萜类成分，含量为31.9％，石油醚部位收率为1.3％。表2裸花紫珠活性部位主要成分的鉴定注：Q为石油醚部位，P为乙酸乙酯部位。另callicarpicacidB在本发明中中文译名为紫珠酸B。一氧化氮(NO)是具有生物活性的气体信号分子，属于细胞间信息传递的重要调节因子。但NO的过量生成与炎症密切相关。致炎物质和炎症介质可诱导或增加NO的合成和释放。当采用脂多糖(LPS)刺激RAW264.7巨噬细胞后，细胞炎症模型被建立，此过程会生成大量的诱导型一氧化氮合成酶(inducedNOsynthase，iNOS)，iNOS通过催化其底物L-精氨酸，生成NO进行免疫应答。因此，抑制NO生成是化合物具有抗炎活性的直接指标。实验发现石油醚和乙酸乙酯部位均能有效抑制LPS诱导的RAW264.7细胞中NO的分泌，以乙酸乙酯部位的抗炎作用最强。裸花紫珠的化学成分有黄酮及苷类、三萜及苷类、二萜、苯乙醇苷类、酚酸类、甾体类、挥发油等，目前已从中分离得到100余个化合物。然而现有的对裸花紫珠成分与活性的研究相对薄弱，尤其是其最主要的抗炎活性，现有技术中裸花紫珠抗炎活性的体现或者是以粗提物(水提物或醇提物)的活性研究，或者是对单个化合物的分离鉴定与活性研究，仅有CN104435386A中公开了一种抗炎组合物，由裸花紫珠总黄酮和总苯丙素组成。抗炎药物是人类需求量非常大的一种药物，要开发出具有道地特色和药效特色的裸花紫珠组分中药，一方面提高其组分中药的活性，另一方面尽可能提高其收率。发明人在前期研究基础上，对抗 炎活性成分群做了深入的研究，通过采用溶剂(水、甲醇、乙醇、丙酮等)提取，结合大孔树脂或活性碳或陶瓷膜或萃取等等分离方法，联合质谱、液相等分析技术，最终得出本发明的技术方案。发明人对活性部位进行HPLC-DAD-ESI-MS检测发现，裸花紫珠乙酸乙酯部位的主要成分是黄酮及黄酮苷类成分，同时含有少量的苯乙醇苷类成分，黄酮和二萜成分则是其石油醚部位的主要成分。通过对单体化合物与不同活性部位的比较，表明裸花紫珠的抗炎作用是特定的多成分协同作用的结果，且石油醚部位和乙酸乙酯部位以特定的比例所得混合物的抗氧化活性更强，另外在后期进一步的研究中，对通过特定工艺所获得的裸花紫珠提取物再进行萃取分离后，其抗炎活性显著提升，这与壳聚糖醋酸溶液和DM-130树脂通过吸附、聚合、沉淀、分离等方式，将裸花紫珠粗提物中粘液质、多糖、色素等非活性成分和可能对抗炎作用起拮抗作用的成分除去，进一步富集和纯化活性成分，提高单位提取物的生物活性，为后续新产品的研究和开发奠定物质基础。本发明的有益效果：(1)获得抗炎活性较强的活性部位，且明晰其主要化学成分；(2)制备方法操作简便。附图说明图1：裸花紫珠活性部位(A:石油醚组分；B:乙酸乙酯组分)和对照品(C)的HPLC图谱，其中1:毛蕊花糖苷；2:木犀草苷；3:木犀草素-4'-O-β-D-吡喃葡萄糖苷；4:木犀草素-3'-O-β-D-吡喃葡萄糖苷；5:木犀草素；6:5,4'-二羟基-3,7,3'-三甲氧基黄酮；7:5-羟基-3,7,3',4'-四甲氧基黄酮；8:callicarpicacidB；9:7α-acetoxysandaracopimaricacid；10:sandaracopimaricacid.具体实施方式以下将进一步通过举例详细说明本发明，发明人通过不同制备工艺得到相应的实施例和对比例，并测得其成分、含量、收率、抑制率等详见下表3。发明人通过如下工艺制得实施例：(1)取裸花紫珠药材，粉碎成粗粉，加入90-95％乙醇加热回流提取1-3次，得提取液，过滤后所得滤液浓缩成浸膏A；(2)步骤(1)所得浸膏A均匀分散于水中，依次加入石油醚、乙酸乙酯萃取，除去溶剂，分别得到石油醚萃取有效部位B、乙酸乙酯萃取部位C；(3)将有效部位B与有效部位C以重量比为1～3:1的比例混合，即得。其中步骤(1)浸膏A的制备方法还可以为：取裸花紫珠药材，粉碎成粗粉，加入90-95％乙醇加热回流提取1-3次，提取液滤过，合并，滤液浓縮至相对密度为1.04－1.06(60℃)的清膏，加入浓缩液总重4％－6％的1％的壳聚糖醋酸溶液，搅匀，冷却，静置16－24小时，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.06～1.10(60℃)的清膏，加入DM-130树脂，静态吸附20-24h，滤过，滤液浓缩成浸膏。同上述
发明内容中HPLC-DAD-ESI-MS分析方法，其中各实施例有效部位成分相对百分含量以峰面积归一法测得，各实施例和对比例对LPS诱导RAW264.7细胞NO生成的影响(即抑制率1)同上述
发明内容中裸花紫珠提取物和化合物对LPS诱导RAW264.7细胞NO生成的影响的实验方法；另外还通过对二甲苯致小鼠耳廓肿胀的影响(即抑制率2)的实验方法如下：雄性SD大鼠按体重随机分为：空白对照组(相应体积蒸馏水)；给药组(各实施例、对比例所得样品，剂量0.8g/kg)。每组各10只，每组灌胃给药1次/d，连续7d，灌胃体积0.2mL/10g体重，末次给药30min后，将二甲苯涂于右耳两面，,30μL/只，左耳作对照。30min后处死动物，沿耳廓基线剪下双耳。分别用直径8mm打孔器在左右耳相对称部位取下耳片称重，以右耳廓重减去左耳廓重的差值为肿胀度，并计算耳肿胀抑制率，肿胀抑制率(％)＝(空白对照组平均耳肿胀度-给药组平均耳肿胀度)/空白对照组平均耳肿胀度×100％。表3除实验组剂量不同，方法同上述实施例1-7和对比例1-15的对LPS诱导RAW264.7细胞NO生成的影响(即抑制率1)、对二甲苯致小鼠耳廓肿胀的影响(即抑制率2)的实验方法，对比例16-24的实验结果如下表4、表5表4编号制备方法及有效部位B、C的比例剂量抑制率1对比例16同对比例150μg/mL81.1％对比例17同对比例250μg/mL78.6％对比例18同对比例350μg/mL79.3％对比例19同对比例450μg/mL77.8％对比例20同对比例650μg/mL81.9％对比例21同对比例750μg/mL85.1％对比例22同对比例850μg/mL82.7％对比例23同对比例950μg/mL85.6％对比例24同对比例1150μg/mL79.2％表5编号制备方法及有效部位B、C的比例剂量抑制率2对比例16同对比例11.6g/kg71.6％对比例17同对比例21.6g/kg70.3％对比例18同对比例31.6g/kg73.5％对比例19同对比例41.6g/kg67.8％对比例20同对比例61.6g/kg73.6％对比例21同对比例71.6g/kg75.3％对比例22同对比例81.6g/kg74.7％对比例23同对比例91.6g/kg78.8％对比例24同对比例111.6g/kg78.5％当前第1页1 2 3