本发明涉及一种治疗禽大肠杆菌病的中药组合物，及其制备方法和应用，属于兽药领域。
背景技术：
禽大肠杆菌病是由致病性大肠杆菌引起的一种急性、慢性传染病，其临诊表现形式复杂多样，包括肝周炎、心包炎、气囊炎、腹膜炎、输卵管炎、卵黄性腹膜炎、肠炎、脐炎、全眼球炎等，甚至还导致胚胎和幼雏的死亡。据报道，本病发病率为11-69％，死亡率为3.8-72.9％，致死率为40.2-90.3％，是危害养殖业健康发展的的一大类传染病。
目前禽大肠杆菌病的防控有预防和治疗2种途径，预防是指接种大肠杆菌细菌疫苗，如注射大肠杆菌氢氧化铝灭活菌苗或亚单位苗，通过刺激机体产生的抗体进行保护。但因大肠杆菌血清型较多，并且不断有变异株出现，加上大肠杆菌病发病情况复杂，疫苗的推广在很大程度上受到限制，故疫苗预防不能有效的控制本病的发生。抗生素和化学合成抗菌药在禽大肠杆菌病的控制中发挥着重要的作用，但由于细菌本身的特点以及药物的不合理使用，药物在动物体内的残留对食品安全构成威胁的同时，还导致了耐药菌株不断产生，治疗失败现象时有发生。而中药作用靶点多，且中药作用机理复杂，可以避免细菌通过外排泵作用对其产生耐药性，故而开发中药制剂来治疗大肠杆菌病具有广阔的发展前景。
但是在现有技术中，用中药来治疗鸡的大肠杆菌病，仍存在一定的问题，首先，中药剂型较为单一，大多数仍为传统的散剂。《中华人民共和国兽药典》中的禽用制剂，90％以上均为散剂。与其他动物相比，禽类消化道较短，代谢快，药物在肠道内停留时间短，未经提取的中药 含有细胞壁成分，在家禽体内很难完全吸收利用。其次，实际应用中，很多是沿袭古书典籍中的传统方剂，通常药味众多，没有从畜禽的发病特点来证明其有效性，缺乏现代药理学研究内容。故而研制开发一种能防治耐药大肠杆菌病的药物是养殖业发展的迫切需求。
专利申请201410751840.1公开了一种治疗鸡白痢的中药口服液及其制备方法，由穿心莲、苦参、功劳木、木香、地锦草、甘草组成。然而该组方药味众多，质量不易控制，成品检验难度大、成本高。
专利申请号201210415516.3的专利公开了一种畜禽用清热止痢的中兽药颗粒，包括以下组分及其质量份数：苦参10-20份；十大功劳5-15份；小茴香5-15份；马尾连5-15份；木香5-15份；木槿花5-15份；毛诃子5-15份；凤尾草5-10份；当归5-10份；甘草5-10份。该组方除了药味众多，质量不易控制的缺点之外，还因其分2步提取，提取成本增加，且水提物与醇提物混合后会有大量析出，有效成分含量会降低。
专利申请201210344631.6公开了一种止痢宁的制备方法，以穿心莲1000g、苦参250g、木香250g作为原料药，采用超临界萃取和微波萃取制备而成，剂型为片剂。虽然超临界萃取和微波萃取法提取率高，但该方法生产成本较高，不适合大生产。且该组方制备的药剂为片剂，不适合家禽的用药需求。
技术实现要素：
为解决现有技术的不足，本发明提供了一种疗效确切、无毒副作用、无药物残留、无耐药性的治疗禽大肠杆菌病的中药组合物。
本发明的一个方面在于提供一种预防和治疗禽大肠杆菌病的中药组合物，其中，所述中药组合物原料包括十大功劳3-6份、苦参2-5份、木香1-3份。
本发明根据中兽医的辩证理论，禽大肠杆菌病为湿热雍积肠道的里热证，治疗以清热燥湿、解毒止痢为主。通过试验筛选出针对大肠杆菌病最佳组方：十大功劳、苦参、木香。其中十大功劳清热燥湿、解毒止 痢，用于治疗肠黄泻痢，湿热黄疸、咽喉肿痛、疮毒，湿疹等疾病，在方中发挥主要作用，为君药。苦参具有清热燥湿，杀虫去积，利水消肿，用于治疗湿热泻痢，黄疸，水肿等病症，协助十大功劳发挥药效，为臣药。木香行气止痛，健脾消食、和胃止泻，可治中焦气滞引起的脘腹胀痛、食欲不振和痢疾等里急后重等症，对大肠杆菌病引起的精神不振、食欲下降等症状具有缓解作用，为佐使药。三者组方，在治疗大肠杆菌病的同时，对气滞引起的食欲不振、羽毛松乱，生产性能下降具有调节作用。
作为本发明的一种实施方式，所述中药组合物原料包括十大功劳3-5份、苦参2-3份、木香1-3份。
作为本发明的一种优选实施方式，所述中药组合物原料包括十大功劳5份、苦参3份、木香2份。
作为本发明的一种实施方式，所述中药组合物为颗粒剂、粉剂、片剂、口服液。
作为本发明的一种优选实施方式，所述中药组合物为颗粒剂。
禽类因禽患大肠杆菌病后，往往采食量下降，故本发明将药物制成颗粒剂，颗粒剂溶水性好，易于保存，符合现代养殖业的用药需求。
本发明提供的中药组合物疗效确切、无毒副作用、无药物残留、无耐药性，在治疗禽大肠杆菌病的同时，对大肠杆菌引起家禽的采食量下降，生长发育受阻具有缓解作用，可达到标本兼治的目的。
本发明的一个方面在于提供一种制备所述的中药组合物的方法，其中，所述方法包括：(1)使用85％的乙醇溶液浸泡，回流提取所述原料，提取后的原料使用85％的乙醇溶液再次回流提取，过滤两次的提取液，合并滤液；(2)浓缩所述步骤(1)中的合并的液体至相对密度1.05-1.10，离心，上清液减压浓缩至相对密度为1.20的浸膏，加入辅料，制备颗粒剂。
作为本发明的一种实施方式，所述步骤(1)中的首次提取的乙醇用量为原料的10倍，浸泡时间为1小时，提取时间为2小时，第二次提取的乙醇用量为原料的8-10倍，提取时间为2小时，所述步骤(2) 中浓缩至相对密度1.05-1.10为在50～60℃温度下测定，减压浓缩至相对密度为1.20为在60～70℃温度下测定。
本发明的中药组合物的制备方法工艺简单，适合工业化大规模生产。
本发明的一个方面在于提供所述的中药组合物在制备预防和治疗禽大肠杆菌病的药物中的应用。
作为本发明的一种实施方式，当所述的中药组合物用于预防时，所述中药组合物用量为0.5g/L，连用3天；当所述的中药组合物用于治疗时，所述中药组合物用量为1.0g/L，连用5天。
本发明的中药组合物由纯中药组成，方中药材均为《中华人民共和国兽药典》二部收录的药材，纯天然、无残留，可以避免药物在动物体内的残留。
中药作为靶点多，作用机制复杂，十大功劳小檗碱中5’-MHC可抑制细菌的外排泵机制，避免了耐药性的产生，同时对大肠杆菌具有耐药逆转作用。
本发明的中药组合物抗菌谱广，使用不受血清型和区域的限制，对各种血清型的大肠杆菌均具有抗菌作用，避免了使用时选择药物的麻烦。
本发明的中药组合物中含有的木香，具有行气止痛，健胃消食的功效，对中焦气滞引起的脘腹胀痛、食欲不振和痢疾具有治疗作用，可改善禽大肠杆菌病引起的食欲不振、羽毛松乱、腹泻、生产性能下降等症状。
本发明的中药组合物三味药物组方，从中医的理论讲，既消除“湿”、“热”等病因，又可缓解气滞引起的表症，标本兼治。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发 明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1本发明所述的中药组合物的制备例
制备例1称取十大功劳3kg、苦参2kg、木香1kg，加入85％的乙醇溶液60L，浸泡1h，回流提取2h，过滤，收集滤液。滤渣再加85％的乙醇溶液50L，回流提取2h，过滤，合并滤液，浓缩至相对密度1.05。离心，取上清液减压浓缩至相对密度为1.20的浸膏，加入1.5kg的辅料(蔗糖：糊精＝1:1)，混匀，制粒，即得。
制备例2称取十大功劳5kg、苦参3kg、木香2kg，加入85％的乙醇溶液100L，浸泡1h，回流提取2h，过滤，收集滤液。滤渣再加85％的乙醇溶液100L，回流提取2h，过滤，合并滤液，浓缩至相对密度1.10。离心，取上清液减压浓缩至相对密度为1.20的浸膏，加入2.5kg的辅料(蔗糖)，混匀，制粒，即得。
制备例3称取十大功劳5kg、苦参3kg、木香3kg，加入85％的乙醇溶液110L，浸泡1h，回流提取2h，过滤，收集滤液。滤渣再加85％的乙醇溶液100L，回流提取2h，过滤，合并滤液，浓缩至相对密度1.10。离心，取上清液减压浓缩至相对密度为1.20的浸膏，加入2.8kg的辅料(蔗糖)，混匀，制粒，即得。
制备例4称取十大功劳5kg、苦参5kg、木香2kg，加入85％的乙醇溶液120L，浸泡1h，回流提取2h，过滤，收集滤液。滤渣再加85％的乙醇溶液140L，回流提取2h，过滤，合并滤液，浓缩至相对密度1.10。离心，取上清液减压浓缩至相对密度为1.20的浸膏，加入3.0kg的辅料(蔗糖)，混匀，制粒，即得。
制备例5称取十大功劳6kg、苦参5kg、木香3kg，加入85％的乙醇溶液140L，浸泡1h，回流提取2h，过滤，收集滤液。滤渣再加85％的乙醇溶液140L，回流提取2h，过滤，合并滤液，浓缩至相对密度1.10。离心，取上清液减压浓缩至相对密度为1.20的浸膏，加入3.2kg的辅料(蔗糖)，混匀，制粒，即得。
实施例2本发明所述的中药组合物对人工感染鸡大肠杆菌病的治疗效果
1日龄海蓝褐蛋公雏300只，各组按蛋鸡正常饲养标准饲养至15日龄。16日龄时，称取鸡只体重，同时挑取体重相近的健康雏鸡240只，随机分为12个组，每组20只，其中第1-5组为预防组，6-10组为治疗组，第11组为攻毒对照组，第12组为空白对照组。第1-5组于分组当天开始按0.5g/L的剂量用本发明制备例制备的药物给药进行预防，连续3天。19日龄时，除空白对照组外，第1-11组用浓度为1.0×109CUF/ml的大肠杆菌C83851进行攻毒，攻毒方式为胸肌注射，剂量为0.2ml/只。第12组不攻毒，胸肌注射0.2ml营养肉汤作为对照。攻毒后4h，逐只观察鸡群，统计各组发病鸡只数。第6-10组按1.0g/L的剂量用本发明制备例制备的药物进行给药治疗，连续给药5天。给药及处理详见表1。
表1 试验具体分组及处理
给药后每天观察鸡群，记录各组鸡群的发病和死亡情况，观察至攻毒后第14天。试验结束，称取各组鸡只体重，并处死全部动物，进行系统解剖，观察内脏器官病变并取心、肝涂麦康凯琼脂平板，37℃温箱培养，观察菌落的生长情况。试验期间死亡鸡只及时解剖，观察内脏器官病变并涂板观察细菌生长情况。试验结束后，按以下公式统计各组鸡群的发病率、死亡率、治愈率和试验期间的增重率。
发病率(％)＝各组发病动物数(只)/各组试验动物数(只)×100％
死亡率(％)＝各组死亡动物数(只)/各组试验动物数(只)×100％
治愈率(％)＝各组治愈动物数(只)/各组试验动物数(只)×100％
试验结果：攻毒后4h，攻毒对照组和药物治疗组鸡群发病率达100％，5个预防组由于提前3天给药，发病率有不同程度的降低。攻毒后药物治疗组在攻毒后第4天，鸡群精神逐渐好转，与攻毒对照组相比，未死亡鸡只发病症状明显减轻。攻毒后第6天，鸡只发病症状明显减轻，仅有个别鸡只有精神沉郁等发病症状。攻毒后第8天观察，病鸡临床症状完全消失。攻毒对照组在攻毒后3天发病症状明显加重，发病严重鸡只高度沉郁，呆立，不食，卧地不起，甚至死亡。至攻毒第8天观察时症状开始减轻，至第13天观察不到明显的发病症状。
试验期间鸡群的发病率、死亡率和给药组的保护率和治愈率统计结果见表2、表3，鸡群的各时期的体重、相对增重率统计结果见表4。
表2 预防各组的统计数据
注：上表中，试验各组与攻毒对照组相比，“*”表示差异显著(0.01<P≤0.05)，“**”表示差异极显著(P≤0.01)。下表同。
表3治疗各组的统计数据
表4 复方十大功劳颗粒对病鸡增重的影响
从表2、表3和表4统计结果可以看出，本发明的中药组合物按0.5g/L的剂量进行饮水给药，可以降低人工感染鸡大肠杆菌的发病率和死亡率，对鸡大肠杆菌的保护率在70-85％。攻毒发病后，使用本发明制备例1-5制备的药物进行治疗，治疗各组鸡群的死亡率有不同程度的降低，各组的治愈率为65-80％。同时，给药各组试验期间增重高于攻毒对照组。说明本发明的中药组合物可以降低鸡大肠杆菌病引起的直接损失，同时对肠杆菌病引起的鸡只生长发育受阻具有改善作用。
实施例3本发明所述的中药组合物对自然感染鸡大肠杆菌病的治疗效果
试验方法：洛阳市偃师某养殖场，AA肉鸡7000羽，于16日龄时出现发病症状，经解剖学观察、病原分离确诊为大肠杆菌病，将发病鸡群随机分为6个组，第1-5组每组约1200-1300只，第6组100只，不同组之间用网隔开。从20日龄开始，第1-5组按1.0g/L的剂量在饮水加入本发明制备例1-5制备的药物，连续5天。试验动物分组与处理详见表5。
表5 实验动物处理及分组
给药后，每天早上9:00观察鸡群的精神状态(有无羽毛松乱、翅膀下垂、闭眼缩颈)、行为活动(给料后抢食、饮水)、对刺激的反应性(鸡群驱赶后的表现)、粪便状态，记录试验鸡群的临床症状变化和死亡情况，对死亡鸡只及时进行病理剖检，观察内脏器官病理变化，并取肝脏、心脏等组织接种麦康凯琼脂，观察细菌生长情况，连续观察至给药结束14天。试验结束，统计试验期间各组的发病率、死亡率和试验期间增重率。
试验结果：试验期间，给药各组鸡群经给药治疗后，从第2天开始，采食量即出现小幅度增加，从第3天起开始鸡群采食量明显增加，鸡群精神明显好转，精神不振、羽毛松乱、闭眼缩颈发病鸡只以及死亡鸡只数逐日减少，给药5天后除个别鸡只外大群鸡只精神恢复正常，给料后迅速抢食，不再有鸡只死亡。各组发病率、死亡率、治愈率以及增重率结果详见表6、7。
表6 各组鸡群的发病、死亡、治愈率统计结果
表7 各组鸡群的增重情况统计结果
从表4、5统计结果可以看出，本发明的中药组合物按1.0g/L的剂量进行饮水给药，对自然感染的鸡大肠杆菌病具有治疗作用，可极显著降低鸡群感染大肠杆菌病的发病率和死亡率(P≤0.01)，在一定程度上提高鸡群对大肠杆菌病的抵抗力，对鸡大肠杆菌的治愈率在62.22-81.48％。同时可提高鸡群在试验期间的增重率，说明本发明制备例制备的中药组合物可治疗鸡大肠杆菌病，同时对大肠杆菌引起的生长发育受阻具有改善作用。
实施例5本发明所述的中药组合物对自然感染雏鸭大肠杆菌病的治疗效果
试验药物：本发明实施例2制备的中药组合物；
对照药物：按申请号201210415516.3的专利中实施例3的方法制备中药颗粒。
试验方法：山东临沂地区番鸭3000只，3周龄时突然发病，零星死亡。解剖死鸭可见肝周炎、心包炎、气囊炎、腹膜炎等症状，接种麦康凯琼脂、伊红美兰琼脂等培养基可见典型的大肠杆菌菌落特征。确诊后将鸭群2975只雏鸭分为3组，第1、2组为试验组，第1组1415只，用本发明制备例2制备的药物按1.0g/L的剂量进行饮水给药，连用5天。第2组1460只按1.0g/L的剂量用申请号为201210415516.3的专利实施例3制备的药物进行饮水给药，连用5天。第3组为感染对照组，随机挑取100只雏鸭，感染对照组不给药，正常饲养管理。每天观察鸡群，记录死亡动物数，死亡动物及时解剖，观察内脏器官病变，连续观察14天。
试验结果：治疗组经投药治疗，从第3天开始第1、2组鸭群精神逐渐恢复，釆食、饮水量增加，至用药结束，鸭群精神状态、行为活动全部恢复正常。整个试验期间第1组鸭群共死亡16只，死亡率1.13％，第2组鸭群死亡18只，死亡率1.23％。感染对照组100只雏鸭，未经药物治疗，3天后死亡数目增多，至第8天精神逐渐恢复，死亡减少，至第11天死亡停止。整个试验期间死亡23只，死亡率23％。与感染对照组相比，第1、2组死亡率显著降低，第1组与第2组相比，死亡率无显著差异。说明本发明实施例制备的中药组合物对鸭大肠杆菌具有治疗作用。
以上试验结果表明，本发明所述的中药组合物可治疗鸡、鸭大肠杆菌病，同时对大肠杆菌病引起的生长发育受阻具有改善作用。
以上全面描述了本发明的优选实施例，但是可对它们进行各种替代和修改。因此，不应参照以上描述来决定本发明的范围，而是应参照所附权利要求书及其全部等同物来决定本发明的范围。任何特征，(不论是否为优选)均可与任何其他特征(不论是否为优选)相结合。本发明的权利要求书不应被理解为具有方法+功能的限制，除非在某一权利要求中通过术语“…的方法”明确地列举出此类限制。