用于静脉施用的替比法尼制剂的制作方法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2005年10月14日提交的美国临时专利申请系列号60/726,911的权益，其全部内容以及全部目的通过引用并入本文。

发明领域

本发明涉及替比法尼(tipifarnib)的新型制剂，其适合于静脉(IV)施用。本发明还涉及该制剂的用途、制备该制剂的方法以及通过向所述患者施用所述制剂治疗患者的方法。

发明背景

替比法尼被描述于WO 97/21701。替比法尼的化学名称是(R)-(+)-6-[氨基-(4-氯苯基)(1-甲基-1H-咪唑-5-基)甲基]-4-(3-氯苯基)-1-甲基-2(1H)喹啉酮。替比法尼的商品名是该化合物的绝对立体化学构型未在上述专利说明书描述的实施例中确证，但是该化合物由词头“(B)”标识以说明它是从柱色谱法分离的第二化合物。发现由此获得的该化合物具有(R)-(+)-构型。还由其发表的代码编号R115777提及的此化合物具有以下结构：

替比法尼是一种在酸性pH下具有非常好的水溶性的碱。其水解为R110127，其中胺官能度被羟基官能度取代。水解降解的速率在酸性条件下最低，但仍然非常快。R110127具有以下结构：

替比法尼是一种在体外和体内对人法呢基转移酶(FTase)有效的和选择性的非肽模拟竞争性抑制剂。此化合物在体外纳摩尔浓度下具有抗增殖作用，并且在数个体外和体内模型中以及在临床中作为单一疗法具有抗肿瘤作用。替比法尼的主要的抗肿瘤作用包括抑制血管发生、抑制细胞凋亡、以及直接抗增殖。

法尼基化靶标，例如(但不限于)Ras、RhoB和磷脂酰基肌醇-3激酶(PI₃K)/丝氨酸-苏氨酸激酶AKT(它们与细胞内稳态和增殖有关)通常在AML中突变或失调。法尼基化的抑制阻止了体外骨髓白血病细胞生长和祖先集落形成。与正常骨髓细胞相比，从癌症患者获得的白血病细胞对替比法尼的生长抑制作用明显更敏感。特异性下游效应器(通过该效应器，法尼基化的抑制作用产生抗白血病活性)的鉴别是正在进行的研究的主题。替比法尼在血液恶性肿瘤患者和实体瘤患者中显示出临床活性的征兆；所述血液恶性肿瘤包括但不限于急性骨髓内源性白血病、髓增生异常综合征和多发性骨髓瘤；所述实体瘤包括但不限于恶性胶质瘤和乳腺癌。

迄今为止，一些研究者已测定了替比法尼口服施用之后的药代动力学。替比法尼的剂量递增试验是在28名晚期癌症患者中进行的。在50-至500-mg b.i.d.剂量范围内，在口服施用之后2至5小时达到68-1458ng/mL的峰浓度范围。观察到替比法尼的血浆浓度呈线性增加。在此研究中观察到的替比法尼谷和峰血浆浓度是在抗白血病的活性范围内。

口服施用之后替比法尼被广泛地代谢。由人肝细胞的体外研究的数据显示，替比法尼经历了直接的葡萄糖醛酸化。诊断抑制剂和异源性表达系统的试验也表明，与其它CYP450酶如CYP2C19、CYP2A6、CYP2D6和CYP2C8/9/10相比，CYP3A4是替比法尼的主要代谢通路。在若干临床前试验中，如同法尼基转移酶和抗增殖剂，替比法尼的代谢产物是无活性的。然而，其个别代谢物的药代动力学未在人体中研究。在[¹⁴C]替比法尼口服施用于健康男性受试者的血浆样品中发现替比法尼的若干代谢物。这些代谢物包括替比法尼葡萄糖醛酸(glucuronide)结合物以及通过氧化脱甲基、脱氨基和失甲基-咪唑部分而形成的代谢产物。母体化合物的葡萄糖醛酸化(glucuronidation)是生物转化的主要途径。然而，未研究将替比法尼施用于癌症受试者之后替比法尼的代谢。此外，替比法尼代谢产物配置情况(其可发生在不同途径施用之后)潜在的差异未作系统性的试验。

此外，由于肿瘤性阻塞、手术处理、并发的口腔感染、明显的味觉反常或食欲减退、或者恶心和呕吐，癌症患者经常口服摄入受损。因此，仍然希望有用于另一种施用途径例如静脉施用的制剂。

发明概述

本发明的目的是提供给口服施用成问题的患者施用替比法尼的另选施用(即胃肠外)途径。本发明的目的是提供施用替比法尼的静脉途径，作为连续输注或短期输注(短于1小时至数小时；每天一次或多次)，其可提供对替比法尼的充分暴露，使得产生与目前每天两次口服施用替比法尼相似的临床结果。特别地，本发明的目的是提供施用替比法尼的静脉途径，作为连续输注或每天两次2小时输注，其可提供与目前每天两次口服施用替比法尼相似的暴露。本发明进一步的目的是提供治疗全身和血液恶性肿瘤以及特别是实体癌的方法。

附图简述

图1：“表1”：参与本项研究的患者的人口统计学数据。

图2：“表2”：2-小时静脉输注b.i.d.施用之后平均(±SD)替比法尼血浆C_max和AUC_0-10h值。

图3：“表3”：连续静脉输注施用之后平均(±SD)替比法尼血浆C_max和AUC_0-10h值。

图4：“表4”：替比法尼全身暴露量：2小时静脉输注对口服给药。

图5：“表5”：替比法尼全身暴露量：连续静脉输注对口服给药。

图6：“表6”：口服施用、2-小时静脉输注和连续静脉输注之后，替比法尼-葡萄糖醛酸的平均(±SD)血浆药代动力学参数。

图7：“表7”：口服施用、2-小时静脉输注和连续静脉输注之后，R130525的平均(±SD)血浆药代动力学参数。

图8：3个4-天治疗方案的连续施用之后替比法尼的平均(±SD)血浆浓度-时间图。

图9：替比法尼的游离分数和总血浆浓度间的关系。

图10：3个4-天治疗方案的连续施用之后替比法尼和衍生的代谢产物的平均(±SD)血浆浓度-时间图。

发明说明

本发明提供了给口服施用成问题的患者施用替比法尼的另选施用(即胃肠外)途径。本发明的目的是提供施用替比法尼的静脉途径，作为连续输注或短期输注(短于1小时至数小时；每天一次或多次)，其可提供对替比法尼的充分暴露，使得产生与目前每天两次口服施用替比法尼相似的临床结果。特别地，本发明的目的是提供施用替比法尼的静脉途径，作为连续输注或每天两次2小时输注，其可提供与目前每天两次口服施用替比法尼相似的暴露。

本发明进一步的目的是提供替比法尼的干燥制剂，其可用溶液增溶而得到可以静脉施用的替比法尼的制剂。本领域技术人员知道适合静脉施用制剂的限制条件。下文将讨论多种限制条件。静脉施用的所述制剂应当具有一定的pH。进入静脉的溶液不得太呈碱性也不得太呈酸性。该制剂不应含有进入血液中时会产生副反应的赋形剂。此外，该制剂一旦进入血液中时应当使所述活性成分保持可溶。列举的这些限制条件不是穷尽的。

本发明的制剂包含适宜量的替比法尼。这些量将取决于所得IV制剂将是否用于单剂量施用或者其将是否用于连续IV施用。

该制剂优选包含其它的一些环糊精或其衍生物。也可使用其它增溶剂。优选的环糊精是羟丙基β-环糊精。也可使用其它环糊精类。

任选的，也可使用甘露醇或另一糖，例如特里阿糖(trealose)或蔗糖。甘露醇或其它糖确保冻干物质的快速溶解。当不存在甘露醇时，会观察到一些仅缓慢溶解的胶状聚集物。在甘露醇存在下，这些聚集物不会出现或者出现较小的量。此外，甘露醇确保改善冻干物质的外观形状。没有甘露醇时，冻干物质可出现破裂，使得冻干物质从外观上看少有吸引人的外观。本发明进一步的目的是提供治疗全身性(in general)和血液恶性肿瘤以及特别是实体癌的方法。

本发明提供了抑制细胞(包括转化细胞)异常生长的方法，其通过施用本发明的药物制剂。细胞异常生长是指细胞生长不依赖于正常调节机制(例如接触抑制的丧失)。其包括以下的异常生长：(1)肿瘤细胞(肿瘤)表达活化的ras癌基因；(2)肿瘤细胞，其中ras蛋白由于另一基因的致癌突变而被活化；(3)其它增殖性疾病的良性和恶性细胞，其中发生ras活化。此外，文献中认为，ras癌基因不但通过直接影响肿瘤细胞生长，而且间接地即促进肿瘤诱发血管生成，而有助于体内肿瘤的生长。因此，药理学靶向突变体ras癌基因可认为是抑制了体内实体瘤生长，其部分地通过抑制肿瘤诱发血管生成实现。

本发明还提供了抑制肿瘤生长的方法，其通过将本发明的本药物制剂施用于需要该治疗的受试者，例如哺乳动物(更特别地是人)。特别是，本发明提供了抑制表达活化ras癌基因的肿瘤生长的方法，其通过施用本发明的药物制剂。可以被抑制的肿瘤的不限制的实例是，肺癌(例如腺癌)、胰腺癌(例如胰腺癌如外分泌腺的胰腺癌)、结肠癌(例如结肠直肠癌如结肠腺癌和结肠腺瘤)、淋巴系的造血肿瘤(例如急性淋巴细胞性白血病、B-细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤)、髓细胞性白血病(例如急性骨髓性白血病(AML))、甲状腺(例如小囊)癌、骨髓增生异常综合征(MDS)、间质源肿瘤(例如纤维肉瘤和横纹肌肉瘤)、黑素瘤、畸胎癌、成神经细胞瘤、神经胶质瘤、皮肤良性肿瘤(例如角化棘皮瘤)、乳腺癌、肾癌、卵巢癌、膀胱癌、表皮癌。

本发明还提供了抑制良性和恶性增殖性疾病的方法，其中ras蛋白由于基因中的致癌突变而被异常地活化，即ras基因自身未通过突变至致癌突变而活化成致癌型，所述的抑制是通过将本文所述的药物制剂施用于需要该治疗的受试者而完成的。例如，良性增殖障碍神经纤维瘤病，或者其中ras因酪氨酸激酶癌基因的突变或过表达而被活化的肿瘤，它们可通过本发明的药物制剂而被抑制。

因此，本发明公开了用作药物的本发明的药物制剂，以及式(I)的这些化合物在制备用于治疗一种或多种上述病况的药物中的用途。

术语和定义

为提供更简要的说明，本文给出的一些数量表述未用术语“约”限定。应理解为，不论此术语“约”是否明确使用，本文给出的每一个数量表示实际给出的值，并且它还表示接近此给出值，这是根据本领域技术人员可合理推知的，包括由于此给出值的试验和/或测定条件的近似值。

本文使用的术语“受试者”是指动物，优选哺乳动物，更优选人，其为治疗、观察或试验的对象。

本文使用的术语“治疗有效量”表示活性化合物或药物的量，其在组织系统、动物或人中诱发由研究者、兽医、医生或其它临床医师探求的生物学或医学应答，此应答包括所治疾病或障碍的至少一种症状减轻，和/或所治疾病或障碍的至少一种症状的发生率和/或严重度减少。

术语“立体异构体”是指具有相同分子式和相同共价键合原子顺序但空间取向不同的异构体。

术语“光学异构体”表示相同结构的异构体，其仅在其基团的空间排布上不同。光学异构体在不同方向上旋转偏振光的平面。术语“旋光度”表示光学异构体旋转偏振光平面的程度。

术语“外消旋物”或“外消旋混合物”表示两个对映体物种的等摩尔混合物，其中每一分离的种类以相反方向旋转偏振光平面以致该混合物没有旋光度。

术语“对映体”表示一种立体异构体，它与其镜像不是不可叠合的。术语“非对映体”表示不是对映体的立体异构体。

术语“手性分子”表示具有至少一个对映体对的分子。这是与非手性分子相反的，该非手性分子可以与其镜像叠合。

手性分子的两个不同镜像体也称为左旋的(左手的，缩写L)或右旋的(右手的，缩写D)，这取决于它们以何种方式旋转偏振光。符号“R”和“S”表示在立体源(stereogenic)碳原子周围的基团的构像。

由外消旋混合物分离到的对映体富集形式的实例包括右旋对映体，其中该混合物基本上没有左旋异构体。在本上下文中，基本上没有表示左旋异构体根据以下公式，可以(在一个范围内)占少于该混合物的25％、少于10％、少于5％、少于2％或少于1％：

类似地，由外消旋混合物分离到的对映体富集形式的实例包括左旋对映体，其中该混合物基本上没有右旋异构体。在本上下文中，基本上没有表示右旋异构体根据以下公式，可以(在一个范围内)占少于该混合物的25％、少于10％、少于5％、少于2％或少于1％：

术语“几何异构体”表示取代基原子因碳-碳双键、环烷基环或桥接双环系统关系而取向不同的异构体。在碳-碳双键两侧的取代基原子(氢除外)可以是E或Z构型。在“E”构型中，所述的取代基在碳-碳双键关系中的对侧。在“Z”构型中，所述的取代基定位在碳-碳双键关系中的同侧。

与环系统连接的取代基原子(氢除外)可以是顺式或反式构型。在“顺式”构型中，所述取代基在环平面关系的同侧；在“反式”构型中，所述取代基在环平面关系的对侧。具有“顺式”和“反式”种类的混合体的化合物命名为“顺/反”。

异构表示符号(“R”、“S”、“E”和“Z”)表示原子构型，并且将如文献中所定义的使用。

本发明化合物可以通过异构体特异性合成或从异构体混合物拆分制备成单一异构体。常规的拆分技术包括：将异构体对的每一异构体的游离碱(或游离酸)使用旋光酸(或碱)结合形成旋光盐(接着分步结晶和游离碱再生)，通过与适宜的手性助剂反应形成异构体对的每一异构体的酯或酰胺(接着分步结晶或色谱分离并除去手性助剂)，或者使用各种公知的色谱法分离中间体或终产物的异构体混合物。

此外，本发明化合物可具有一种或多种多晶形或者无定形结晶形式，并且它们也将包括在本发明的范围内。此外，一些化合物可以与水形成溶剂合物(即水合物)或与普通有机溶剂(例如有机酯如乙醇化物等)形成溶剂合物，并且它们也将包括在本发明的范围内。

描述以下实施例以有助于理解本发明，并且不希望也不解释为以任何方式限制本发明所附权利要求中所述的内容。

实验部分

制剂

用于冻干的替比法尼10mg/ml可注射溶液(制剂1)

用于重构(reconsititute)替比法尼可注射冻干粉的溶液(制剂2)

构橼酸一水合物 1.97mg

无水磷酸氢二钠 4.44mg

注射用水qs ad 1000μl

使pH＝6.0±0.5

制剂的制备

制剂1

将10ml的制剂1填充到20ml管形瓶中，再冷冻干燥(每瓶100mg替比法尼)。使用之前，将冻干粉溶解于8.6ml的制剂2中，获得10ml的替比法尼10mg/ml可注射溶液(pH～4-5)。然后将这一替比法尼10mg/ml溶液用0.9％NaCl溶液稀释成需要浓度(0.5至2mg/ml)。

制剂1的pH值是非常酸的，以便(1)为了增溶替比法尼，(2)制备期间具有最小量的R110127形成(优选地冷温度10℃下进行制备)。

当用制剂2重构时，将羟丙基-β-环糊精加至制剂1中以增溶替比法尼。重构溶液的pH值为4.5。如果不存在羟丙基-β-环糊精，在此pH值下，替比法尼会沉淀。在此pH值下，向外周静脉(手臂)输注期间局部刺激的风险是可接受的水平。

在人体试验中，当施用较长时间(例如24小时)时，在输注位置发现有一些血栓性静脉炎。这可能是由于羟丙基-β-环糊精本身而非载体引起的。因此决定不通过外周静脉而通过中央静脉施用。中央静脉具有更高的血贮量(debit)，从而输液的混合和稀释更快、更高。由于当通过中央静脉输注时，输液的pH值较不关键，确定用WFI(注射用水)重构而不用制剂2重构。通过将制剂1的冷冻干燥粉末用WFI重构获得的溶液的pH值为～3。该重构溶液可通过中央静脉施用。

制备方法

(a)制剂1的制备(10L批量)

(1)向适宜的容器中加入2kg的羟丙基-β-环糊精。

(2)向(1)中加入500g甘露醇。

(3)向(2)中加入8kg注射用水，搅拌直至溶解。

(4)向(3)中加入164.0g HCl 10％，搅拌至均匀。

(5)向(4)中加入100g R115777，混合成溶液。

(6)经无菌0.22μm滤膜过滤。

(7)将10ml的(6)填充到20ml管形瓶中。

(b)制剂1的冷冻干燥

(8)塞住管形瓶，转移到冻干盘(lyo trays)。

(9)将(8)转移到冷冻干燥机。

(10)冷冻干燥：-冷冻：-40℃，环境压力

-首次干燥：10℃，0.1mbar

-第二次干燥：30℃，0.01mbar

(11)压瓶。

临床试验

方法和材料

此随机、标签公开(open-label)、对照试验是根据良好临床操作规范(good clinical practice)进行的。在该试验之前获得伦理委员会批准，并且患者在参与的知情同意书上签字。

替比法尼是以100-mg口服片剂或含有100mg替比法尼和2.0g羟丙基-β-环糊精(HPβCD)的瓶装冻干粉剂提供的。静脉输注前立即用制剂2重构该冻干粉。将此等分部分稀释于0.9％NaCl，再通过注射器以适宜的输注管线施用药物。

研究受试者

病理学确认为癌症的18岁或更大的男性和女性，对治愈性治疗不顺从，他们是本项研究的入选者。要求患者具有ECOG(东方协作肿瘤集团，Eastern Cooperative Oncology Group)体质状态≤2。其它要求包括在入组研究之前至少4周内无放射治疗和/或化学治疗(对于亚硝基脲和丝裂霉素C为6周)，充分的口服摄食以维持合理的营养状态。

如果有明显异常的血液状态，即由以下判断的：中性白细胞计数＜1,500/mm³、血小板计数＜100,000/mm³、血清胆红素＞2.0mg/dL、转氨酶＞5倍的规定正常值上限、或者肌酸酐＞1.5mg/dL，则排除这样的患者。在口服施用替比法尼期间，不允许同时施用质子泵抑制剂(例如奥美拉唑、兰索拉唑、泮托拉唑)(仅在循环1中，当进行PK评价时，以避免任何可能的干扰)。进行过胃肠(GI)道手术而容易因受损胃酸或脱离上部GI道而干扰药物吸收的患者未入选。根据研究者的意见，任何并发症的存在均将成为参与本项研究的风险，并且特定级别≥2的外周神经病当作不合格患者。

研究计划

本研究第一(剂量确定)期的目标是检验充分耐受的静脉剂量方案。期望此方案相当于50％-60％的临床相关口服剂量(200mg)，其基于在健康男性志愿者中预先试验确定的绝对生物利用度。第一组3名受试者接受接下来不间断的4天连续的替比法尼治疗：30mg作2-小时静脉输注b.i.d.，于第1-4天；接着200mg作口服施用b.i.d.，于第5-8天；接着每天60mg作连续输注，于第9-12天。类似地，第二组3名受试者接受类似的4天替比法尼治疗：60mg作2-小时静脉输注b.i.d.，接着200mg作口服施用b.i.d.，接着每天120mg作连续静脉输注。在每一个所述的4-天口服或i.v.治疗之间没有清洗(washout)期。

在所述组中第二和第三名受试者仅在第一受试者完成第一静脉和口服治疗(即8-天期间)而无剂量限制毒性(DLT)时才开始。如果在第一或第二组中DLT发生于3名受试者中的1名，则将3名追加的受试者加到那组中。如果超过1名以上受试者经历DLT(在首先的3名受试者中或在延长组的6名受试者中)，将剂量递增终止，在那组中的其它受试者以同一剂量完成他们的治疗。

本研究第一(i.v.-口服跨接)期是在不同的患者组中完成的。将全身暴露于替比法尼，接着所选的2-小时和连续静脉方案(从前面的剂量确定期)与200-mg b.i.d.口服方案之后暴露比较。当剂量确定期的第二组的至少2名受试者直至第21天尚未观察到DLT，则开始所述跨接期。为了，补偿潜在的顺序作用，在所选静脉方案中，将总计24名受试者随机以1∶1比率分配到两个治疗程序中的一个中。

顺序1∶100mg b.i.d.作2-小时静脉输注施用，于第1-4天；接着200mg口服片剂b.i.d.，于第5-8天；然后200mg/天作连续4-天静脉输注施用，于第9-12天。

顺序2∶200mg/天作连续4-天静脉输注施用，于第1-4天；接着200mg口服片剂b.i.d.，于第5-8天；然后100mg b.i.d.作2-小时静脉输注施用，于第9-12天。

口服剂量的替比法尼是在摄食后立即给予。替比法尼的输注是通过前臂外周静脉或较高剂量时通过中央脉管线施用的。

血浆取样和分析

在剂量确定期和跨接期，药物动力学取样是在每一治疗的第4天从早晨给药开始的10-小时期间进行的。全血样品是在口服施用之前即刻以及口服施用之后0.5、1、2、3、4、6、8和10小时取样。对于2-小时静脉输注，血液样品是在给药之前即刻以及给药之后1、2(即正好在输液结束之前)、2.25、3、4、6、8和10小时取样。血液样品是在连续静脉输注开始之前即刻以及连续静脉输注开始之后2、4、6、8和10小时取样。

每一PK样品收集的血液最少7mL。将全血样品立即置于冰中，并在采集之后2小时内离心(10min，1000xg)。将分离的血浆立即于≤-18℃下冷冻直至分析。

将血浆样品在室温下解冻，再使用以前公开的方法对各个样品分析替比法尼。向1-ml份的人血浆中加入200ng的内标(R121550，一种结构类似物)。加入1ml的NaOH(0.1M)之后，将样品用4ml的含有10％异戊醇的庚烷萃取两次。将合并的有机相用2ml的HCl(2M)反萃取。用浓氨碱化之后，水相用5ml的含有5％异戊醇的庚烷萃取一次。在氮气和65℃下将此萃取物蒸发，再将残余物溶解于100微升的注入溶剂(乙酸铵0.01M/乙腈/甲醇；50/25/25)。将15μl萃取物注入配有240nm波长UV检测器的HPLC(Agilent)中。在填充3μm C18BDS-Hypersil(Alltech)的10em x 4.6mm色谱柱中进行分离。在0.8ml/min的流速下，以0.01M乙酸铵/乙腈(52/48)的等度开始洗脱，直到感兴趣的化合物洗脱，接着梯度至90％乙腈。总的运行时间为14min。此分析在2.00至5000ng/ml的范围内有效。

替比法尼的代谢物，尤其是R130525、R107252和R104209，是使用LC-MS/MS测定的。这些代谢产物的化学结构表示于图11。为了测定葡萄糖醛酸化代谢物的存在，还在用大肠杆菌β-葡萄糖醛酸酶(Boehringer Ingelheim GmbH，Ingelheim，德国)脱结合(deconjugation)之后分析血浆样品。以如下说明制备样品：每份0.2mL人血浆或每份1.0mL的稀释的、脱结合的血浆样品中加入3种内标以每种5ng的混合物：稳定的同位素标记的化合物R198838用于替比法尼和R130525；两种结构类似物R107252和R121704分别用于R101763和R104209。加入1mL的0.1M NaOH之后，将样品用3mL的含有10％异戊醇的庚烷萃取两次。将合并的有机级分在氮气下蒸发，再将该残余物重构于100μL的甲醇和100μL的0.002M乙酸铵的混合物中。在C₁₈BDS-Hypersil 3μm(3.2mm I.D.×50mm)柱上进行色谱分离。注射体积为25μL。等度流动相是由0.002M甲酸铵(甲酸调至pH4)/乙腈(44/56)组成，泵速为0.5mL/分钟。通过串联质谱法用Turboionspray电离(正离子模式)检测。以下质量跃迁用于监测不同的化合物和内标物：替比法尼：489.1→407.1；R198838：492.1→407.1；R130525：475.1→393.1；R101763：394.0→139.0；R104209+R107252：408.0→139.0；以及R121704：422.1→139.0。脱结合之后对于每一代谢物在0.50-1250ng/ml的范围内以及对于替比法尼在10.0-25000ng/ml的范围内，该分析是有效的。

替比法尼蛋白结合分析

将替比法尼用[¹⁴C]在不对称碳原子上特异性地标记。在第4天连续静脉输注替比法尼开始之后4小时，从24名患者取7-mL血样。血浆用[¹⁴C]-替比法尼以500ng/ml加强。在配备相同的大-1(macro-1)特富龙(Teflon)池和Diachema 10.17透析膜(MW截止值为10,000)的Dianorm系统中，将该加强的血浆样品经用pH 7.17的0.067M磷酸盐缓冲液在下37℃经平衡透析4小时。以一式两份的100-μl份的加强的血浆在平衡透析之前和之后测定放射性水平；并在透析之后、在Packard Tri-Carb 1900TR液体闪烁谱仪上，以与甲醇混合的透析池的缓冲液隔室中的内容物1000-μl的一式两份测定放射性水平。用比色双缩脲(biureet)法(试剂盒为Roche Diagnostics 1929917)测定总蛋白浓度。用比色溴甲酚绿法试剂盒Roche Diagnostics 1970909测定白蛋白浓度。用免疫-比浊法(试剂盒为Roche Diagnostics 1557602)测定α₁-酸糖蛋白浓度。所有这些测定是在Roche Hitachi Modular分析仪上进行的。

如通过放射性测定透析池的缓冲液(C_u)隔室和血浆(C)隔室所测定的，非结合替比法尼的分数(f_u)是以非结合浓度(C_u)与总浓度(C)的比值计算的：f_u＝C_u/C。结合分数f_b＝1-f_u。

非隔室药代动力学分析

通过非隔室方法使用WinNonlin第3.1版程序(Pharsight Corporation，Cary，NC)，分析了从每一施用期的第4天早晨给药开始的10-小时替比法尼的各个血浆浓度-时间数据。从0至10小时时间的浓度对时间曲线下面积(AUC_0-10h)是使用线性梯形法计算的。最大血浆浓度(C_max)、稳态血浆浓度(C_ss，仅对于连续静脉输注)、以及达到血浆浓度峰值时间(t_max)为观测值。替比法尼口服施用后的生物利用度是基于AUC_0-10h值根据[AUC_po×DOSE_iv/(AUC_iv×DOSE_po)]×100％计算的。

统计分析

人口统计信息概括为中值、最小值和最大值。替比法尼及其代谢物的药代动力学数据也使用描述统计学进行概括。替比法尼口服和静脉施用之后，来自可得到全部3个治疗的药代动力学样品的受试者的全身暴露量(血浆C_max和AUC_0-10h)是使用ANOVA来评价的。对于替比法尼的C_max和AUC_0-10h，计算了在静脉输注(试验)对口服施用(参照)的最小二乘法平均比值附近的估计点和对应90％置信区间。使用SAS第6.12版统计软件程序(SAS Institute，Cary，NC)，用对数-变换的药代动力学参数进行该分析。

临床评价

取得完整的病历，在基线和治疗期间进行体格检查(包括生命体征)、血液学检测和临床化学检测。为评价心血管安全性，在筛查、第一周期和治疗结束时记录12-极线(lead)E.C.G.。虽然目标的肿瘤应答不是本研究的主要目标，仍尝试获得适合的测量结果以评价应答。根据一般毒性标准(Common Toxicity Criteria，CTC，第2.0版)，对所有不良事件和临床相关的实验室异常进行分级。

结果

受试者配置情况

总计入组32名受试者(10名男性和22名女性)；6名受试者参与剂量确定期，26名受试者参与跨接期。在此项研究中31名受试者被诊断为晚期实体瘤。1名受试者有高危骨髓增生异常综合征。在跨接期，12名受试者随机分配为接受治疗顺序1(2-小时静脉输注b.i.d./口服施用b.i.d./连续静脉输注)，14名受试者接受治疗顺序2(连续静脉输注/口服施用b.i.d./2-小时静脉输注b.i.d.)。随机分配到治疗顺序1的1名受试者在第4天从本项研究中退出，原因是违反协议规定；治疗顺序2的1名受试者在第8天退出，原因是由于疾病进展的肝衰竭。

招募到本研究的32名受试者的人口数据概述于表I(图1)。患者年龄范围为35至70岁，体重范围为48至92kg，身高范围为149至176cm。第3组(跨接期)的两个随机分组之间没有明显差异。

替比法尼静脉剂量的测定

第一组由3名受试者组成，他们接受4-天替比法尼方案：30mg每天两次作2-小时静脉输注，接着200mg每天两次作口服施用，再每天60mg作连续输注。平均地，与在这些个体接受200mg口服剂量之后的暴露量相比较，基于AUC_0-10h用30mg b.i.d.作2-小时静脉输注和每天60mg作连续静脉输注的替比法尼全身暴露量分别低约64％和59％(表II至IV)(图2至4)。静脉施用之后未观察到剂量限制毒性。因此，静脉施用剂量被升高到下一剂量水平。

在第二组中，3名另外的受试者接受4-天方案：60mg替比法尼每天两次作2-小时静脉输注，接着每天120mg作连续输注。与200mg口服剂量之后的暴露量相比较，在这些静脉方案之后替比法尼全身暴露量分别低约47％和46％(表II至IV)(图2至4)。此外，在这组中未观察到DLT。根据这些结果，每天两次100mg作2-小时输注施用的方案和200-mg/天连续输注被选定为静脉至口服跨接研究。

替比法尼的血浆药代动力学

正如所期望的，替比法尼血浆浓度-时间图的形状依赖于施用途径和给药方案(图1)。口服施用和2-小时静脉输注之后替比法尼的血浆峰浓度明显。相比之下，药物施用期间连续静脉输注产生相对恒定的血浆浓度而无明显峰。

最大血浆浓度是在口服施用200mg b.i.d.的替比法尼达4个连续日之后约2小时观察到的(表IV)(图4)。在29名受试者中t_max的范围为0.5至3小时；1名受试者最大浓度在8小时。4天b.i.d.口服给药之后，C_max和AUC_0-10h算术平均值(±SD，n＝24)分别为994±487ng/mL和3990±1671ng·h/mL。

当100mg剂量作2-小时静脉输注给予时，与200mg口服剂量相比，观察到更高的替比法尼血浆浓度(表IV)(图4)。平均地，当替比法尼作2-小时静脉输注施用时(100mg b.i.d.)，比当口服施用时(200mg b.i.d.)，C_max和AUC_0-10h值分别高出48.0％和19.3％(表IV)(图4)。90％置信区间落的上限在80％至125％的生物等效性范围之外。与口服施用之后相比，2-小时静脉输注之后观察到的更高暴露量不被认为是临床显著的。

口服施用(200mg b.i.d.)和连续静脉输注(每天200mg)之后第4天的平均AUC_0-10h值相似(表V)(图5)。90％置信区间的下限落在80％至125％的范围内；然而，扩大的上限稍微超出了这一范围(表V)(图5)。根据由AUC_0-10h测定的总全身暴露量，连续输注给药的效果与口服途径给药相似。然而，图形的形状是不同的，连续输注之后未出现替比法尼峰浓度。

剂量标准化之后，口服片剂制剂的平均绝对生物利用度(口服对2小时i.v.)为46.3％。类似地，口服片剂制剂的平均绝对生物利用度(口服对连续静脉输注)为40.9％。

作连续静脉输注(200mg/天)或者作2-小时静脉输注(100mg b.i.d.)施用之后，替比法尼全身暴露是可比的。此外，尽管血浆浓度-时间图的形状不同，平均AUC_0-10h值是相似的。90％置信区间的上限和下限(81.1％至100.3％)落在80％至125％的范围内。

总之，当该化合物作口服片剂(200mg b.i.d.)、经2-小时静脉输注(100mg b.i.d.)、或经连续静脉输注(200mg/天)施用时，由给药之后在10-小时间隔期间血浆AUC_0-10h所测定的替比法尼全身暴露量是可比的。通过3次治疗观察到平均AUC_0-10h值的狭窄范围(3990至4487ng·h/mL)。当考虑图形的形状时，2-小时静脉输注更加相似于口服施用。

血浆中替比法尼的蛋白结合

在全部分析的样品中，替比法尼广泛地与血浆蛋白结合(图2)。在连续静脉输注开始之后4小时抽取的血浆样品中，平均游离(未结合)分数为0.62％(范围为0.45至0.88％)。替比法尼的未结合分数不依赖于211ng/mL至812ng/mL范围内的总药物血浆浓度。从某些受试者在口服施用之后或2-小时静脉输注之后取得的样品，其蛋白结合没有可用的数据。然而，在200mg b.i.d.口服施用达4天之后在10小时给药间隔期间，中值血浆浓度在159ng/mL至788ng/mL的范围内。

血清白蛋白、α₁-酸糖蛋白和总蛋白的平均浓度(范围)分别为4.1g/100mL(3.1至4.7g/mL)、131mg/100mL(90至218mg/100mL)和6.8g/100mL(4.7至7.9g/mL)。

血浆中替比法尼的代谢产物

替比法尼代谢产物的血浆药代动力学是在口服片剂(200mg b.i.d.)、2-小时静脉输注(60和100mg b.i.d.)、或连续静脉输注(120和200mg/天)施用4天之后于第4、8和12天进行分析的。分析的代谢产物包括R130525、R101763、R104209、替比法尼-葡萄糖醛酸、R130525-葡萄糖醛酸、R104209-葡萄糖醛酸。这些代谢产物的化学结构已由Garner RC et al确证。在全身循环中观察到的主要代谢产物为R130525和替比法尼-葡萄糖醛酸(图3)。静脉途径测定的替比法尼的主要和次要代谢产物与口服施用的那些相同。

一般地，替比法尼-葡萄糖醛酸代谢产物的全身暴露量(C_max和AUC_0-10h)随静脉施用的替比法尼剂量的增加而增加(表VI)(图6)。平行比较在第12天替比法尼-葡萄糖醛酸代谢产物暴露量没有从前面11天施用累积(数据未显示)。替比法尼-葡萄糖醛酸相对于替比法尼的AUC_0-10h值的平均比值为：口服施用为18.6，100mg 2-小时静脉输注为7.5，200mg连续静脉输注为8.6。总体上，与静脉施用相比，口服给予替比法尼之后在血浆中葡萄糖醛酸对母体化合物的浓度比更高。这可能是由于通过肝脏的首过效应(即，母体化合物在全身吸收之前即损失)，此首过效应与经口服途径给药有关。

R130525代谢产物的全身暴露量(C_max和AUC_0-10h)随静脉施用的替比法尼剂量的增加而增加(表VII)(图7)。R130525相对于替比法尼的AUC_0-10h值的平均比值为：口服施用为五分之一，2-小时静脉输注和连续静脉输注约为十分之一。

口服施用200mg替比法尼之后，替比法尼的其它代谢产物也在血浆中测定，包括：R101763(C_max：14.8ng/mL，AUC_0-10h：101ng·h/mL)、R104209(C_max：69.7ng/mL，AUC_0-10h：447ng·h/mL)、R130525-葡萄糖醛酸(C_max：53.0ng/mL，AUC_0-10h：320ng·h/mL)、R10176-葡萄糖醛酸(C_max：12.0ng/mL，AUC_0-10h：63.9ng·h/mL)、R104209-葡萄糖醛酸(C_max：64.0ng/mL，AUC_0-10h：434ng·h/mL)。这些代谢物的浓度比R130525和替比法尼-葡萄糖醛酸的浓度更低。静脉施用之后这些代谢物的暴露量低于口服施用之后的暴露量。

临床评价

对全部受试者进行了毒性评价。一名受试者在3天之后发现她不符合本项研究资格而退出；没有不良事件的报道。一名受试者有骨髓增生异常综合征。此受试者有3-4级嗜中性白血球减少症的时期，通过剂量减少和推迟处理。血小板计数保持正常。未观察到明显的非血液学毒性。

在9/30名患者(30％)中观察到3或4级药物相关性血液学毒性嗜中性白血球减少症。在1名患者(3％)中观察到发热性嗜中性白血球减少症。主要的药物相关性非血液学毒性(主要是1级)为疲劳(60％)、恶心(40％)、食欲减退(20％)、呕吐(17％)和腹泻(13％)。在3名患者中观察到静脉炎，全部是通过外周小静脉途径IV推注给药；当使用中央静脉IV推注给药时未观察到静脉炎。

对31名受试者进行了有效性评价：MDS的受试者有8个月的血液学改善(血红蛋白持续增加，其根据International Working Group标准对MDS的应答)。未观察到客观的肿瘤应答，并且14名受试者疾病稳定达至少6个月。

讨论

“剂量确定″期的目的是确定替比法尼的静脉剂量方案，此方案将产生与200mg口服施用一天两次相比相似的暴露量。更一般地说，此目的是确定静脉剂量和时间表，此静脉剂量和时间表将提供如目前口服施用所产生的相似作用的充分暴露量。在低剂量静脉方案的第一组和第二组中，替比法尼的全身暴露量比200mg口服施用的全身暴露量低得多。在本项研究的“跨接”期，考虑到在这些低剂量方案之后没有剂量限制毒性，最后的静脉施用剂量被升高到100mg b.i.d.作2-小时输注和200mg/天作连续输注。

平均地，当替比法尼作口服片剂(200mg b.i.d.)、2-小时静脉输注(100mg b.i.d.)或连续静脉输注(200mg/天)施用时，替比法尼的暴露量(AUC_0-10h)是可比的并且在一狭窄的范围内(3990至4487ng·h/mL)。当考虑2个静脉方案的图形形状时，2小时输注更加接近于模仿的口服施用。

口服施用200mg替比法尼b.i.d.剂量之后，平均C_max和AUC_0-10h值分别为994ng/mL和3990ng·h/mL。这与前面口服施用150-和300-mg的替比法尼每天两次的研究非常符合(平均C_max分别为443和974；平均AUC_0-12h值分别为2495和4674ng·h/mL)。

在进食条件下施用替比法尼片剂的平均口服生物利用度为46.3％(就2-小时静脉输注b.i.d.而言)和40.9％(就连续静脉输注而言)。这些结果代表了近似绝对口服生物利用度，因为在最后药物施用之后血浆样品仅采集了10小时。然而，清楚的是，当与食物施用时替比法尼具有相对良好的生物利用度。

以前人体研究表明，替比法尼经过广泛代谢，并且未变化的母体化合物在血浆中占相对较小的组成。口服施用之后，未变化的替比法尼的浓度比未沉淀样品中的总放射性浓度低，平均为四十二分之一，并且比脱蛋白样品低，约为八分之一。在尿中没有未变化的药物排泄，并且在粪便(faces)中替比法尼回收低于7％的口服施用剂量。在本项研究中获得一致的结果。替比法尼-葡萄糖醛酸的血浆AUC_0-10h值比替比法尼高，是3-至30-倍。由于替比法尼在其结构中具有氨基和酮基，直接结合是可期待的。重要的是，用NIH 3T3H-ras细胞系和法呢基蛋白转移酶作体外研究表明，替比法尼的葡萄糖醛酸-代谢产物不是法呢基转移酶的抑制剂。在本项研究和以前的研究中，在患者血浆中测定了通过氧化生物转化形成的替比法尼的其它代谢产物，包括R130525和R104209及其各自的葡萄糖醛酸化结合物，以及R101763。

替比法尼的两种优势代谢产物即葡萄糖醛酸结合物和N-脱烷基化物R130525的暴露量随所施用的替比法尼静脉剂量的增加而增加。在所研究的剂量范围内这些途径显然未饱和。每一途径施用之后R130525的相对暴露量是可以比较的。相反，葡萄糖醛酸化代谢产物的血浆浓度在口服给药之后比静脉施用之后高，大约是2倍。口服施用之后在肝脏中的首过代谢期间更广泛的葡萄糖醛酸化最有可能解释替比法尼-葡萄糖醛酸相对浓度的这种途径-依赖性差异。此外，本项研究确证的代谢产物与施用途径无关。该结果还说明了首过代谢对每一代谢产物暴露量的代谢产物-特异性影响。

在此试验中，癌症患者离体测量的替比法尼的血浆蛋白结合值非常接近于用5名健康男子血浆样品体外试验获得的值(99.22％结合)。在此体外研究中，将来自这些健康受试者的空白血浆样品1000ng/mL的¹⁴C-替比法尼加强，并且测定方法与当前的试验中所使用的相同。替比法尼的体外血浆蛋白结合还与100至5000ng/mL范围内的总替比法尼浓度无关。

总之，2-小时静脉方案的血浆浓度-时间图形与口服施用之后的图形非常相似。替比法尼的全身暴露量当每天两次给予100mg作2-小时静脉输注或者经口服途径给予200mg时的给药之后最初10小时是可比的。没有与静脉替比法尼相关的罕见的不良事件。