传染性法氏囊病病毒DNA疫苗及其构建方法与流程

本发明涉及动物医药生物工程领域，具体而言，涉及一种传染性法氏囊病病毒DNA疫苗及其构建方法。

背景技术：

传染性法氏囊病(IBD)是一种主要危害青年鸡和雏鸡的急性、高度接触性、免疫抑制性传染病，侵害宿主法氏囊，破坏机体免疫系统，造成继发感染或对其他疫苗应答能力的减弱，严重危害家禽养殖业的生产和发展，是世界动物卫生组织(OIE)认定的B类疫病。20世纪80年代流行起来的致病力和抗原性大为不同的变异毒株和超强毒株，能突破传统疫苗和母源抗体的保护，使该病的防控形势更为严峻。在当前流行形势下，所有鸡群都必须免疫IBD疫苗，但由感染传染性法氏囊病病毒(IBDV)引起的高致死率或免疫失败时有发生，甚至部分鸡场反复使用活疫苗免疫仍然发病。一方面原因是我国IBD病原的复杂多变，另一方面原因是现行商品化疫苗对新出现的毒株提供的保护率低。

DNA疫苗是20世纪90年代发展起来的第三代疫苗，与传统疫苗相比，DNA疫苗成本低、方便构建多联苗、可以诱导机体的细胞免疫反应、免疫应答持续时间长，在传染性疾病的防治中显示出巨大的应用前景。IBDV VP2基因编码病原的主要结构和抗原蛋白VP2，目前研发的DNA疫苗或相关基因工程疫苗大多以VP2作为靶基因或靶蛋白，免疫后能起到一定效果，但效果有限，刺激动物机体产生抗体水平低、保护力较弱。

有鉴于此，特提出本发明。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供提供一种IBDV VP2、鸡Akirin2和鸡GM-CSF三基因共表达载体，可实现三种编码活性蛋白质的独立和等量表达、用作DNA疫苗时产生的免疫效果更好。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种传染性法氏囊病病毒DNA疫苗，所述DNA疫苗为包含IBDV VP2基因、鸡Akirin2基因和鸡GM-CSF基因的三基因共表达载体；

所述IBDV VP2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；

所述鸡Akirin2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；

所述鸡GM-CSF基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

其中所述IBDV VP2基因的序列根据美国国家生物技术信息中心选取的IBDV VP2(Genebank登录号AF508177)序列特定经过鸡的密码子偏好性进行了优化；所述鸡Akirin2基因和鸡GM-CSF基因分别取自Genebank登录号NM_001193595和Genebank登录号EU939770.1编码区，并去除了终止密码子后得到。

IBDV VP2基因编码病原的主要结构和抗原蛋白VP2，是研制IBD DNA疫苗的重要靶基因，免疫后能够产生保护力，其保护效果能够通过与免疫佐剂分子在宿主体内共表达而改善。Akirin2是脊椎动物天然免疫信号通路TLR所必须的核蛋白，调控依赖NF-κB的基因转录，在免疫和炎症反应中不可或缺，是极具潜力的分子佐剂。GM-CSF能活化树突状细胞，增强其抗原递呈能力，提高机体免疫应答水平，可用作DNA疫苗的分子佐剂。三种编码活性蛋白质的独立和等量表达、用作DNA疫苗时产生的免疫效果更强，具有很好的增效作用。

优选的，如上所述的传染性法氏囊病病毒DNA疫苗，在所述三基因共表达载体中，所述VP2基因、鸡Akirin2基因和鸡GM-CSF基因串联形成VP2-Akirin2-GM-CSF序列；每相邻两个基因之间由linker片段进行连接。

优选的，如上所述的传染性法氏囊病病毒DNA疫苗，所述linker片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

所述linker片段为F 2A连接肽编码基因，其为一种鸡密码子偏好的柔性的多肽。

优选的，如上所述的传染性法氏囊病病毒DNA疫苗，所述VP2-Akirin2-GM-CSF序列所插入的载体为pTriEx-4表达载体。

如上所述的传染性法氏囊病病毒DNA疫苗的构建方法，包括以下步骤：

1)、合成所述VP2-Akirin2-GM-CSF序列并将其连接到克隆载体上得到克隆载体重组质粒；

2)、将所述VP2-Akirin2-GM-CSF序列从所述克隆载体重组质粒上酶切下来，连接到经过相同酶切的表达载体pTriEx-4上，构建获得的新的重组质粒即为所述传染性法氏囊病病毒DNA疫苗。

本申请先将目的片段连接到克隆载体上，再酶切并与表达载体连接。此操作有主要两方面的原因：

进克隆载体比进表达载体容易很多，可以尽快拿到目的片段，一旦克隆不成功，或者因为Taq酶的错配出现了碱基突变，会需要重复几次，样本即耗材都会大量消耗；

克隆载体的最大优点是它一般都有成熟的筛选系统，这样在一些连接效率较低、特异性不强的时候容易筛选。

优选的，所述克隆载体为pUC57。

用于扩增权利要求1～4任一项所述的IBDV VP2基因、鸡Akirin2基因和鸡GM-CSF基因的引物对，优选的：

所述IBDV VP2基因的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示；

所述鸡Akirin2基因的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示；

所述鸡GM-CSF基因的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示。

用于扩增权利要求2～4任一项所述的VP2-Akirin2-GM-CSF序列的引物对，优选的，其上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:10所示。

含有如上所述的传染性法氏囊病病毒DNA疫苗的制剂。

优选的，如上所述的制剂，所述制剂的剂型为液体制剂，将所述DNA疫苗溶于PBS溶液中即得。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1)、能够利用一个载体实现对IBDV VP2、鸡Akirin2和鸡GM-CSF三种基因的独立、等量共表达。本发明利用连接肽F 2A串联三个基因插入到同一启动子之下，实现三基因共表达，避免了因启动子之间的相互抑制作用而可能导致的基因表达抑制的弊端。

2)、本发明将具有免疫佐剂效应的鸡Akirin2和鸡GM-CSF基因与IBDV抗原蛋白VP2编码基因重组在同一载体上共表达，作为DNA疫苗应用时，改善了VP2基因单独免疫产生IBD抗体水平低、提供的保护率低的状况，鸡Akirin2和鸡GM-CSF在生物学功能上形成协同效应，共同促进IBDV VP2基因诱导的抵抗IBDV感染的免疫应答能力。

3)、所述的DNA疫苗可根据实际情况采用适宜方式和适宜剂量导入鸡体，所述导入方法包括注射、基因枪等方式。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为三基因共表达载体pTVP2-Akirin2-GM-CSF的质粒图谱；

图2为VP2基因、Akirin2基因、GM-CSF基因和VP2-Akirin2-GM-CSF串联基因PCR扩增的电泳结果；M1：DNA Maker DL2000；1：VP2基因PCR扩增结果；2：Akirin2基因PCR扩增结果；3：GM-CSF基因PCR扩增结果；4：VP2-Akirin2-GM-CSF串联基因PCR扩增结果；M2：DNA Maker DL5000，图中箭头指向条带为VP2-Akirin2-GM-CSF基因；

图3为三基因共表达载体pTVP2-Akirin2-GM-CSF的SacⅠ/HindⅢ双酶切鉴定结果，M：DNA Maker DL15000；1：pTriEx-4质粒SacⅠ/HindⅢ双酶切鉴定结果；2：三基因共表达载体pTVP2-Akirin2-GM-CSF SacⅠ/HindⅢ双酶切鉴定结果；图中箭头指向为重组表达载体pTVP2-Akirin2-GM-CSF双酶切下来的VP2-Akirin2-GM-CSF串联基因；

图4为四种重组表达载体pTAkirin2、pTGM-CSF、pTVP2和pTVP2-Akirin2-GM-CSF在293T细胞中的表达产物的SDS-PAGE分析结果；M：蛋白Maker；1：pTAkirin2转染293T细胞后表达产物的SDS-PAGE分析；2：pTGM-CSF转染293T细胞后表达产物的SDS-PAGE分析；3：pTVP2转染293T细胞后表达产物的SDS-PAGE分析；4：pTVP2-Akirin2-GM-CSF转染293T细胞后表达产物的SDS-PAGE分析；5：正常293T细胞表达产物的SDS-PAGE分析；图中箭头指向由上到下依次是VP2蛋白、Akirin2蛋白和GM-CSF蛋白；

图5为用IBD标准阳性血清(购自中国兽医药品监察所)鉴定重组表达载体pTVP2和pTVP2-Akirin2-GM-CSF在293T细胞中的表达产物的Western blot分析结果，1：pTVP2转染293T细胞后表达产物的Western blot分析结果；2：pTVP2-Akirin2-GM-CSF转染293T细胞后表达产物Western blot分析结果；3：正常293T细胞表达产物Western blot分析结果。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1三基因共表达载体pTVP2-Akirin2-GM-CSF的构建

1)、根据美国国家生物技术信息中心中的IBDV VP2(Genebank登录号AF508177)、鸡Akirin2(Genebank登录号NM_001193595)和鸡GM-CSF(Genebank登录号EU939770.1)三基因编码区进行序列优化后串联；优化方法为，去掉后两个基因的终止密码子，且对IBDV VP2基因进行鸡的密码子偏好性优化。最终得到的IBDV VP2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；鸡Akirin2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；鸡GM-CSF基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

将上述最终得到的IBDV VP2基因、鸡Akirin2基因和鸡GM-CSF基因串联形成VP2-Akirin2-GM-CSF序列；每相邻两个基因之间由linker片段进行连接。linker序列为连接肽F 2A编码基因，核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，串联基因克隆到pUC57质粒，获得VP2-Akirin2-GM-CSF-pUC57重组质粒；

VP2-Akirin2-GM-CSF-pUC57重组质粒基因序列委托苏州金维智生物科技有限公司合成，经测序正确，质粒置于-20℃保存，菌种添加15％无菌甘油冻存于-80℃。

2)根据VP2-Akirin2-GM-CSF-pUC57基因序列，分别设计SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10六条引物，引物序列如下：

SEQ ID NO:5：5’TTTGAGCTCATGACCAACCTCCAAGACCAG3’

(下划线部分为Sac I酶切位点)；

SEQ ID NO:6：5’CCCAAGCTTACGGAGGGCACGAATGATGTC3’

(下划线部分为HindⅢ酶切位点)；

SEQ ID NO:7：5’TTTGAGCTCATGGCTTGTGGTGCCACTCTC3’

(下划线部分为Sac I酶切位点)；

SEQ ID NO:8：5’CCCAAGCTTGGACACGTAGGAGGCGGGCTG3’

(下划线部分为HindⅢ酶切位点)

SEQ ID NO:9：5’CGCGAGCTCATGCATCACCATCACCATCAC3’

(下划线部分为Sac I酶切位点)

SEQ ID NO:10：5’-CCCAAGCTTTTAGATGCAATCTTTTTCTTC-3’

(下划线部分为HindⅢ酶切位点)

上述六条引物委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

3)PCR扩增体系和反应程序：

A、采用50μL PCR反应体系，包括：Premix Taq(5U/μL)25μL、VP2-Akirin2-GM-CSF-pUC-57(20ng/μL)5μL、上下游引物(20μM)各2.5μL，最后用ddH₂O补足至50μL；

B、采用50μL体系在BioRad PCR仪上进行PCR扩增，反应程序为：95℃3min；95℃30s，56℃30s，72℃2min 20s，35个循环；72℃10min；

C、SEQ ID NO:5/SEQ ID NO:6引物配对扩增VP2基因，SEQ ID NO:7/SEQ ID NO:8引物配对扩增Akirin2基因，SEQ ID NO:9/SEQ ID NO:10引物配对扩增GM-CSF基因，SEQ ID NO:5/SEQ ID NO:10引物配对扩增VP2-Akirin2-GM-CSF串联基因。各基因的扩增结果如图2所示，琼脂糖凝胶电泳显示大小分别为1374bp、591bp、453bp和2532bp。

4)、将3)中扩增后的产物用琼脂糖凝胶电泳回收大小为2532bp的条带并纯化，获得目的基因。

5)、将4)中回收到的目的基因和pTriEx-4载体分别进行SacⅠ和HindⅢ双酶切：

I、目的基因双酶切体系如下：PCR回收产物16μL，10×M buffer 2μL，SacⅠ1μL，HindⅢ1μL；

II、pTriEx-4载体双酶切体系如下：pTriEx-4载体0.5μg，10×M buffer2μL，SacⅠ1μL，HindⅢ1μL，最后用ddH₂O补足至20μL；

III、上述双酶切反应均在37℃水浴反应2h；

IV、回收I中的双酶切产物和II中的pTriEx-4载体双酶切大片段。

6)、将5)中双酶切产物和pTriEx-4载体双酶切大片段连接，连接反应在16℃反应过夜，连接反应体系如下：目的基因双酶切回收产物6μL，pTriEx-4载体双酶切大片段回收产物2μL，10×Ligase Buffer 1μL，T4DNA Ligase 1μL。

7)、将6)中所得连接产物与100μL大肠杆菌DH5α感受态混匀后冰浴30min，42℃热激90s，立即置冰上放置10min，加入预热至室温的900μL LB液体培养基，150rpm在37℃恒温摇床培养1h，5000rpm离心1min，弃去900μL培养上清，剩余100μL用移液器混匀后均匀涂布于含100μg/mL Amp的LB固体培养基平板上，37℃恒温培养箱倒置培养过夜；

8)、在7)中倒置培养过夜后的培养基平板上挑取单菌落接种于5mL含100μg/mL Amp的LB液体培养基中，200rpm在37℃恒温摇床培养过夜，用小量质粒抽提试剂盒抽提质粒(购自Omega Bio-Tek)，所得质粒用SacⅠ和HindⅢ进行双酶切鉴定，鉴定结果如图3所示，将鉴定正确的重组克隆进行测序验证，验证正确的质粒命名为pTVP2-Akirin2-GM-CSF，其质粒图谱为图1所示。

9)、将8)中所得含有质粒pTVP2-Akirin2-GM-CSF的大肠杆菌扩增后用去内毒素质粒提取试剂盒(购自Omega Bio-Tek)提取纯化，用微量分光光度计进行定量，然后用PBS调整DNA浓度为1000ng/μL。

实施例2三基因共表达载体pTVP2-Akirin2-GM-CSF有效性的验证

1)将pTVP2-Akirin2-GM-CSF与适量Lipofectamine LTX(购自Invitrogen)充分混匀后加入铺有293T细胞的细胞培养板中，利用空载体(pTriEx-4)和三种单基因重组表达载体pTVP2、pTAkirin2、pTGM-CSF(本申请人自行构建并测序正确)同时进行相应的对照实验。

2)于48h后收集所培养的细胞，细胞裂解破碎后，分别检测表达VP2、Akirin2和GM-CSF三种蛋白的有效性，进一步证实pTVP2-Akirin2-GM-CSF能在293T细胞中表达目标蛋白，检测结果如图4和图5所示。从图4可知，三种蛋白均有表达，且表达量大致相等。

实施例3动物实验

1)、将14日龄SPF白来航鸡(购自广东温氏大华农生物科技有限公司禽蛋分公司)进行随机分组，共分为7组，每组20羽，具体分组情况见表1：

表1动物实验分组和注射DNA情况

将实施例1中所得DNA浓度均为1000ng/μL的pTVP2-Akirin2-GM-CSF质粒溶液和pTVP2、pTAkirin2、pTGM-CSF、pTriEx-4四种对照质粒溶液200μL对14日龄SPF白来航鸡进行腿部肌肉两点注射，并记做第0天，于第14天进行同样处理加强免疫。每天观察各组鸡的变化情况(采食活动、精神状态等)。于第28天，除空白对照组1外，其余各组均经口感染IBDV BC6/85病毒(接种量为2×10⁴BID₅₀/羽)，记录各组死亡情况。于第32天将存活鸡只全部处死并剖检，检查法氏囊的病变情况，法氏囊发黄、脓肿或萎缩视为发病，法氏囊外观粉红视为正常。实验过程中于第0天、第14天、第28天和第32天各组随机取5羽鸡进行翅下静脉采血检测血清IBD特异性抗体滴度(ELISA检测试剂盒购自BioChek，TITER＞391为阳性)和IBDV中和抗体滴度(固定病毒-血清稀释法)，并检测第28天各组实验鸡外周血淋巴细胞增殖能力(MTT法检测，其值表示为与空白对照组1均值的相对值)。

2)、结果

SPF鸡注射相应DNA后，直至攻毒前，其状态未见异常，说明该重组DNA对鸡体的正常生理活动无影响。在第14天对照实验组1和实验组4(即本发明实施例1得到的pTVP2-Akirin2-GM-CSF质粒注射组)血清中检测到特异性IBD抗体和IBDV中和抗体，第28天抗体滴度得到明显提高，并且实验组4抗体滴度极显著高于实验组1(p＜0.01)，结果见表2和表3。

表2实验鸡免疫后血清IBD抗体滴度参数(TITER)变化

表3实验鸡免疫后血清IBDV中和抗体滴度参数(TITER)变化

第28天该两组鸡外周血淋巴细胞增殖能力均增强，极显著高于其余各对照实验组(p＜0.01)，并且实验组4的外周血淋巴细胞增殖能力极显著高于对照实验组1(p＜0.01)，结果见表4。

表4第28天实验鸡外周血淋巴细胞增殖能力的相对值

于第28天进行攻毒实验，对照实验组1和实验组4结果与其余各攻毒组相比，鸡只死亡量和法氏囊病变量均明显减少，实验组4存活保护率达到100％，病变保护率达到85％，其免疫效果要优于实验组1(存活保护率达到95％，病变保护率达到55％)，见表5。

表5免疫鸡攻毒后存活、剖检情况表

上述数据充分说明三基因共表达载体pTVP2-Akirin2-GM-CSF作为DNA疫苗免疫后能够诱导宿主产生体液免疫应答和细胞免疫应答，其应答水平明显高于免疫单基因表达载体pTVP2，产生的抗体抵抗IBDV BC6/85毒株感染的能力更强。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。