小分子‑高分子轭合物自组装载药纳米颗粒及其制备方法与流程

本发明属于化学与生物医药的交叉领域，尤其涉及一种小分子-高分子轭合物自组装载药纳米颗粒及其制备方法。

背景技术：

一氧化氮(NO)是一种化学性质非常活泼的自由基气体，在机体的生理和病理过程中起着信使分子和调节因子的作用。NO可以参与和调节与肿瘤的发生发展相关的细胞凋亡、细胞周期、血管生成、转移和侵入等。已有研究表明，将NO与抗癌药物共同作用于肿瘤细胞，可明显提高抗癌药物对肿瘤细胞的杀灭效果，因为一定浓度的NO可以抑制肿瘤细胞P-糖蛋白(P-gp)的过度表达，从而降低多药耐药性(MDR)，提高肿瘤细胞内的药物浓度。此外，高浓度的NO可以与抗癌药物协同杀灭肿瘤细胞。因此，将NO与传统抗癌药物相结合，有望实现对肿瘤的协同治疗。

纳米尺度的药物运输载体具有增加小分子抗癌药物的生物相容性、延长药物在血液中的循环时间、减小药物毒副作用以及提高药物在肿瘤部位的富集等诸多优点，从而达到提高药物疗效的目的。然而，大多数药物载体本身并没有治疗效果，且大量引入可能会产生各种难以预料的问题，如对正常组织的毒性，引发炎症等。如何将抗癌药与NO高效地负载在一种载体上，获得能够同时释放抗癌药和一氧化氮以实现协同治疗肿瘤的纳米药物载体，是亟待解决的关键技术问题。

目前尚未见同时负载抗癌药和一氧化氮前体药、能够在肿瘤细胞中同时释放抗癌药和一氧化氮的小分子-高分子轭合物自组装纳米颗粒的相关专利报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服上述现有技术存在的不足，提供一种操作简单，成本较低，产物在体内可以稳定地输送至肿瘤组织，在肿瘤细胞内酸性环境的刺激下能够同时分解释放抗癌药和一氧化氮对肿瘤进行协同治疗，从而在肿瘤治疗领域有着良好的应用前景的小分子-高分子轭合物自组装载药纳米颗粒及其制备方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

第一方面，本发明涉及一种小分子-高分子轭合物自组装载药纳米颗粒的制备方法，将亲水性小分子抗癌药和生物相容高分子的高分子链连接形成自组装纳米胶束，同时利用疏水相互作用包裹一氧化氮前体药物于生物相容高分子的高分子链段中，得到具有酸敏感性的载药纳米颗粒。

优选地，所述亲水性小分子抗癌药和生物相容高分子的高分子链通过酯键或酰胺键连接形成自组装纳米胶束。

优选地，所述方法包括如下步骤：

S1、在室温下将生物相容高分子溶于二氯甲烷或三氯甲烷中，加入碳二亚胺和三乙胺，得到生物相容高分子浓度为20～100μmol/mL的混合液，然后在冰浴中搅拌15～60分钟；

S2、将亲水性小分子抗癌药和4-二甲氨基吡啶溶于二氯甲烷或三氯甲烷中，室温下搅拌混匀，得到亲水性小分子抗癌药浓度为20～100μmol/mL的溶液A；

S3、将一氧化氮前体药溶于二氯甲烷或三氯甲烷中，室温下搅拌混匀，得到一氧化氮前体药浓度为20～20 0μmol/mL的溶液B；

S4、将所述混合液、溶液A、溶液B混合，在室温、避光条件下搅拌反应24～72小时；将反应产物过滤、室温下真空干燥，色谱柱提纯，即得所述小分子-高分子轭合物自组装载药纳米颗粒。

本发明中，溶液A中亲水性小分子抗癌药浓度为20～100μmol/mL，溶液B的一氧化氮前体药浓度为20～20 0μmol/mL。溶液A的浓度若低于上述限定浓度范围，反应效率太低，产率相应的也低；若高于限定浓度范围，会造成生物相容高分子无法充分溶解，影响反应的进行。溶液A的浓度与混合液浓度相匹配。溶液B的浓度若低于上述限定浓度范围，则一氧化氮前体药物难以包裹在自组装纳米颗粒中；若高于限定浓度范围，则一氧化氮前体药物难以充分溶解。在本发明中，溶液B的一氧化氮前体药浓度更优选为50～100μmol/mL。

步骤S1中，限定了“冰浴中搅拌15～60分钟”。原因在于：冰浴的温度是反应需要的温度，搅拌时间若少于15分钟，会使混合不够均匀；而多于60分钟没有必要，在时间和成本上是一种浪费。

步骤S4中限定了“室温、避光条件下搅拌反应24～72小时”。原因在于：室温是合适的反应温度中最容易实现、能耗最低的。避光是步骤S4中反应的必需条件，如不避光，将无法得到目标产物。搅拌反应24～72小时，若少于24小时，反应不充分，将得不到目标产物；多于60分钟没有必要，在时间和成本上是一种浪费。

优选地，步骤S1中，碳二亚胺、三乙胺与二氯甲烷或三氯甲烷的用量比为0.4～0.75mmol∶0.3～0.5mmol∶10mL。

优选地，步骤S2中，4-二甲氨基吡啶与二氯甲烷或三氯甲烷的用量比为0.2～0.375mmol∶10mL。

优选地，所述生物相容高分子为乳酸与己内酯的共聚物、聚乳酸或聚己内酯。

优选地，所述生物相容高分子的重均分子量为1000～10000。

优选地，所述亲水性小分子抗癌药为吉西他滨、氟脲苷或伊立替康。

优选地，所述一氧化氮前体药为偶氮烯翁二醇类化合物。

优选地，所述碳二亚胺为N，N′-二异丙基碳二亚胺、N，N′-二环己基碳二亚胺或1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺。

第二方面，本发明还涉及一种前述的制备方法制得的小分子-高分子轭合物自组装载药纳米颗粒。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1、制备方法简单，效率高，成本低；

2、制备的小分子-高分子轭合物自组装载药纳米颗粒在正常体内环境中十分稳定，生物相容性好；

3、制备的小分子-高分子轭合物自组装载药纳米颗粒在肿瘤细胞内环境中能够同时释放抗癌药和一氧化氮，实现对肿瘤的协同治疗，提高治疗效果。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为本发明的小分子-高分子轭合物自组装载药纳米颗粒的制备过程示意图；

图2为本发明的小分子-高分子轭合物自组装载药纳米颗粒的透射电子显微镜照片；

图3为伊立替康-聚己内酯轭合物自组装载药纳米颗粒的核磁共振¹H NMR谱图；

图4为伊立替康-聚乳酸轭合物自组装载药纳米颗粒的粒径分布图；

图5为伊立替康-聚乳酸轭合物自组装载药纳米颗粒在模拟正常体内环境(37℃，pH7.4)条件下的尺寸稳定性示意图；

图6为伊立替康-聚乳酸轭合物自组装载药纳米颗粒在模拟正常体内环境(37℃，pH7.4)中释放伊立替康抗癌药的浓度示意图；

图7为伊立替康-聚乳酸轭合物自组装载药纳米颗粒在模拟正常体内环境(37℃，pH7.4)中释放一氧化氮的浓度示意图；

图8为伊立替康-聚乳酸轭合物自组装载药纳米颗粒在模拟肿瘤细胞内环境中释放伊立替康的情况示意图；

图9为伊立替康-聚乳酸轭合物自组装载药纳米颗粒在模拟肿瘤细胞内环境中释放一氧化氮的情况示意图；

图10为不同浓度下伊立替康-聚乳酸轭合物自组装载药纳米颗粒对MCF-7/ADR肿瘤细胞的杀灭效果示意图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。

实施例1

本实施例涉及一种小分子-高分子轭合物自组装载药纳米颗粒及其制备方法，包括以下步骤：

如图1所示，为本发明小分子-高分子轭合物自组装载药纳米颗粒的制备过程示意图。在室温下将2mmol聚乳酸溶于40mL二氯甲烷中，并加入2.8mmol N，N′-二异丙基碳二亚胺和2mmol三乙胺，得到聚乳酸浓度为50μmol/mL的混合液，然后在冰浴中搅拌40分钟；将2mmol氟脲苷和1.5mmol 4-二甲氨基吡啶溶于40mL二氯甲烷中，室温下搅拌混匀，得到氟脲苷浓度为50μmol/mL的溶液；将0.4mmol丙烯酸酯偶氮烯翁二醇溶于5mL二氯甲烷中，室温下搅拌混匀，得到浓度为80μmol/mL的溶液；将上述三种溶液混合在一起，在室温、避光条件下搅拌反应48小时，将反应产物过滤、室温下真空干燥，经色谱柱提纯，得到氟脲苷-聚乳酸轭合物自组装载药纳米颗粒，其透射电子显微镜照片如图2所示；由图2可知，该自组装载药纳米颗粒呈近似球状，粒径约为80纳米。

实施例2

本实施例涉及一种小分子-高分子轭合物自组装载药纳米颗粒及其制备方法，包括以下步骤：

在室温下将1.5mmol聚己内酯溶于50mL三氯甲烷中，并加入2mmol N，N′-二环己基碳二亚胺和1.5mmol三乙胺，得到聚乳酸浓度为30μmol/mL的混合液，然后在冰浴中搅拌30分钟；将1.5mmol伊立替康和1mmol4-二甲氨基吡啶溶于50mL二氯甲烷中，室温下搅拌混匀，得到伊立替康浓度为30μmol/mL的溶液；将0.3mmol丙烯酸酯偶氮烯翁二醇溶于5mL二氯甲烷中，室温下搅拌混匀，得到浓度为60μmol/mL的溶液；将上述三种溶液混合在一起，在室温、避光条件下搅拌反应36小时，将反应产物过滤、室温下真空干燥，经色谱柱提纯，得到伊立替康-聚己内酯轭合物自组装载药纳米颗粒，其核磁共振¹H NMR谱图如图3所示。

实施例3

本实施例涉及一种小分子-高分子轭合物自组装载药纳米颗粒及其制备方法，包括以下步骤：

在室温下将1mmol(乳酸-己内酯)共聚物溶于25mL三氯甲烷中，并加入1mmol 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和0.75mmol三乙胺，得到(乳酸-己内酯)共聚物浓度为40μmol/mL的混合液，然后在冰浴中搅拌60分钟；将1mmol吉西他滨和0.7mmol4-二甲氨基吡啶溶于25mL三氯甲烷中，室温下搅拌混匀，得到吉西他滨浓度为40μmol/mL的溶液；将0.3mmol O²-乙烯基偶氮烯翁二醇溶于6mL三氯甲烷中，室温下搅拌混匀，得到浓度为50μmol/mL的溶液；将上述三种溶液混合在一起，在室温、避光条件下搅拌反应54小时，将反应产物过滤、室温下真空干燥，经色谱柱提纯，得到吉西他滨-(乳酸-己内酯)共聚物轭合物自组装载药纳米颗粒。

实施例4

本实施例涉及一种小分子-高分子轭合物自组装载药纳米颗粒及其制备方法，包括以下步骤：

在室温下将2.4mmol聚己内酯溶于60mL二氯甲烷中，并加入3mmol N，N′-二环己基碳二亚胺和2.4mmol三乙胺，得到聚己内酯浓度为40μmol/mL的混合液，然后在冰浴中搅拌50分钟；将2.4mmol吉西他滨和1.8mmol 4-二甲氨基吡啶溶于60mL二氯甲烷中，室温下搅拌混匀，得到吉西他滨浓度为40μmol/mL的溶液；将0.5mmol JS-K溶于10mL二氯甲烷中，室温下搅拌混匀，得到浓度为50μmol/mL的溶液；将上述三种溶液混合在一起，在室温、避光条件下搅拌反应72小时，将反应产物过滤、室温下真空干燥，经色谱柱提纯，得到吉西他滨-聚己内酯轭合物自组装载药纳米颗粒。

实施例5

本实施例涉及一种小分子-高分子轭合物自组装载药纳米颗粒及其制备方法，包括以下步骤：

在室温下将2mmol(乳酸-己内酯)共聚物溶于50mL二氯甲烷中，并加入2.8mmol1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和2mmol三乙胺，得到(乳酸-己内酯)共聚物浓度为40μmol/mL的混合液，然后在冰浴中搅拌30分钟；将2mmol氟脲苷和1.5mmol 4-二甲氨基吡啶溶于50mL二氯甲烷中，室温下搅拌混匀，得到氟脲苷浓度为40μmol/mL的溶液；将0.5mmol JS-K溶于10mL二氯甲烷中，室温下搅拌混匀，得到浓度为50μmol/mL的溶液；将上述三种溶液混合在一起，在室温、避光条件下搅拌反应54小时，将反应产物过滤、室温下真空干燥，经色谱柱提纯，得到氟脲苷-(乳酸-己内酯)共聚物轭合物自组装载药纳米颗粒。

实施例6

本实施例涉及一种小分子-高分子轭合物自组装载药纳米颗粒及其制备方法，包括以下步骤：

(1)在室温下将3mmol聚乳酸溶于60mL三氯甲烷中，并加入4.5mmol N，N′-二异丙基碳二亚胺和3mmol三乙胺，得到聚乳酸浓度为50μmol/mL的混合液，然后在冰浴中搅拌30分钟；

(2)将3mmol伊立替康和2mmol 4-二甲氨基吡啶溶于60mL三氯甲烷中，室温下搅拌混匀，得到伊立替康浓度为50μmol/mL的溶液；

(3)将0.5mmol O²-乙烯基偶氮烯翁二醇溶于5mL三氯甲烷中，室温下搅拌混匀，得到浓度为100μmol/mL的溶液；

(4)将上述三种溶液混合在一起，在室温、避光条件下搅拌反应72小时；

(5)将反应产物过滤、室温下真空干燥，经色谱柱提纯，得到伊立替康-聚乳酸轭合物自组装载药纳米颗粒。

图4为伊立替康-聚乳酸轭合物自组装载药纳米颗粒的粒径分布图，由图4可知，伊立替康-聚乳酸轭合物自组装载药纳米颗粒的平均粒径为82.3纳米；多分散指数为0.165。

图5为伊立替康-聚乳酸轭合物自组装载药纳米颗粒在模拟正常体内环境条件下的尺寸稳定性示意图；由图5可知，伊立替康-聚乳酸轭合物自组装载药纳米颗粒在模拟正常体内环境条件下(37℃，pH 7.4)经过72小时尺寸仍保持稳定。图6为伊立替康-聚乳酸轭合物自组装载药纳米颗粒在模拟正常体内环境中释放抗癌药的浓度示意图；由图6可知，伊立替康-聚乳酸轭合物自组装载药纳米颗粒在模拟正常体内环境中释放抗癌药的量极低，说明其在正常体内环境中很稳定，对正常组织毒性极低。图7为伊立替康-聚乳酸轭合物自组装载药纳米颗粒在模拟正常体内环境中释放一氧化氮的浓度示意图；由图7可知，伊立替康-聚乳酸轭合物自组装载药纳米颗粒在模拟正常体内环境中释放一氧化氮的浓度极低，说明其在正常体内环境中很稳定，对正常组织毒性极低。可见，本发明的自组装载药纳米颗粒在正常体内环境中十分稳定，生物相容性好。

图8为伊立替康-聚乳酸轭合物自组装载药纳米颗粒在模拟肿瘤细胞内环境中释放伊立替康的情况示意图；图9为伊立替康-聚乳酸轭合物自组装载药纳米颗粒在模拟肿瘤细胞内环境中释放一氧化氮的情况示意图；图10为不同浓度下伊立替康-聚乳酸轭合物自组装载药纳米颗粒对MCF-7/ADR肿瘤细胞的杀灭效果，以单独使用伊立替康的情况作为对照，实验时间为48小时。由图8、9、10可知，本发明的小分子-高分子轭合物自组装载药纳米颗粒在肿瘤细胞内环境中能够同时释放抗癌药和一氧化氮，实现对肿瘤的协同治疗，有效降低肿瘤细胞的多药耐药性、提高治疗效果。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。