大豆苷元与10‑羟基喜树碱的药物组合及其应用的制作方法

本发明涉及一种抗肿瘤药物组合物，具体涉及大豆苷元与10-羟基喜树碱的药物组合物及其在制备治疗肺癌、胰腺癌、结肠癌、肝癌、前列腺癌、肾癌、胃癌、脑瘤、肉瘤、卵巢癌或乳腺癌的药物中的应用。

背景技术：

随着人们生活水平的日益提高，癌症的发病率也在逐年递增，癌症已成为威胁人类健康和生命的一大杀手。世界卫生组织的一项研究报告表明，今后20年，新发肿瘤患者人数将由目前每年1000万增加到1500万。每年因恶性肿瘤而死亡的人数也将由600万增至1000万。据2015年中国癌症报告显示，中国2015年有超过280万人死于癌症，平均每天7500人。除肺癌外，胃癌、肝癌、食道癌和结肠癌也是中国男性和女性中最常见的癌症。在中国癌症已经成为疾病死因之首，且发病率和死亡率都在不断攀升，对公众健康造成了巨大威胁。因此，癌症的治疗成为亟待解决问题。目前治疗癌症的方法主要有手术、放疗及化疗，其中最常用的还是化疗，但多数化疗药物本身的溶解性差，毒副作用强，作用靶点单一，易产生耐药性，从而限制了其临床应用。因此如何提高这些化疗药物的药效，同时减少其毒副作用，是目前急需解决的问题。而为达到这一目的，最有效的方法就是通过使化疗药物与低毒或无毒的药物联合使用，从而达到协同抗肿瘤的作用。

10-羟基喜树碱是从我国特有且资源十分丰富的喜树中分离出的抗癌作用很强的微量生物碱之一。它是一种细胞周期特异性药物，主要作用于S期癌细胞，通过抑制拓扑异构酶I的活性而使DNA断裂，从而抑制细胞增殖。该药对多种人体恶性肿瘤细胞如胃癌、肝癌、直肠癌等均具有杀伤作用。此外，这类药物与其它常用的抗癌药无交叉耐药，因此对耐药肿瘤有治疗作用。但其溶解性差，且易引起毒副作用等缺点限制了其临床应用。为了解决这些问题，本研究利用其与其他低毒药物进行联合，从而达到减毒增效的效果。

大豆苷元为白色粉末，主要来源于豆科植物红车轴草全草、紫苜蓿全草、葛根、大豆的种子。研究显示其具有扩张血管，增加冠脉流量，降低血压，减慢心律和降低心肌耗氧量及抗心律失常、抑菌，雌激素样作用、治疗更年期综合症、抗骨质疏松、抗癌等作用，但大豆苷元单药抗癌作用极弱，使用高剂量的大豆苷元才会能起到抗癌效果，因此使用大豆苷元单药抗癌并不现实。目前临床上多用于治疗妇女更年期综合症、心脏病、心血管病、骨质疏松等。此外因其毒性极低，价格低廉，具有广泛的应用前景。

到目前为止，关于在抗肿瘤中联合使用10-羟基喜树碱和大豆苷元以及二者在抗肿瘤中的协同作用还未见报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种高活性的抗肿瘤药物组合物及其在制备治疗各类癌症的药物中的应用。

本发明的抗肿瘤药物组合物含有10-羟基喜树碱与大豆苷元。

10-羟基喜树碱、大豆苷元及葛根素的结构式如Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ所示。

10-羟基喜树碱与大豆苷元的摩尔比优选为0.05～2:1。

本发明所述的抗肿瘤药物组合物，优选的情况下，所述10-羟基喜树碱与大豆苷元的有效浓度分别为0.3～25μM和5～20μM；更优选的情况下，则分别为3～13μM和6～16μM。

本发明所述的抗肿瘤药物组合物，优选的情况下，所述10-羟基喜树碱与大豆苷元的稀释溶剂为二甲基亚砜或乙醇。

本发明的抗肿瘤药物组合物可应用于治疗各类肿瘤，所述肿瘤包括但不限于肺癌、胰腺癌、结肠癌、肝癌、前列腺癌、肾癌、胃癌、脑瘤、肉瘤、卵巢癌或乳腺癌。

所述的抗肿瘤药物组合物的应用，优选的情况下，所述大豆苷元与10-羟基喜树碱同时添加；更优选的情况下，同时添加后作用30～50h。

本发明的抗肿瘤药物组合物可采用本领域常规的方法制成适于胃肠道给药或非胃肠道给药的制剂，优选将该药物组合物制成胃肠道给药的制剂，其制剂形式可以为常规片剂、胶囊、控释或缓释制剂。

本发明抗肿瘤药物组合物中的10-羟基喜树碱和/或其衍生物与大豆苷元和/或其衍生物可以直接混合做成制剂；或分别和相应的辅料混合分别做成制剂，然后再按照本领域常规的方式包装或结合在一起；或分别和相应的辅料混合后，再混合做成制剂。制剂使用的辅料可采用本领域常规的辅料，但以不和本发明药物组合物发生反应或不影响本发明药物组合物的疗效为前提。

根据制剂形式和制剂规格的不同，本发明药物组合物在制剂中的含量可在1-99wt％之间进行调整，优选10-90wt％。此外，本发明药物组合物的给药剂量可根据给药对象、给药途径或药物的制剂形式进行适当变化，但以保证该药物组合物在哺乳动物体内能够达到有效的血药浓度为前提。

本发明的药物组合物在治疗胃癌、乳腺癌、肝癌等中具有显著的协同效用，提高了药物的疗效，降低了用药剂量，减少了副作用的发生。

附图说明

图1是展示两药单用时不同浓度对MCF7细胞增殖抑制与拟合方程的图；其中：A：大豆苷元对MCF7细胞增殖抑制图；B：根据大豆苷元的给药剂量与乳腺癌MCF7细胞存活率之间的关系进行拟合得到的直线图；C：10-羟基喜树碱对MCF7细胞增殖抑制图；D：根据10-羟基喜树碱的给药剂量与MCF7细胞存活率之间的关系进行拟合得到的直线图；

图2是展示10-羟基喜树碱与大豆苷元合用时不同浓度与不同加药时间对MCF7细胞增殖抑制的图；其中：显著性分析是以每组只加HCPT药物为对照，若P<0.05，则为显著，表示为“*”；若P<0.01，则为极显著，表示为“**”。

图3是展示两药单用时不同浓度对胃癌BGC823细胞增殖抑制与拟合方程的图；其中：A：大豆苷元对BGC823细胞增殖抑制图；B：根据大豆苷元的给药剂量与BGC823细胞存活率之间的关系进行拟合得到的直线图；C：10-羟基喜树碱对BGC823细胞增殖抑制图；D：根据10-羟基喜树碱的给药剂量与BGC823细胞存活率之间的关系进行拟合得到的直线图；

图4是展示10-羟基喜树碱与大豆苷元合用时不同浓度与不同加药时间对BGC823细胞增殖抑制的图；其中：显著性分析是以每组只加HCPT药物为对照，若P<0.05，则为显著，表示为“*”；若P<0.01，则为极显著，表示为“**”。

图5是展示两药单用时不同浓度对肝癌HepG2细胞增殖抑制与拟合方程的图；其中：A：大豆苷元对HepG2细胞增殖抑制图；B：根据大豆苷元的给药剂量与HepG2细胞存活率之间的关系进行拟合得到的直线图；C：10-羟基喜树碱对HepG2细胞增殖抑制图；D：根据10-羟基喜树碱的给药剂量与HepG2细胞存活率之间的关系进行拟合得到的直线图；

图6是展示10-羟基喜树碱与大豆苷元合用时不同浓度与不同加药时间对HepG2细胞增殖抑制的图；其中：显著性分析是以每组只加HCPT药物为对照，若P<0.05，则为显著，表示为“*”；若P<0.01，则为极显著，表示为“**”。

图7是展示两药单用时不同浓度对结肠癌Caco2细胞增殖抑制与拟合方程的图；其中：A：大豆苷元对Caco2细胞增殖抑制图；B：根据大豆苷元的给药剂量与Caco2细胞存活率之间的关系进行拟合得到的直线图；C：10-羟基喜树碱对Caco2细胞增殖抑制图；D：根据10-羟基喜树碱的给药剂量与Caco2细胞存活率之间的关系进行拟合得到的直线图；

图8是展示10-羟基喜树碱与大豆苷元合用时不同浓度与不同加药时间对Caco2细胞增殖抑制的图；其中：显著性分析是以每组只加HCPT药物为对照，若P<0.05，则为显著，表示为“*”；若P<0.01，则为极显著，表示为“**”。

图9是展示葛根素单用时不同浓度对MCF7细胞增殖抑制与拟合方程的图；其中：A：葛根素对MCF7细胞增殖抑制图；B：根据葛根素的给药剂量与MCF7细胞存活率之间的关系进行拟合得到的直线图；

图10是展示10-羟基喜树碱与葛根素合用时不同浓度与不同加药时间对MCF7细胞增殖抑制的图；其中：显著性分析是以每组只加HCPT药物为对照，若P<0.05，则为显著，表示为“*”；若P<0.01，则为极显著，表示为“**”。

各图中，Daidzein表示大豆苷元，Puerarin表示葛根素，HCPT表示10-羟基喜树碱。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的阐述，但本发明并不受限于此，在不脱离本发明的思想和宗旨的情况下，对本发明的技术方案所做的任何变化都应落入本发明权利要求书所限定的范围内。

实施例1～5中所用的生物材料、药品和实验方法如下：

细胞：MCF-7(人乳腺癌细胞株)、BGC823(人胃癌细胞株)、HepG2(人肝癌细胞株)、Caco2细胞(人结肠癌细胞株)可从商业途径中获得，例如中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。

药品：准确称量10-羟基喜树碱(大连美仑生物技术有限公司)、大豆苷元(四川维克奇生物科技有限公司)及葛根素(四川维克奇生物科技有限公司)，以二甲基亚砜或乙醇分别溶解，配成10-羟基喜树碱浓度为100mmol/L，大豆苷元浓度为800mmol/L，葛根素浓度为400mmol/L的贮存液在-20℃下保存，使用时用新鲜的培养基稀释到表1～14中所列举的合适的浓度，实施例1～4中使用的培养基为DMEM高糖培养基。

MTT检测细胞增殖：细胞于含10％胎牛血清、100kU/L青霉素、100mg/L链霉素的DMEM高糖培养基中，37℃、5％CO₂的条件下培养。将细胞用胰酶消化后，用血细胞计数板进行计数。按每孔100μL体积接种于96孔细胞培养板(细胞接种量8000-10000个/孔，根据细胞大小和生长速度选择)，5％CO₂、37℃培养箱中培养24h后加入不同浓度梯度的待测样品，5％CO₂、37℃培养箱中孵育48小时。弃去培养基，用PBS洗一次，而后每孔加入含有0.5mg/mL MTT的无血清培养基100μL，5％CO₂、37℃培养箱中孵育4h。将96孔板孔内的培养基吸去，然后每孔加入100μL二甲基亚砜。用酶标仪进行检测，检测波长为570nm，参考波长为630nm。

合用指数(CI)的计算：

(1)确定给药剂量(D)与细胞存活率(fu)之间的关系式

存活率(fu)＝药物组OD值/对照组OD值

抑制率(fa)＝1-存活率(fu)

根据中效方程式：fa/fu＝(D/Dm)^m，两边取对数，得

log(fa/fu)＝m logD-m log Dm，

设b＝m，a＝-m logDm，Y＝log(fa/fu)，X＝logD，

则给药剂量与细胞存活率关系式为Y＝bX+a(Dm为中效剂量)。

通过实验可以测得某种药物单独给药时不同给药剂量对应的细胞存活率。将给药剂量和细胞存活率数据代入上述方程计算出Y和X。对该组数据进行线性拟合，计算出对应的b值、a值，即得到对应于该药物的剂量与抑制率关系的方程Y＝bX+a。

(2)计算合用指数(CI)

由上述方程式中的a、b值求得中效剂量(Dm)及m值。

利用中效方程式D＝Dm(fa/fu)^1/m，计算出达到两种药物合用的抑制效应时单独使用两种药物的理论给药剂量(D_单1、D_单2、D_单2)。

由下列公式计算合用指数(CI)：CI＝D_合1/D_单1+D_合2/D_单2

(D_合1和D_合2为两药合用时每种药物在组合物中各自的剂量，为实验实际使用的给药剂量。)

实施例1

(1)用含10％胎牛血清、100kU/L青霉素、100mg/L链霉素的DMEM高糖培养基培养基分别稀释大豆苷元与10-羟基喜树碱为表1～5的浓度，不同浓度的大豆苷元与10-羟基喜树碱的单用时对MCF7增殖抑制作用的实验结果见图1及表1-2。

表1大豆苷元在不同给药剂量下的MCF7细胞存活关系参数计算

表2 10-羟基喜树碱在不同给药剂量下的MCF7细胞存活关系参数计算

以表1为例进行计算说明，先得出大豆苷元作用于MCF7细胞的存活率，而后根据给药剂量与细胞存活率之间的关系进行拟合得到方程Y＝1.12X-3.07，则b＝1.12，a＝-3.07，m＝b＝1.12，Dm＝10^(-a/m)＝550.90

由此推导出大豆苷元的理论给药剂量与细胞存活率的关系式为：D_单1＝Dm(fa/fu)^1/m＝550.9[(1-fu)/fu)]^1/1.12

同理可得10-羟基喜树碱的理论给药剂量与细胞存活率的关系式为：D_单2＝Dm(fa/fu)^1/m＝16.91[(1-fu)/fu)]^1/0_.⁹²

(2)大豆苷元与10-羟基喜树碱的组合协同增效促进MCF7细胞死亡的实验结果分别见表3及图2。

表3大豆苷元及10-羟基喜树碱单用与联合用药时MCF7细胞存活率与CI值

a:表示先加大豆苷元作用24h后再加10-羟基喜树碱作用24h

b:表示大豆苷元与10-羟基喜树碱同时加药后作用48h

c:表示先加10-羟基喜树碱作用24h后再加大豆苷元作用24h

联合用药会有3种结果：协同效应、拮抗效应和相加效应。一般采用合用指数CI来判断具体效果，CI值<1认为具有协同效应，CI值＝1认为具有相加效应，CI值>1认为具有拮抗效应，CI值<0.7认为具有显著的协同效应。从上述结果可以看出，大豆苷元和10-羟基喜树碱同时给药时，CI值在一定剂量和配比下可以达到0.2-0.5之间，此时，二者合用对MCF7细胞的杀伤作用具有较好的协同作用。若是先用大豆苷元作用24h后再加10-羟基喜树碱作用24h则呈现拮抗的作用，反之则协同作用，但其协同效果小于同时加药时的协同效果。所以，应当两者同时给药则疗效最好。

以表3中组4b为例说明CI值的计算：

12.5μmol/L大豆苷元与6.25μmol/L 10-羟基喜树碱合用，同时加药时细胞存活率fu为40.8±1.50％，则D合1＝12.5μM，D合2＝6.25μM。

将fu＝40.8％分别代入大豆苷元和10-羟基喜树碱的上述理论给药剂量与细胞存活率的关系式中，可得

D单1＝550.90[(1-fu)/fu)]1/1.12＝768.09μM

D单2＝16.91[(1-fu)/fu)]1/0.92＝25.34μM

代入合用指数(CI)的计算公式，可得

CI＝D合1/D单1+D合3/D单3＝12.5/768.09+6.25/25.34＝0.26

实施例2

(1)用含10％胎牛血清、100kU/L青霉素、100mg/L链霉素的DMEM高糖培养基分别稀释大豆苷元与10-羟基喜树碱为表4～6的浓度，不同浓度的大豆苷元与10-羟基喜树碱的单用时对BGC823增殖抑制作用的实验结果见图3及表4-5。

表4大豆苷元在不同给药剂量下的BGC823细胞存活关系参数计算

表5 10-羟基喜树碱在不同给药剂量下的BGC823细胞存活关系参数计算

同理推导出大豆苷元的理论给药剂量与细胞存活率的关系式为：

D_单1＝Dm(fa/fu)^1/m＝489.1[(1-fu)/fu)]^1/1_.³²

10-羟基喜树碱的理论给药剂量与细胞存活率的关系式为：D_单2＝Dm(fa/fu)^1/m＝10.32[(1-fu)/fu)]^1/0_.⁷⁴

(2)大豆苷元与10-羟基喜树碱的组合协同增效促进BGC-823细胞死亡的实验结果见表6及图4。

表6大豆苷元及10-羟基喜树碱单用与联合用药时BGC823细胞存活率与CI值

从上述结果可以看出，大豆苷元和10-羟基喜树碱同时给药时，CI值在一定剂量和配比下可以达到0.2-0.4之间，此时，二者合用对BGC823细胞的杀伤作用具有较好的协同作用。若是先用大豆苷元作用24h后再加10-羟基喜树碱作用24h则呈现拮抗的作用，反之则协同作用也比较小，甚至也会出现拮抗作用。所以，应当两者同时给药则疗效最好。

实施例3

(1)用含10％胎牛血清、100kU/L青霉素、100mg/L链霉素的DMEM高糖培养基分别稀释大豆苷元与10-羟基喜树碱为表7～9的浓度，不同浓度的大豆苷元与10-羟基喜树碱的单用时对HepG2增殖抑制作用的实验结果见图5及表7-9。

表7大豆苷元在不同给药剂量下的HepG2细胞存活关系参数计算

表8 10-羟基喜树碱在不同给药剂量下的HepG2细胞存活关系参数计算

同理推导出大豆苷元的理论给药剂量与细胞存活率的关系式为：

D_单1＝Dm(fa/fu)^1/m＝537.98[(1-fu)/fu)]^1/1.30

10-羟基喜树碱的理论给药剂量与细胞存活率的关系式为：

D_单2＝Dm(fa/fu)^1/m＝50.12[(1-fu)/fu)]^1/0.30

(2)大豆苷元与10-羟基喜树碱的组合协同增效促进HepG2细胞死亡的实验结果见表9及图6。

表9大豆苷元及10-羟基喜树碱单用与联合用药时HepG2细胞存活率与CI值

从上述结果可以看出，大豆苷元和10-羟基喜树碱同时给药时，CI值在一定剂量和配比下可以达到0.02-0.07之间，此时，二者合用对HepG2细胞的杀伤作用具有极显著的协同作用。若是先用大豆苷元作用24h后再加10-羟基喜树碱作用24h则呈现拮抗的作用，反之则协同作用也比较小，甚至也会出现拮抗作用。所以，应当两者同时给药则疗效最好。

实施例4

(1)用含10％胎牛血清、100kU/L青霉素、100mg/L链霉素的DMEM高糖培养基培养基分别稀释大豆苷元与10-羟基喜树碱为表10～12的浓度，不同浓度的大豆苷元单用时对Caco2增殖抑制作用的实验结果见图7及表10，不同浓度HCPT对Caco2增殖抑制作用的实验结果见图7及表11。

表10大豆苷元在不同给药剂量下的Caco2细胞存活关系参数计算

表11 10-羟基喜树碱在不同给药剂量下的Caco2细胞存活关系参数计算

同理推导出大豆苷元的理论给药剂量与细胞存活率的关系式为：D_单1＝Dm(fa/fu)^1/m＝6210.17[(1-fu)/fu)]^1/0_.⁵⁸

同理可得10-羟基喜树碱的理论给药剂量与细胞存活率的关系式为：D_单2＝Dm(fa/fu)^1/m＝13.89[(1-fu)/fu)]^1/0_.⁸⁴

(2)大豆苷元与10-羟基喜树碱的组合协同增效促进Caco2细胞死亡的实验结果分别见表12及图8。

表12大豆苷元及10-羟基喜树碱单用与联合用药时Caco2细胞存活率与CI值

a:表示先加大豆苷元作用24h后再加10-羟基喜树碱作用24h

b:表示大豆苷元与10-羟基喜树碱同时加药后作用48h

c:表示先加10-羟基喜树碱作用24h后再加大豆苷元作用24h

从上述结果可以看出，大豆苷元和10-羟基喜树碱同时给药时，CI值在一定剂量和配比下可以达到0.2-0.6之间，此时，二者合用对Caco2细胞的杀伤作用具有极显著的协同作用。若是先用大豆苷元作用24h后再加10-羟基喜树碱作用24h则呈现拮抗的作用，反之也具有协同作用，但协同作用小于同时给药时的协同作用，所以应当两者同时给药则疗效最好。

实施例5

(1)用含10％胎牛血清、100kU/L青霉素、100mg/L链霉素的DMEM高糖培养基培养基分别稀释葛根素与10-羟基喜树碱为表13～14的浓度，不同浓度的葛根素单用时对MCF7增殖抑制作用的实验结果见图9及表13，不同浓度HCPT对MCF7增殖抑制作用的实验结果见图1及表2。

表13葛根素在不同给药剂量下的MCF7细胞存活关系参数计算

同理推导出葛根素的理论给药剂量与细胞存活率的关系式为：D_单1＝Dm(fa/fu)^1/m＝719.69[(1-fu)/fu)]^1/0_.⁷⁷

同理可得10-羟基喜树碱的理论给药剂量与细胞存活率的关系式为：D_单2＝Dm(fa/fu)^1/m＝16.91[(1-fu)/fu)]^1/0.92

(2)葛根素与10-羟基喜树碱的组合协同增效促进MCF7细胞死亡的实验结果分别见表14及图10。

表14葛根素及10-羟基喜树碱单用与联合用药时MCF7细胞存活率与CI值

a:表示先加葛根素作用24h后再加10-羟基喜树碱作用24h

b:表示葛根素与10-羟基喜树碱同时加药后作用48h

c:表示先加10-羟基喜树碱作用24h后再加葛根素作用24h

从上述结果可以看出，葛根素和10-羟基喜树碱无论是同时给药，还是按不同顺序给药，均表现出拮抗作用。而葛根素与大豆苷元均属于异黄酮，有共同的母核3-苯基色原酮的结构，但葛根素并未表现出与HCPT具有协同作用，而大豆苷元与HCPT同时作用时表现出很强的协同作用。