胡椒碱在制备调节免疫细胞AMPK免疫代谢通路药物中的应用的制作方法

本发明属于药物领域，特别涉及胡椒碱作为免疫调节药物，在制备调节免疫细胞AMPK免疫代谢通路药物中的应用。

背景技术：

AMPK是调控能量代谢的枢纽分子，不仅调控免疫代谢(immunometabolism)，也调控细胞的生存，影响一系列细胞代谢活动。如AMPK通过磷酸化激活脂代谢关键激酶ACC，抑制脂类合成；AMPK还可通过对Raptor(mTORC1复合体的组成蛋白)或TSC2(mTORC1抑制因子)的磷酸化，抑制mTORC1的活性，从而限制蛋白质的合成和细胞增殖。

微生物感染、高脂肪饮食等能改变固有免疫细胞的能量代谢，反过来又影响固有免疫细胞的功能。体外研究表明，细菌脂多糖(LPS)、游离脂肪酸、高脂诱导肥胖等炎症刺激可激活炎症小体通路，并抑制巨噬细胞内AMPK的活性，细胞能量代谢从氧化磷酸化向糖酵解途径转变，上调胞内HIF-1α的水平，产生类似肿瘤细胞的Warburg效应，并持续释放炎症介质；同时改变细胞脂代谢通路，导致巨噬细胞脂类沉积，转化为泡沫细胞或脂肪巨噬细胞，增加动脉粥样硬化和肥胖风险。推而广之，AMPK可能通过对免疫代谢的调控，在其他慢性炎症性疾病中也起着重要的作用。

另一方面，尽管上述炎症刺激可抑制细胞AMPK活性，上调胞内HIF-1α的水平，从而有利于细胞生存。但与正常细胞相比，这些激活的巨噬细胞失去了免疫上的可塑性，在细菌和坏死细胞释放的ATP等第二信号的刺激下，反而强烈上调AMPK信号，同时细胞发生焦亡。因此，免疫细胞能量代谢通路的改变，尤其是AMPK信号通路的改变，在败血症时发生的细胞焦亡和脏器损伤(因而产生免疫抑制)过程中，也起着关键作用。

由此可见，利用药物调节AMPK能量代谢通路，从而修正细胞免疫代谢途径，对于预防和治疗慢性炎症性疾病、防止患者产生免疫抑制，具有重要的医学意义。

胡椒作为中药，其历史悠久，可追溯至汉唐时期。胡椒入胃大肠经，温中散寒，下气消痰。可用于治疗胃肠不适和癫痫。胡椒碱在治疗结肠炎方面的用途，可见公开专利文件(申请公布号CN103690537A)。胡椒碱(Piperine)是胡椒的主要活性成分，化学名为(E,E)-1-[5-(1,3-苯并二氧戊环-5-基)-1-氧代-2,4-戊二烯基]-哌啶(分子式为C₁₇H₁₉NO₃，分子量为285.34)，可溶于乙醇、二甲基亚砜(DMSO)等有机溶剂中。其化学结构如下：

胡椒碱作为AMPK信号通路调节药物的应用，目前尚未见诸报道。

技术实现要素：

为了克服上述现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种胡椒碱在制备调节免疫细胞AMPK免疫代谢通路药物中的应用。

本发明的目的通过下述方案实现：胡椒碱在制备调节免疫细胞AMPK免疫代谢通路药物中的应用。

所述的调节免疫细胞AMPK免疫代谢通路药物以胡椒碱为活性成分。

所述的调节免疫细胞AMPK免疫代谢通路药物包括可接受的辅料。

所述的辅料优选为缓释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、吸附载体、表面活性剂或润滑剂。

所述的调节免疫细胞AMPK免疫代谢通路药物还包括其他起配伍协同作用的有效成分。

所述的调节免疫细胞AMPK免疫代谢通路药物可以为各种剂型，如片剂、颗粒剂、胶囊、滴丸、缓释剂、口服液、注射剂等。

本发明的机理为：

本发明公开了胡椒碱在制备调节免疫细胞AMPK免疫代谢通路药物中的应用，即免疫细胞在细菌脂多糖(革兰氏阴性细菌的病原相关分子模式)等炎症刺激下，细胞AMPK代谢信号通路发生改变，在ATP等第二信号刺激下，AMPK代谢信号平衡被打破，其活性(磷酸化AMPK的水平)急剧上调，而经胡椒碱预处理的细胞，上述AMPK活性受到抑制，细胞因而免于焦亡性死亡。因此，胡椒碱具有调节免疫代谢和免疫细胞功能的活性。

本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：

胡椒碱具有明确的AMPK免疫代谢通路调节活性，对于修复细胞免疫代谢，防止其功能耗竭具有重要意义；胡椒碱显著抑制细菌感染(LPS+ATP)上调的AMPK活性，可用于调节因细菌感染等受到抑制的免疫细胞的功能。胡椒碱的上述新的活性与用途，尚未见公开文献报道。

附图说明

图1为实施例1小鼠单核巨噬细胞J774A.1细胞分别经胡椒碱预处理、LPS激活和ATP处理后细胞蛋白的免疫印迹图；PIP表示胡椒碱(piperine)。

图2为对实施例1小鼠单核巨噬细胞J774A.1细胞分别经胡椒碱预处理、LPS激活和ATP处理后细胞蛋白的免疫印迹图中p-AMPK免疫印迹条带的灰度分析直方图；PIP表示胡椒碱(piperine)；***,P<0.001。

图3为实施例2二甲双胍(metformin)拮抗胡椒碱对小鼠单核巨噬细胞J774A.1中“LPS+ATP”激活AMPK的抑制作用的免疫印迹图；PIP表示胡椒碱(piperine)。

图4为对实施例2二甲双胍(metformin)拮抗胡椒碱对小鼠单核巨噬细胞J774A.1中“LPS+ATP”激活AMPK的抑制作用的免疫印迹图中p-AMPK免疫印迹条带的灰度分析直方图；PIP表示胡椒碱(piperine)；*,P<0.05。

图5为实施例3小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMDM)分别经胡椒碱预处理、LPS激活和ATP处理后提取其蛋白的免疫印迹图；PIP表示胡椒碱(piperine)。

图6为对实施例3小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMDM)分别经胡椒碱预处 理、LPS激活和ATP处理后提取其蛋白的免疫印迹图中p-AMPK免疫印迹条带的灰度分析直方图。示意胡椒碱可抑制LPS+ATP激活的AMPK活性；PIP表示胡椒碱(piperine)；***,P<0.001。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例中所用到的材料：

胡椒碱(纯度>98％)购自广东省药品检验所；脂多糖(LPS)(产品名称Lipopolysaccharides from Escherichia coli 0111:B4，目录号：L4391)、ATP(目录号：A6419)、二甲基亚砜(DMSO)(目录号：D8418)、Tween-80(目录号：P8074)均购自Sigma-Aldrich公司；二甲双胍(Metformin，LKB1-AMPK激活剂)购自碧云天(Beyotime)公司(目录号：S1741)。抗p-AMPK(目录号：#2535)、抗AMPK(目录号：#5831)、抗β-tubulin(目录号：#2118)等抗体以及2×十二烷基硫酸钠上样缓冲液(2×SDS-loading buffer)购自Cell Signaling Technologies(CST)公司；小鼠巨噬细胞J774A.1购自中国科学院上海细胞库；L929细胞系购自中国科学院昆明动物所细胞库。细胞培养基DMEM、胎牛血清(FBS)等细胞培养用物质均为Thermo/Gibco公司产品。

溶液配制方法：

DMEM完全培养基：DMEM培养基中添加下列成分：10％(v/v)胎牛血清(FBS)，100U/mL青霉素(终浓度)、100μg/mL链霉素(终浓度)。

LPS溶于PBS。

胡椒碱溶于DMSO中，储存于-20℃保存，细胞培养实验时，胡椒碱进一步用DMEM完全培养基稀释至所需浓度。

实施例1

(1)细胞培养和处理

小鼠巨噬细胞J774A.1培养于DMEM完全培养基中。待细胞长至对数生 长期，种于6孔板中，细胞密度为2.5×10⁵/孔(2mL培养基)，培养24小时。先经不同浓度的胡椒碱(20,40,80μmol/L)预处理4小时，再加入50μg/ml LPS20μl，使其终浓度为500ng/ml，处理4小时激活细胞。用含0.1％FBS的DMEM培养基洗涤后，细胞培养液换成含0.1％FBS和4mmol/L ATP的DMEM培养基(1.2mL)处理1小时。

(2)AMPK活性的检测方法：

细胞经上述处理后，用2×十二烷基硫酸钠上样缓冲液(2×SDS-loading buffer)裂解细胞，利用免疫印迹(Western blotting)方法检测细胞中AMPK总蛋白水平(用AMPK抗体检测)和磷酸化的AMPK蛋白水平(用p-AMPK抗体检测)。用免疫印迹法检测上述蛋白水平时，各样品之间上样量一致，由于β-tubulin为看家基因，在细胞内表达恒定，因此以β-tubulin作为内参，其表达水平用β-tubulin抗体检测。

(3)实验结果

由于AMPK被磷酸化后，具有相应的蛋白激酶活性，因此磷酸化AMPK(p-AMPK)的水平，代表着AMPK的蛋白激酶活性。图1为小鼠单核巨噬细胞J774A.1细胞经上述处理后得到的免疫印迹图；从图1中可以看出，细胞经LPS+ATP处理，磷酸化AMPK，即p-AMPK免疫印迹条带显著上调，说明细胞经LPS+ATP处理显著上调AMPK的活性，而“胡椒碱+LPS+ATP”组的p-AMPK免疫印迹条带与“LPS+ATP”组相比显著减弱，说明当细胞经加入不同浓度(20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L)的胡椒碱溶液预处理后，可显著抑制上述由“LPS+ATP”激活的AMPK活性。

图2为对图1中p-AMPK免疫印迹条带的灰度分析直方图。表明胡椒碱可抑制LPS+ATP激活的AMPK活性；***表示P<0.001。

实施例2

(1)细胞培养和药物处理：

小鼠单核巨噬细胞J774A.1细胞培养方法同“实施例1”。待细胞长至对数生长期，用DMEM完全培养基种于6孔板中，密度细胞密度为2.5×10⁵/孔 (2mL培养基)，先经含80μmol/L胡椒碱的DMEM完全培养基预处理4小时，补加50μg/ml LPS 20μl，使其终浓度为500ng/ml，处理4小时激活细胞。然后，用含0.1％FBS的DMEM培养基洗涤后，细胞培养液换成含0.1％FBS和1mmol/L二甲双胍(Metformin，AMPK激活剂)的DMEM培养基(1.2ml)，处理1小时。然后补加48μl浓度为100mmol/L的ATP溶液，使其终浓度4mmol/L，ATP处理1小时。

(2)AMPK活性的检测方法：

同“实施例1”。

(3)实验结果

图3为二甲双胍拮抗胡椒碱对小鼠单核巨噬细胞J774A.1细胞中“LPS+ATP”激活AMPK的抑制作用的免疫印迹图；图4是对图3中p-AMPK免疫印迹条带的灰度分析图。从图3中可以看出：细胞经“LPS+ATP”处理可激活AMPK(图中第二泳道p-AMPK水平急剧上调)，但先经胡椒碱预处理再经“LPS+ATP”处理的细胞中，其胞内p-AMPK水平(图中第三泳道)被显著抑制(与单独“LPS+ATP”处理组的p-AMPK免疫印迹条带相比)；然而，在加入ATP之前经二甲双胍处理的细胞中，其p-AMPK的水平(图中第四泳道)再次上调(与“胡椒碱预处理+LPS+ATP”组相比)。该结果显示AMPK激活剂二甲双胍可拮抗胡椒碱对“LPS+ATP”诱导的p-AMPK的下调作用。

实施例3

(1)细胞培养及处理

小鼠成纤维细胞L929细胞购自中国科学院昆明动物研究所细胞库。细胞培养方法参照Monack实验室的操作程序(Stanford)，将1×10⁸个细胞培养于底面积为500cm²的三层培养瓶中，培养基为DMEM完全培养基，200mL，培养一周。

小鼠骨髓来源的巨噬细胞(BMDM)的培养方法：C57BL/6小鼠，6-8周，雌性，购自南方医科大学实验动物中心。经颈椎脱臼处死后，取其大腿骨，用注射器将骨髓细胞用DMEM培养基冲出，300×g离心。得到的细胞用BM-Mac 培养基(80％DMEM完全培养基+20％L929细胞培养上清)，培养于细菌培养皿(密度为5×10⁶/皿，培养基体积为8-10mL)。培养3天，添加10mL新的BM-Mac培养基；培养第5天，替换为上述新鲜BM-Mac培养基。培养第7天，收集细胞，培养于含10％FBS和含100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素的DMEM(完全培养基)的6孔板中，细胞密度为2.3×10⁶/孔(2mL培养基)，培养24小时。然后换成含不同浓度胡椒碱(40、80、160μmol/L)的DMEM完全培养基预处理4小时，再补加50μg/ml LPS 20μl，使其终浓度为500ng/ml，处理4小时激活细胞。最后，用含0.1％FBS的DMEM培养基洗涤后，细胞培养液换成含0.1％FBS和4mmol/L ATP的DMEM培养基(1.2mL)处理1小时。

(2)AMPK活性的检测方法：

同“实施例1”。

(3)实验结果

图5为本实施例BMDM细胞分别经胡椒碱预处理、LPS激活和ATP处理后细胞蛋白的免疫印迹图；从图5可以看出，BMDM细胞经“LPS+ATP”处理，显著上调AMPK的活性(图中p-AMPK免疫印迹条带水平显著上调)，当细胞经不同浓度(40μmol/L、80μmol/L、160μmol/L)的胡椒碱溶液预处理后，上述由“LPS+ATP”激活的AMPK活性被显著抑制，表现为“胡椒碱+LPS+ATP”组的p-AMPK免疫印迹条带显著弱于“LPS+ATP”组。

图6为对附图5中p-AMPK免疫印迹条带的灰度分析直方图。图6表明胡椒碱可抑制LPS+ATP激活的AMPK活性；***表示P<0.001。

从上述实施例中可以看出，胡椒碱可调节因细菌感染、炎症小体激活引起的免疫代谢信号通路，显著下调LPS+ATP处理而急剧上调的AMPK活性(后者导致细胞焦亡性死亡)。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。