麻欠精油在制备预防和治疗子宫腺肌病药物中的应用的制作方法

本发明属于医药技术领域，涉及麻欠精油在制备预防和治疗子宫腺肌病药物中的应用。

背景技术：

子宫内膜的健康状况关乎女性的生理、心理和生殖健康，越来越受到临床医务人员的重视，其中，子宫腺肌病是一种常见的子宫内膜疾病。

子宫腺肌病，又称子宫内子宫内膜异位症，是指子宫内膜腺体及/或间质侵入子宫肌层，并在其中弥漫性生长。其特征是在子宫肌层中出现了异位的内膜和腺体，伴有其周围的肌层细胞肥大和增生。

子宫腺肌病致病机制不详，广为接受的理论是子宫内膜从基底层直接向下生长进入子宫肌层。病理组织学已证实腺肌病的内膜岛与子宫内膜之间有直接延续关系。不管异位内膜组织有多深，连续切片可证实其与宫腔内膜的连接。

目前临床上子宫腺肌病的治疗主要包括手术治疗和药物治疗以及两者相结合的方法，鉴于子宫腺肌病手术难于治愈，术后又容易复发，因此，药物治疗仍占据重要地位。药物治疗的要点是减灭和消除病灶、缓解和解除疼痛、改善和促进生育、减少或避免复发。目前的药物治疗以西药为主，副反应较多，治疗效果并不可靠。

而中草药和民族药由于其多成分、多靶点、作用温和且可调理患者的全身状况的特点，在子宫腺肌病的药物治疗中可以发挥其优势。复旦大学附属妇产医院临床研究发现术后采用中药治疗可预防术后复发，提高妊娠率，取得很好的临床疗效。因此腹腔镜手术结合中草药或民族药治疗是目前认为子宫腺肌病较好的治疗模式。中草药或民族药用于子宫腺肌病的术后辅助治疗具有如下特点：(1)在临床疗效上与西药疗效相当；(2)中草药或民族药治疗后患者无转氨酶升高、体重增加、更年期综合征表现、骨质疏松等不良反应；(3)中草药或民族药服药期间一般不会影响内分泌生理功能，而且可调经助孕。因此，如何发掘疗效较好的中草药或民族药用于子宫腺肌病的治疗，是目前子宫腺肌病研究的重要内容。

云南西双版纳地区是药用植物种类丰富多样和民族传统药用植物知识丰厚的热带地区，傣族传统药用植物是我国民族文化中的瑰宝。麻欠(Maqian)是傣药的一种，又称毛大叶臭花椒(Zanthoxylum myriacanthum var.Pubescens)，为芸香科花椒属大叶臭花椒(Zanthoxylum myriacanthum)的一个变种，因其叶轴、小叶柄、小叶两面及花序轴均被长柔毛而得名。傣族医药书籍记载麻欠可用于治疗肿痛等疾病，西双版纳当地傣族群众常用该药用于抗炎、镇痛以及缓解肿胀等。目前，未见有关麻欠用于治疗子宫腺肌病的文献报道。

技术实现要素：

本发明的目的是为克服上述现有技术的不足，提供麻欠精油在制备预防和治疗子宫腺肌病药物中的应用。

为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：

麻欠精油在制备预防和治疗子宫腺肌病药物中的应用。

优选的，所述子宫为人子宫。

所述麻欠精油为从麻欠植物中提取的挥发性物质。

所述麻欠精油的提取方法，选自：水蒸气蒸馏法、挤压法、冷浸法或溶剂提取法。

优选的，麻欠精油是由以下方法制得：

取麻欠植物加入水中，经过浸泡和/或超声后，加热至沸腾，手机馏出液，有机溶剂萃取其有机相，挥干有机相即得麻欠精油。

所述的麻欠植物选自麻欠的果实、果皮、种子和茎中的一种或多种。

优选的，所述麻欠植物为粗粉或碎片。

优选的，所述有机溶剂为乙醚。

优选的，麻欠精油是由以下方法制得：取新鲜麻欠植物，干燥，之后在45～65℃温水中浸泡60～150分钟，然后超声波超声处理30～60分钟，加热至沸腾，提取2～3小时，用乙醚萃取，挥干乙醚即得麻欠精油。

本发明的有益效果：

本发明以原代培养的人子宫异位内膜间质细胞(ESC)为模型，筛选发现麻欠精油具有很好的抑制子宫内膜异位种植活性，麻欠精油在较低浓度(体积浓度不低于0.01‰)时可以抑制TNF-α诱导的原代人子宫异位内膜间质细胞IL-8分泌，较高浓度(体积浓度不低于0.08‰)时抑制人子宫内膜间质细胞增殖并诱导原代培养的人子宫异位内膜间质细胞凋亡和坏死。故麻欠精油可用于制备预防或治疗子宫腺肌病药物。

麻欠精油作为一种傣药成分，避免了西药的诸多不良反应，服药期间不会影响内分泌生理功能，也不会影响女性患者的正常生育要求，具有明显的临床优势。

附图说明

图1a和图1b为人子宫异位内膜间质细胞免疫组化鉴定，其中，图1a为Vimentin阳性，图1b为cytokeratin阴性；

图2为麻欠精油对人子宫异位内膜间质细胞活力的影响；

图3为麻欠精油诱导人子宫异位内膜间质细胞凋亡和坏死；

图4为麻欠精油抑制TNF-α诱导的人子宫异位内膜间质细胞IL-8(白细胞介素8)分泌。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进行进一步的阐述，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。

实施例

1.材料与方法

1.1麻欠精油的制备：新鲜麻欠果实于11月采自西双版纳孟旺乡，干燥后备用。将麻欠干燥果实浸泡在温水(60℃，120分钟)。然后超声波超声处理50分钟，加热至沸腾，提取2.5小时。用乙醚萃取，挥干乙醚，得麻欠精油。

2.试验方法

2.1人子宫异位内膜间质细胞分离培养和鉴定

从确诊的子宫腺肌病患者的异位子宫内膜组织标本中成功分离得到人子宫异位内膜间质细胞，具体分离纯化方法参照文献方法(唐雪莲,谢梅青,张凤丽.高纯度分离子宫内膜腺上皮及间质细胞和体外培养技术.中山大学学报(医学科学版).2003,24(6):589-592.)，并参照文献方法对所分离得到的子宫内膜间质细胞进行免疫组化鉴定(张婷婷,张瑞晓.胶原酶分离及低速离心结合筛网过滤法纯化子宫内膜细胞的研究[J].生殖与避孕.2014,34(1):12-16.)以原代培养的人子宫异位内膜间质细胞(ESC)作为子宫腺肌病的药物筛选模型，图1a和图1b示出了人子宫内膜间质细胞免疫组化鉴定结果。

2.2麻欠精油对子宫内膜间质细胞存活率影响实验

参照文献方法以Cell Counting Kit-8(CCK-8)法测定细胞存活率(Tominaga,H.；Ishiyama,M.；Ohseto,F.；Sasamoto,K.；Hamamoto,T.；Suzuki,K.；Watanabe,M.A water-soluble tetrazolium salt useful for colorimetric cell viability assay.[J]Anal.Commun.,1999,36(2),47-50.)。CCK-8方法的原理是利用Dojindo开发的水溶性四唑盐—-8(2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐)，它在电子载体1-Methoxy PMS存在的情况下能够被还原成水溶性的甲臜染料。CCK-8溶液可以直接加入到细胞样品中；不需要预配各种成分。

CCK-8法是用于测定细胞增殖或毒性实验中活细胞数目的一种高灵敏度，无放射性的比色检测法。-8被细胞内脱氢酶氧化还原后生成的橙黄色甲臜染料能够溶解在组织培养基中，生成的甲臜量与活细胞数量成正比。

将对数生长期的子宫内膜间质细胞以1×10⁵cells/孔接种于96孔板中，每孔200μL培养体系，加入不同剂量的麻欠精油(体积浓度分别为：0.01‰，0.02‰，0.04‰，0.08‰，0.16‰)，作用时间为24h后，每孔加入10μL CCK-8试剂，培养箱中孵育2h后以酶标仪450nm读取吸光度。

细胞存活率(％)＝[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100％

As：实验孔(含有细胞的培养基、CCK-8、麻欠精油)

Ac：对照孔(含有细胞的培养基、CCK-8)

Ab：空白孔(不含细胞和麻欠精油的培养基、CCK-8)

细胞存活率检测结果见图2，从图2可以看出，当麻欠精油浓度大于0.08‰时，子宫内膜间质细胞细胞存活率迅速降低。

2.3流式细胞仪检测细胞凋亡率

采用流式细胞仪测定细胞凋亡率，子宫内膜间质细胞接种于六孔板中，加入不同剂量的麻欠精油(体积浓度分别为：0.01‰，0.02‰，0.04‰，0.08‰，0.16‰)，作用时间为24h后，收集细胞，预冷D-Hanks洗涤，重悬于binding buffer(10mmol/L HEPES，pH 7.4，140mmol/L NaCl，2.5mmol/L CaCl₂)，细胞浓度1×10⁶cells/mL。取100μL细胞悬液，加5μL AnnexinⅤ-FITC和5μL PI(50μg/mL)，于室温黑暗中孵育15min，加入400μL binding buffer，轻轻混匀，1h内上流式细胞仪检测。计算凋亡细胞数占总细胞数的百分比。凋亡细胞为Annexin V阳性细胞(AV+/PI-和AV+/PI+象限)，坏死细胞为PI阳性细胞(AV-/PI+)。

细胞凋亡检测结果见图3，从图3可以看出，当麻欠精油浓度大于0.08‰时，子宫内膜间质细胞细胞凋亡率和坏死率显著增加。

2.4麻欠精油抑制TNF-α诱导的原代人子宫异位内膜间质细胞IL-8分泌

通过TNF-α(10ng/ml，sigma公司)刺激原代人子宫异位内膜间质细胞模拟炎症状态环境，采用ELISA检测麻欠精油对TNF-α诱导的原代人子宫异位内膜间质细胞IL-8分泌的影响，子宫内膜间质细胞接种于六孔板中，加入不同剂量的麻欠精油(体积浓度分别为：0.01‰，0.02‰，0.04‰，0.08‰，0.16‰)，作用时间为24h后，离心，收集上清液按下述方法测定：

1)实验前2h从冰箱中取出试剂盒(RD公司)，平衡至室温；

2)双蒸水稀释浓缩洗涤液。未用完4℃保存；

3)标准品配制：冻干标准品用标准品/标本稀释液复溶，混匀，静置15分钟，然后倍比稀释，未用完标准品-20℃保存；

4)生物素化抗体：临用前将浓缩生物素化抗体用生物素化抗体稀释液按说明书方法稀释；

5)酶结合物：临用前将浓缩酶结合物用酶结合物稀释液按说明书方法稀释；

6)取出所需板条，其它板条密封放回4℃；

7)除空白孔外，在其它各孔中分别加入细胞上清液(稀释20倍)或已稀释好的不同浓度的标准品溶液，用封板胶纸封住反应，37℃孵育90min；

8)洗板4次：甩尽板孔内液体，每孔加洗涤液300μL，静止30S后甩尽液体，在后迭吸水纸上拍干，再加入洗液；

9)每孔加生物素化抗体工作液100μL，用封板胶纸封住反应孔，37℃孵育60min；

10)洗板4次；

11)每孔加酶结合物工作液100μL，封住板孔，37℃孵育30min；

12)洗板4次；

13)每孔加显色剂100μL，避光，37℃孵育15-25min(视颜色深浅掌握)；

14)每孔加终止液100μL，混匀，即刻在450nm处读数(5分钟内)；

15)结果计算：每个标准品和样品的OD值应减去零孔的OD值，以标准品浓度和OD值绘制标准曲线，通过样品OD值求出其浓度，再乘以稀释倍数。

检测结果见图4，结果显示麻欠精油在不影响细胞活力的浓度下即可抑制TNF-α诱导的人子宫异位内膜间质细胞IL-8分泌(图4)

上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。