小核酸祛痘组合物的制作方法

本发明属于化妆品和药物领域，具体地说，涉及一种祛痘组合物、尤其是包含双链小核酸分子的祛痘化妆品和祛痘药物。
背景技术：
：青春痘，又名粉刺、痘痘等，学名痤疮，是毛囊皮脂腺单位的一种慢性炎症性皮肤病，好发于青少年，临床表现以好发于面部的粉刺、丘疹、脓疱、结节等多形性皮损为特点。痤疮是多种因素综合作用引起的毛囊皮脂腺疾病，痤疮发生主要与皮脂分泌过多、毛囊口过度角化、痤疮丙酸杆菌增殖、过度免疫反应等因素密切相关。进入青春期后，人体内雄激素特别是睾酮的水平迅速升高，促进皮脂腺发育并产生大量皮脂，同时毛囊皮脂腺导管的角化异常造成导管堵塞，皮脂排出障碍，是导致痤疮的初始因素，不正常脱屑与丝状物和脂质混合堆积，形成角质栓即微粉刺。毛囊中多种微生物尤其是痤疮丙酸杆菌大量繁殖，痤疮丙酸杆菌产生的脂酶分解皮脂生成游离脂肪酸，同时趋化炎症细胞和介质，最终诱导并加重炎症反应。临床上根据痤疮皮损性质和严重程度将痤疮分为3度、4级，具体为：1级(轻度)，仅有粉刺；2级(中度)，除粉刺外，还有一些炎性丘疹；3级(中度)，除粉刺外，还有较多的炎性丘疹或脓疱；4级(重度)，除有粉刺、炎性丘疹及脓疱外，还有结节、囊肿或瘢痕。目前痤疮治疗的药物和方法很多，但缺乏行之有效治疗方法，且部分治疗方法使用的产品副作用大、疗效不明显、疗程长、易复发、治标不治本。痤疮治疗的常用方法及存在许多问题，包括：(1)局部外用药物，维A酸类、过氧化苯甲酰、抗生素类(克林霉素、红霉素、氯霉素等)、壬二酸、硫磺洗剂等。但维A酸自身稳定性较差，且局部刺激较常见，有较大副作用，大大限制了其在临床中的应用；过氧苯甲酰是一种非常有效的局部抗生素制剂，但因传统制剂易产生局部刺激，也限制了其临床应用。(2)口服抗生素，首选四环素类(米诺环素、多西环素等)，其次为大环内酯类(红霉素)，虽为治疗痤疮的有效手段，但在使用过程中出现的耐药问题却日趋严重。(3)口服异维A酸，针对对严重的痤疮。(4)抗雄激素治疗，如口服避孕药复方醋酸环丙孕酮片，适用于女性中、重度痤疮患者，伴有雄激素水平过高表现(如多毛、皮脂溢出等)或多囊卵巢综合征。(5)口服糖皮质激素，主要用于暴发性或聚合性痤疮。(6)其他治疗，如光动力疗法(PDT)、果酸疗法、激光治疗等。目前临床治疗主要根据痤疮的3度、4级进行分级治疗，但很难达到预期效果。痤疮虽然是一种皮肤病，但会严重影响患者的学习、工作、运动、人际关系和社会生活，损害患者的身心健康。因此迫切需要开发一种安全有效的祛痘产品。技术实现要素：为了克服现有治疗痤疮技术的上述缺陷，本发明将小核酸应用于化妆品和外用药，开发出祛痘效果显著、安全的新型护肤用品和药品。因此，本发明的第一个目的在于提供一种包含对痤疮有治疗效果的小核酸分子的祛痘组合物，包括化妆品和药物。本发明的第二个目的在于提供一种制备上述祛痘化妆品和祛痘药物的方法。为达到上述目的，本发明采用如下技术方案。一种祛痘组合物，由如下重量百分比的组分组成：小核酸分子0.001-0.5％、化妆品辅料或者外用药辅料99.50-99.999％，其中小核酸分子的长度范围为17～100bp。可选择地，上述小核酸分子来源于酿酒酵母或热带假丝酵母，即酿酒酵母总RNA或热带假丝酵母总RNA。作为另一个选择，上述小核酸分子是人工合成的双链RNA分子。优选地，上述人工合成的双链RNA分子是选自下述两类双链RNA分子中的一种、或者两种以上的混合物，分别由正义链和反义链组成：第一类小核酸分子，正义链：5’-UAGGUACUUCGAGAAGCCUAGUANn-3’(SEQIDNO:1)，反义链：5’-UACUAGGCUUCUCGAAGUACCUANn-3’(SEQIDNO:2)；第二类小核酸分子，正义链：5’-AGGUACUUCGAGAAGCCNn-3’(SEQIDNO:3)，反义链：5’-GGCUUCUCGAAGUACCUNn-3’(SEQIDNO:4)，其中，N为胞嘧啶核苷C、鸟嘌呤核苷G、腺嘌呤核苷A、尿嘧啶核苷U、脱氧胞嘧啶核苷dC、脱氧鸟嘌呤核苷dG、脱氧腺嘌呤核苷dA或者脱氧胸腺嘧啶核苷dT；n代表N的个数，n是0～2的整数。在一种优选的实施方式中，第一类小核酸分子由下述正义链和反义链组成：正义链：5’-UAGGUACUUCGAGAAGCCUAGUA-3’(SEQIDNO:5)，反义链：5’-UACUAGGCUUCUCGAAGUACCUA-3’(SEQIDNO:6)；或者正义链：5’-UAGGUACUUCGAGAAGCCUAGUAdTdT-3’(SEQIDNO:15)，反义链：5’-UACUAGGCUUCUCGAAGUACCUAdTdT-3’(SEQIDNO:16)；并且第二类小核酸分子由下述正义链和反义链组成：正义链：5’-AGGUACUUCGAGAAGCC-3’(SEQIDNO:7)，反义链：5’-GGCUUCUCGAAGUACCU-3’(SEQIDNO:8)；或者正义链：5’-AGGUACUUCGAGAAGCCdTdT-3’(SEQIDNO:13)，反义链：5’-GGCUUCUCGAAGUACCUdTdT-3’(SEQIDNO:14)。优选地，上述祛痘组合物是祛痘化妆品，上述化妆品辅料及重量百分比为：基础油脂2.5-15％、保湿剂1-20％、抗氧化剂0.01-1.0％、增稠剂0.1-2.0％、乳化剂0.1-3％、植物控油因子1-5％、肤感改善剂0.1-2％、金属螯合剂0-0.5％、香精0.1-0.5％、其余为水比如去离子水、纯化水、蒸馏水、或双蒸水等。作为另一种选择，上述祛痘组合物是祛痘药物，所述祛痘药物剂型为软膏剂、乳膏剂、霜剂、搽剂、水剂、洗剂、凝胶剂、涂膜剂、或者喷雾剂，所述外用药辅料选自用于保持小核酸分子稳定性的药学可接受的辅料、促进小核酸分子经皮吸收的皮肤渗透促进剂、用于制备外用药剂型的药学可接受的填充剂和赋形剂、水比如去离子水、纯化水、蒸馏水、或双蒸水等。优选地，上述基础油脂是霍霍巴油、二甲基硅油、或者它们的混合物。优选地，上述保湿剂是甘油、1,3-丁二醇、1,2-戊二醇、1,2-已二醇/辛甘醇、透明质酸、辛酸甘油酯、或者它们两种以上的混合物。优选地，上述抗氧化剂是油溶性维生素E醋酸酯、植酸钠、或者它们的混合物。优选地，上述增稠剂是丙烯酰二甲基牛磺酸胺/VP共聚物、黄原胶、或者它们的混合物。优选地，上述乳化剂是鲸蜡硬脂醇橄榄油酸酯、山梨坦橄榄油酸酯、或者它们的混合物。优选地，上述植物控油因子是欧洲七叶树籽提取物、药鼠尾草叶提取物、问荆(马尾草)提取物、款冬叶提取物、迷迭香叶提取物、母菊花(欧药菊)提取物、香蜂花(蜜蜂花)叶提取物、或者它们两种以上的混合物。优选地，上述肤感改善剂是硅弹体。优选地，上述金属螯合剂是乙二胺四乙酸二钠。在一种优选的实施方式中，上述祛痘化妆品由以下重量百分比的组分组成：霍霍巴油1-10％、二甲基硅油1-5％、甘油2-10％、1,3-丁二醇1-10％、1,2-戊二醇0.1-5％、1,2-已二醇/辛甘醇0.1-2％、透明质酸0.01-5％、辛酸甘油酯0.1-1％、油溶性维生素E醋酸酯0.1-0.5％、丙烯酰二甲基牛磺酸胺/VP共聚物0.1-1.0％、黄原胶0.1-1％、植酸钠0.01-0.5％、鲸蜡硬脂醇橄榄油酸酯/山梨坦橄榄油酸酯0.1-3％、植物控油因子1-5％、硅弹体0.1-2％、乙二胺四乙酸二钠0-0.5％、小核酸0.001-0.5％、香精0.1-0.5％、余量为去离子水。一种制备上述祛痘化妆品的方法，包括如下步骤：1)A相混合物配置，分别称取以下组分混合：霍霍巴油、二甲基硅油、甘油、1,3-丁二醇、1,2-戊二醇、1,2-已二醇/辛甘醇、辛酸甘油酯、油溶性维生素E醋酸酯、丙烯酰二甲基牛磺酸胺/VP共聚物、黄原胶、植酸钠、鲸蜡硬脂醇橄榄油酸酯、山梨坦橄榄油酸酯、乙二胺四乙酸二钠、去离子水；2)B相混合物配置，分别称取以下组分混合：透明质酸、硅弹体、去离子水；3)C相混合物配置，分别称取以下组分混合：小核酸、植物控油因子、香精、甘油和去离子水；4)取A相混合物在30-45rpm的转速下搅拌并加热至85℃，保温30分钟，开真空并改搅拌为最大速72rpm，均质5分钟，改搅拌速度至30-45rpm，降温至60℃；5)加入B相混合物，开真空，最大速72rpm搅拌，均质2分钟，改搅拌速度至30-45rpm，冷却至50℃；6)加入C相混合物，开真空，最大速72rpm搅拌，均质2分钟，改搅拌速度至30-45rpm，继续冷却，3分钟后改搅拌低速至20-30rpm，冷却至25-40℃放料，即得祛痘化妆品。本发明的祛痘化妆品能够有效地用于面部痤疮的祛除和预防、皮肤控油、保湿、滋养和修复，且安全无毒；本发明的祛痘药物能够有效地用于面部痤疮的治疗。附图说明图1是显微镜下(放大1000倍)观察的痤疮丙酸杆菌(Propionibacteriumacnes)革兰氏染色照片。图2是正常培养的痤疮丙酸杆菌(Propionibacteriumacnes)(穿刺厌氧培养)照片。图3是小核酸抑制痤疮丙酸杆菌生长照片，图中“+”接入菌种；“-”不接菌种；a为未处理组(不加小核酸)；b为红霉素；c为40mg/mL小核酸；d为80mg/mL小核酸；e为120mg/mL小核酸。图4是小核酸抑制痤疮丙酸杆菌生长照片，图中“+”接入菌种；“-”不接菌种；a为未处理组(不加小核酸)；b为80mg/mL小核酸；c为90mg/mL小核酸；d为100mg/mL小核酸；e为110mg/mL小核酸。图5是显示小核酸抑制大肠杆菌生长的柱形图，其中纵坐标为OD600相对吸光值，横坐标为不同处理组。图6是杯碟法检测小核酸抑制大肠杆菌生长结果的照片。图7是RNA酶消化法纯化的酿酒酵母M-dsRNA和热带假丝酵母M-dsRNA的凝胶电泳图，图中：M为RNAMarker；1为热带假丝酵母总RNA；2为经RNaseT1分离的热带假丝酵母小dsRNA；3为酿酒酵母总RNA；4为经RNaseT1分离的酿酒酵母小dsRNA。图8是实时定量PCR检测小核酸影响皮脂腺细胞内细胞因子的表达变化的柱形图。图9是显示小核酸祛痘化妆品试用效果I的照片。图10是显示小核酸祛痘化妆品试用效果II的照片。图11是显示小核酸祛痘化妆品试用效果III的照片。具体实施方式本文中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度，其中所述的百分含量，除特别说明外，皆指质量百分含量。为方便起见，在下文中，术语“双链核酸分子”、“小核酸”、“小核酸分子”、“RNA”、“RNA分子”、“双链RNA”、“双链RNA分子”或“dsRNA”可以互换，它们表示的意思和范围相同。其中，RNA是正义链和反义链退火形成的双链结构。为方便起见，本发明的包含小核酸分子的祛痘化妆品简称为“小核酸祛痘化妆品”或者“小核酸化妆品”。本发明的包含小核酸分子的祛痘药物简称为“小核酸祛痘药物”或者“小核酸药物”。研究发现，来源于酿酒酵母和热带假丝酵母的RNA、尤其是小核酸分子具有祛痘活性。在酿酒酵母总RNA和热带假丝酵母总RNA中，长度范围为17～100bp的小核酸分子的祛痘活性尤其显著，它们都是双链RNA分子。本发明的小核酸祛痘化妆品和祛痘药物都可以包含一种小核酸分子比如酿酒酵母总RNA、热带假丝酵母总RNA、所述第一类小核酸分子、或者所述第二类小核酸分子；也可以包含两种以上小核酸分子的混合物，即酿酒酵母总RNA、热带假丝酵母总RNA、所述第一类小核酸分子和所述第二类小核酸分子中任意两种以上的任意比例的混合物。本发明的小核酸祛痘化妆品和祛痘药物中，小核酸的重量百分含量下限约为0.001％，优选约为0.005％、0.01％、0.015％、0.02％、0.025％、0.03％、0.035％、0.04％、0.045％、或0.05％；重量百分含量上限约为0.5％，优选约为0.48％、0.45％、0.42％、0.40％、0.38％、0.35％、0.32％或0.3％。如果小核酸的重量百分含量低于约0.001％，则祛痘效果得不到充分体现；如果小核酸的重量百分含量高于约0.5％，则产品成本过高，可能会影响产品销售。应理解，本文中的术语“约”或者“大约”是指所表示的本数可以有±10％的误差范围或浮动范围。优选地，本发明的小核酸祛痘药物还可以包含在祛痘方面与上述小核酸分子有协同作用、但不影响小核酸稳定性和生理活性的其他药物活性成分，比如维A酸类、过氧化苯甲酰、抗生素类(克林霉素、红霉素、氯霉素等)、壬二酸、硫磺等，这些药物活性成分的用量应限制在不引起皮肤过敏的范围内。作为外用药物，其剂型应适合于保持小核酸分子的稳定性、促进小核酸分子经皮吸收即皮肤渗透，优选为含水剂型，比如是软膏剂、乳膏剂、霜剂、搽剂、水剂、洗剂、凝胶剂、涂膜剂、或者喷雾剂等。这些剂型的制备方式已为本领域技术人员所熟知。本领域技术人员可以根据剂型选择合适的药学可接受的外用药辅料，包括填充剂和赋形剂。在上述水剂、搽剂、乳膏剂、软膏剂、洗剂、凝胶剂等中，所使用的主剂只要是药学上允许的主剂则没有特别的限制，可以例举例如水溶性主剂、油性主剂、乳剂性主剂。根据需要，可以使用1种或2种以上这样的主剂。作为水溶性主剂，可以例举例如聚乙二醇(macrogol)、乙醇、甘油、药学上允许的二醇类(例如丙二醇、丁二醇)等。其中，从本发明化合物的溶解度良好的观点考虑，优选药学上允许的二醇类。作为油性主剂，可以例举例如来自矿物的凡士林或石蜡、用液体石蜡使聚乙烯树脂胶化而得到的复合软膏基质(plastibase)、来自生物的蜂蜡等。作为乳剂性主剂，可以例举例如羊毛脂、硬脂醇等。在使用乳剂主剂的场合下，优选进一步添加乳化剂，作为这样的乳化剂，可以例举例如聚氧乙烯硬化蓖麻油、单硬脂酸甘油酯等。软膏剂、乳膏剂、霜剂、凝胶剂和洗剂一般包含基质，如白矿脂、黄矿脂、羊毛脂、白蜂蜡、鲸蜡醇、硬脂醇、硬脂酸、氢化油、凝胶化烃(gelatedhydrocarbon)、聚乙二醇、液态石蜡、角鲨烷等；抗氧化剂，如生育酚衍生物、L-抗坏血酸、二丁基羟基甲苯、丁基羟基茴香醚等；防腐剂，如对羟基苯甲酸酯等；保湿剂，如甘油、丙二醇、透明质酸钠等；表面活性剂，如聚氧乙烯衍生物、脂肪酸甘油酯、蔗糖脂肪酸酯、脱水山梨醇脂肪酸酯、丙二醇脂肪酸酯、卵磷脂等；以及增稠剂，如羧基乙烯基聚合物、黄原胶、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素等。此外，可以根据需要添加稳定剂、防腐剂、吸收促进剂、pH调节剂以及其它合适的添加剂。溶液或乳状液形式的制剂可以包含作为载体物质的溶剂、乳化剂或破乳剂，如水、乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁基乙二醇油、脂肪酸甘油酯、聚乙二醇或脱水山梨醇脂肪酸酯等。悬液形式的制剂可以包含作为载体物质的液体稀释剂如水、乙醇或丙二醇；悬液如乙氧基化异硬脂醇(ethoxylatedisosteatrylalcohol)、聚氧乙烯山梨醇酯和聚氧乙烯脱水山梨醇酯；以及微晶纤维素、偏氢氧化铝(aluminummetahydroxide)、膨润土、琼脂、黄蓍胶等。涂膜剂可以包含例如甲基丙烯酸烷基酯共聚物、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、聚乙烯醇等成膜剂。本发明提供的涂膜剂为小核酸溶解或分散于含成膜材料的溶剂中，涂搽患处后形成薄膜的外用液体制剂。进一步地，上述溶液、乳状液、悬液形式的制剂还可以被附着于高分子材料上用来制备面膜。喷雾剂可以包含在软膏剂、乳膏剂、霜剂、凝胶剂、悬液、水剂和洗剂的制备中所使用的基质，如白矿脂、黄矿脂、羊毛脂、白蜂蜡、鲸蜡醇、硬脂醇、硬脂酸、氢化油、凝胶化烃、聚乙二醇、液体石蜡、角鲨烷等；抗氧化剂，如生育酚衍生物、L-抗坏血酸、二丁基羟基甲苯、丁基羟基茴香醚等；防腐剂，如对羟基苯甲酸酯等；保湿剂，如甘油、丙二醇、透明质酸钠等；表面活性剂，如聚氧乙烯衍生物、脂肪酸甘油酯、蔗糖脂肪酸酯、脱水山梨醇脂肪酸酯、丙二醇脂肪酸酯、卵磷脂等；增稠剂，如羧基乙烯基聚合物、黄原胶、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素等。可以添加不同的稳定剂、缓冲剂、调味剂、悬浮剂、乳化剂、芳香剂、防腐剂、增溶剂以及其它合适的添加剂。特别地，还可以包含推进剂如氯氟烃、丙烷/丁烷或二甲醚。在一种实施方式中，本发明的小核酸祛痘药物为乳膏剂，是小核酸溶解于乳状液型基质中形成的制剂。其制备方法采用本领域中常规的方法，比如按照以下步骤进行：(1)配制油相：称取油性基质组分加热至50℃～100℃熔化，搅匀，保温；(2)配制水相：称取表面活性剂、透皮促进剂溶解于水性基质中，并加热至50℃～100℃，搅匀，保温；(3)将上述油相缓缓加入上述水相中，搅拌10～90分钟；(4)降温至45℃～60℃后，加入小核酸，继续搅拌；(5)待温度降至室温，得到乳膏剂。其中，所述油性基质组分选自凡士林、石蜡、液体石蜡、硅油、蜂蜡、硬脂酸、羊毛脂、单硬脂酸甘油酯中的任一种或任意比例的两种以上组合；所述水性基质组分选自甘油、丙二醇、乙醇、水中的任一种或任意比例的两种以上组合；所述表面活性剂选自单硬脂酸甘油酯、三乙醇胺、十二烷基硫酸钠、聚山梨酯、脂肪酸山梨坦、泊洛沙姆、卵磷脂、明胶中的任一种或任意比例的两种以上组合；所述透皮促进剂选自月桂氮卓酮、聚乙二醇、薄荷醇中的任一种或任意比例的两种以上组合。在另一种实施方式中，本发明的小核酸祛痘药物为软膏剂，是小核酸与油脂性或水溶性基质混合制成的均匀的半固体外用制剂。其制备方法采用本领域中常规的方法，比如按照以下步骤进行：(1)称取油性基质组分加热至50℃～100℃熔化，搅匀，保温；(2)将小核酸和透皮促进剂加入上述油性基质中，搅匀即得。其中，所述油性基质组分选自凡士林、石蜡、液状石蜡、硅油、蜂蜡、硬脂酸、羊毛脂的任一种或任意比例的两种以上组合；所述透皮促进剂选自月桂氮卓酮、聚乙二醇、薄荷醇中的任一种或任意比例的两种以上组合。在另一种实施方式中，本发明的小核酸祛痘药物为凝胶剂，是小核酸与辅料制成的具有凝胶特性的稠厚液体或半固体制剂。其制备方法采用本领域中常规的方法，比如按照以下步骤进行：(1)将凝胶基质组分用溶剂润湿浸泡24小时使其充分溶胀；在搅拌下加入三乙醇胺，调节pH至6.0～8.0，形成透明基质备用；(2)另称取小核酸用水性基质组分溶解后，加入到上述凝胶基质中，搅匀；(3)加入透皮促进剂，将水性基质组分加至足量，搅匀即得。其中，所述凝胶基质组分选自卡波姆、纤维素衍生物、海藻酸盐、西黄蓍胶、明胶、淀粉中的任一种或任意比例的两种以上组合；所述水性基质组分选自甘油、丙二醇、水、乙醇中的任一种或任意比例的两种以上组合；所述透皮促进剂选自月桂氮卓酮、聚乙二醇、薄荷醇中的任一种或任意比例的两种以上组合。在另一种实施方式中，本发明的小核酸祛痘药物为喷雾剂，是小核酸与适宜辅料的溶液或乳状液或混悬液，填充于特制装置中，用时可呈雾状喷出。其制备方法采用本领域中常规的方法，比如按照以下步骤进行：(1)称取小核酸用水性基质组分溶解，搅匀；(2)加入透皮促进剂，将水性基质组分加至足量，搅匀，填充于喷雾装置中即得。其中，所述水性基质组分选自甘油、丙二醇、水、乙醇中的任一种或任意比例的两种以上组合；所述透皮促进剂选自月桂氮卓酮、聚乙二醇、薄荷醇中的任一种或任意比例的两种以上组合。以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。实施例本发明中的酿酒酵母总RNA、热带假丝酵母总RNA、第一类小核酸分子和第一类小核酸分子的制备和测序都由百奥迈科生物技术有限公司完成。实施例中分别给出如下编号：1.热带假丝酵母总RNA，编号BMX；2.酿酒酵母总RNA，编号BMX01；3.第一类小核酸分子之一，编号BM06，序列为：正义链：5’-UAGGUACUUCGAGAAGCCUAGUAdTdT-3’(SEQIDNO:15)，反义链：5’-UACUAGGCUUCUCGAAGUACCUAdTdT-3’(SEQIDNO:16)；4.第一类小核酸分子之二，编号BM05，序列为：正义链：5’-UAGGUACUUCGAGAAGCCUAGUA-3’(SEQIDNO:5)，反义链：5’-UACUAGGCUUCUCGAAGUACCUA-3’(SEQIDNO:6)；5.第二类小核酸分子之一，编号BM01，序列为：正义链：5’-AGGUACUUCGAGAAGCCdTdT-3’(SEQIDNO:13)，反义链：5’-GGCUUCUCGAAGUACCUdTdT-3’(SEQIDNO:14)；6.第二类小核酸分子之二，编号BM02，序列为：正义链：5’-AGGUACUUCGAGAAGCC-3’(SEQIDNO:7)，反义链：5’-GGCUUCUCGAAGUACCU-3’(SEQIDNO:8)。其中，BM05是第一类小核酸分子的主干序列；BM02是第二类小核酸分子的主干序列。实施例11、实验材料及仪器：痤疮丙酸杆菌(Propionibacteriumacnes，ATCC6919)：上海复祥生物；改良的GAM肉汤培养基：上海研生生化；氯化血红素、维生素K1：上海谷研生物；37℃恒温培养箱：百奥迈科生物；超净工作台：苏州净化设备厂。2、实验分组：小核酸BMX浓度分别为：40mg/mL、80mg/mL、120mg/mL；阳性对照：用市售的红霉素软膏做阳性对照，浓度为40mg/mL；无菌种对照：不接种痤疮丙酸杆菌的培养基；未处理对照：接种痤疮丙酸杆菌的培养基，但不加小核酸处理。3、实验步骤：将营养肉汤培养基按说明书配置好后，用高压灭菌115℃/15min，待冷却至50℃时，加入氯化血红素5μg/mL和1μg/mL维生素K1，取4mL移至玻璃试管中，用无菌膜封口冷却至室温后，加入上述处理组的小核酸混匀，培养基凝固后备用。将痤疮丙酸杆菌干粉用无菌水溶解后，用无菌处理后的接种针蘸取后穿刺接种于玻璃试管的培养基中，接种后在玻璃试管培养基顶端再覆盖约1mL液态培养基，待其冷却凝固后，置于37℃恒温培养箱培养72h后拍照观察。4、实验结果1)如图1革兰氏染色结果显示，细菌生长形态符合痤疮丙酸杆菌。2)如图2培养结果显示，穿刺厌氧培养的痤疮丙酸杆菌在培养基中沿穿刺路线生长。3)如图3结果显示，阳性对照红霉素完全抑制了痤疮丙酸杆菌的生长；小核酸浓度在80mg/mL时，部分抑制了痤疮丙酸杆菌的生长；小核酸浓度在120mg/mL时，完全抑制了痤疮丙酸杆菌的生长。结果表明，本发明的小核酸分子具有抑制痤疮丙酸杆菌的活性。实施例21、实验材料及仪器：痤疮丙酸杆菌(Propionibacteriumacnes，ATCC6919)：上海复祥生物；改良的GAM肉汤培养基：上海研生生化；氯化血红素、维生素K1：上海谷研生物；37℃恒温培养箱：上海新苗；超净工作台：苏州净化设备厂。2、实验分组：小核酸BMX浓度分别为：80mg/mL、90mg/mL、100mg/mL、110mg/mL、120mg/mL；阳性对照：用市售的红霉素软膏做阳性对照，浓度为40mg/mL；无菌种对照：不接种痤疮丙酸杆菌的培养基；未处理对照：接种痤疮丙酸杆菌的培养基，但不加小核酸处理。3、实验步骤：将营养肉汤培养基按说明书配置好后，用高压灭菌115℃/15min，待冷却至50℃时，加入氯化血红素5μg/mL和1μg/mL维生素K1，取4mL移至玻璃试管中，用无菌膜封口冷却至室温后，加入上述处理组的小核酸混匀，培养基凝固后备用。将痤疮丙酸杆菌干粉，用无菌水溶解后，用无菌处理后的接种针蘸取后穿刺接种于玻璃试管的培养基中，接种后在玻璃试管培养基顶端再覆盖约1mL液态培养基，待其冷却凝固后，置于37℃恒温培养箱培养72h后拍照观察。4、实验结果如图4结果显示，1)RNA分子BMX的抑菌作用呈浓度依赖性，即浓度越高抑菌效果越强。2)RNA分子BMX浓度在110mg/mL时完全抑制了痤疮丙酸杆菌的生长。实施例31、实验材料及仪器：大肠杆菌(Escherichiacoli)：百奥迈科生物；LB液体培养基：百奥迈科生物；37℃恒温摇床：上海智城；超净工作台：苏州净化设备厂。2、实验分组：小核酸BMX浓度分别为：40mg/mL、80mg/mL、120mg/mL；阳性对照：用氨苄青霉素做阳性对照，浓度为100μg/mL；无菌种对照：不接种大肠杆菌的培养基；未处理对照：接种大肠杆菌的培养基，但不加小核酸处理。3、实验步骤：将LB液体培养基(1％(W/V)Tryptone(胰蛋白胨)、0.5％(W/V)Yeast(酵母浸膏)、1％(W/V)NaCl，pH＝7.0)配置好后，用高压灭菌121℃/20min，取4mL移至玻璃试管中，用无菌膜封口冷却至室温后，加入上述处理组的小核酸混匀备用。将大肠杆菌菌种接种于玻璃试管的培养基中，置于37℃恒温摇床培养过夜，用紫外分光光度计在600nm波长处测定OD600吸光值，并统计处理结果。4、实验结果如图5结果显示，1)不同浓度的小核酸BMX均有抑制大肠杆菌的作用。2)小核酸浓度为80和120mg/mL时完全抑制了大肠杆菌的生长。实施例41、实验材料及仪器：大肠杆菌(Escherichiacoli)：百奥迈科生物技术有限公司；LB固体培养基：百奥迈科生物技术有限公司；37℃恒温摇床：上海智城；超净工作台：苏州净化设备厂。2、实验分组：小核酸BMX浓度分别为：40mg/mL、80mg/mL、120mg/mL；阳性对照：用氨苄青霉素做阳性对照，浓度为100μg/mL；无菌种对照：不接种大肠杆菌的培养基；未处理对照：接种大肠杆菌的培养基，但不加小核酸处理。3、实验步骤：配置LB固体培养基(1％(W/V)Tryptone(胰蛋白胨)、0.5％(W/V)Yeast(酵母浸膏)、1％(W/V)NaCl、1.5％(W/V)Agar(琼脂)，pH＝7.0)，用高压蒸汽灭菌121℃/20min，注入10-15mL至玻璃无菌平皿中，待其自然凝固后备用。将大肠杆菌菌种稀释后均匀涂布于LB固体培养基表面，待菌液吸收干后，在每个培养基表面均匀对称放置4个牛津杯。在牛津杯中分别加入上述不同浓度的小核酸，置于37℃恒温培养箱培养24h，观察细菌生长情况。4、实验结果如图6结果显示，1)不同浓度的小核酸BMX均有抑制大肠杆菌生长的作用。2)小核酸浓度为80和120mg/mL时完全抑制了大肠杆菌的生长。实施例5酵母RNA分离与鉴定1、酵母总RNA：酿酒酵母总RNA(百奥迈科生物技术有限公司)、热带假丝酵母总RNA(百奥迈科生物技术有限公司)。2、主要试剂和材料：RNaseT1(美国Fermentas公司)、RNAMarker(RL1000，TaKaRa公司)，无RNA酶污染的肝糖(上海瑞齐生物科技)，其它生化试剂均购于上海生工。3、主要仪器：超净工作台(SW-CJ-2F苏州净化设备厂)；低温冰箱(-80℃，DF-U4086S，日本三洋)；电泳仪(Bio-Rad，美国)；凝胶成像系统(Biosens，美国)；紫外分光光度计及分析工作站(岛津Shimadazi，日本)等。4、用RNaseT1处理酵母总RNA分离出dsRNA。反应系如下：200μL的液中含有20μL(20μg)RNA；10μL(10U)RNaseT1；20μL10×TEBuffer(10mMTris-HCl、1mMEDTA，pH＝8.0)，150μL无菌水。37℃反应30min，加20μLEDTA(250mM)中止反应，72℃加热20min灭活酶。取5μL电泳分析。并用取lμL酵母dsRNA加入99μL的1×TEBuffer(l00倍稀释)，紫外分光光度计检测OD260及OD280比值(此值在1.8～2.0之间为dsRNA)。5、电泳分析消化产物：分离后的酵母小dsRNA经15％聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果如图7所示，分离的酵母小dsRNA长度主要分布于100bp以下，无DNA及其他单链RNA所见。图中：M为RNAMarker；1为热带假丝酵母总RNA；2为经RNaseT1分离的热带假丝酵母小dsRNA；3为酿酒酵母总RNA；4为经RNaseT1分离的酿酒酵母小dsRNA。6、紫外分光光度计检测：测得经分离热带假丝酵母和酿酒酵母小dsRNA的OD260与OD280比值分别为1.91和1.89，证实为dsRNA。实施例6小核酸刺激皮脂腺细胞后对TLR家族及炎症因子的影响1、实验材料及仪器人皮脂腺细胞：百奥迈科生物技术有限公司，Poly(I:C)：美国Sigma-Aldrich公司；小核酸BM01、BM06、BMX：百奥迈科生物技术有限公司；6孔细胞培养板：美国Corning公司；RISOTMRNA提取试剂：百奥迈科生物技术有限公司；EzOmicsTMOne-StepqPCRKit：百奥迈科生物技术有限公司；ABIStepOnePlus实时荧光定量PCR仪(美国ABI公司)。2、实验分组：小核酸处理组：BM01，50nM；BM06，50nM；Poly(I:C)，10ng/ml；BMX，2.5μg；设置未处理组对照。3、细胞处理：铺6孔板，转染前细胞汇合度约为50％，用上述小核酸处理细胞。4、实时定量PCR(RealtimequantityPCR，RT-qPCR)检测细胞处理48h后用RISOTMRNA提取试剂，按照说明书提取细胞总RNA，用RT-qPCR检测细胞中目的基因的mRNA表达水平。用基因特异性引物检测样本中基因mRNA的表达水平，同时扩增看家基因GAPDH作为内参对照。每个样本同时扩增目的基因和内参基因GAPDH，每个反应做3个平行。用One-StepqPCRkit进行定量反应，建立如下反应体系：2μLRNA模板，12.5μL的2×MasterMix，5’端引物(10μM)和3’端引物(10μM)各0.5μL，0.5μL的50×SYBRGreenISolution，用DEPC处理水补足体系至25μL。混合均匀后，置于实时定量PCR仪上反应。所需引物均由百奥迈科生物技术有限公司合成，序列如下：IL4检测引物：上游引物：5’-ATGAGAAGGACACTCGCTGC-3’(SEQIDNO:9)；下游引物：5’-CCAACGTACTCTGGTTGGCT-3’(SEQIDNO:10)。GAPDH引物：上游引物：5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’(SEQIDNO:11)；下游引物：5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’(SEQIDNO:12)。反应条件：42℃反转录30min，95℃预变性5min，95℃变性20sec，58℃退火30sec，72℃延伸30sec，循环45次。并做溶解曲线反应：95℃/5min，58℃/5min，以0.5℃/5sec升温至95℃。5、统计处理用SPSS14.0统计软件分析，计量数据用平均值±SD表示，多组间差异显著性检验用单因素方差分析，两组间比较用t检验，P<0.05表示差异有统计学意义。6、实验结果如图8所示，与未处理组相比，抑炎细胞因子IL4的表达水平在小核酸的作用下呈显著上调(P<0.05)。实施例7一种小核酸祛痘化妆品，该化妆品由以下重量百分比的组分组成：霍霍巴油2％、二甲基硅油1％、甘油7.5％、1,3-丁二醇5％、1,2-戊二醇2％、1,2-已二醇/辛甘醇0.5％、透明质酸0.02％、辛酸甘油酯0.3％、油溶性维生素E醋酸酯0.2％、丙烯酰二甲基牛磺酸胺/VP共聚物0.65％、黄原胶0.15％、植酸钠0.1％、鲸蜡硬脂醇橄榄油酸酯/山梨坦橄榄油酸酯1％、植物控油因子2％、硅弹体0.5％、小核酸(BMX)0.25％、香精0.15％、余量为去离子水。实施例8一种小核酸祛痘化妆品，该化妆品由以下重量百分比的组分组成：霍霍巴油2％、二甲基硅油1％、甘油7.5％、1,3-丁二醇5％、1,2-戊二醇2％、1,2-已二醇/辛甘醇0.5％、透明质酸0.02％、辛酸甘油酯0.3％、油溶性维生素E醋酸酯0.2％、丙烯酰二甲基牛磺酸胺/VP共聚物0.65％、黄原胶0.15％、植酸钠0.1％、鲸蜡硬脂醇橄榄油酸酯/山梨坦橄榄油酸酯1％、植物控油因子2％、硅弹体0.5％、小核酸(BMX01)0.5％、香精0.15％、余量为去离子水。实施例9一种小核酸祛痘化妆品，该化妆品由以下重量百分比的组分组成：霍霍巴油2％、二甲基硅油1％、甘油7.5％、1,3-丁二醇5％、1,2-戊二醇2％、1,2-已二醇/辛甘醇0.5％、透明质酸0.02％、辛酸甘油酯0.3％、油溶性维生素E醋酸酯0.2％、丙烯酰二甲基牛磺酸胺/VP共聚物0.65％、黄原胶0.15％、植酸钠0.1％、鲸蜡硬脂醇橄榄油酸酯/山梨坦橄榄油酸酯1％、植物控油因子2％、硅弹体0.5％、小核酸(BM01)0.003％、香精0.15％、余量为去离子水。实施例10一种小核酸祛痘化妆品，该化妆品由以下重量百分比的组分组成：霍霍巴油2％、二甲基硅油1％、甘油7.5％、1,3-丁二醇5％、1,2-戊二醇2％、1,2-已二醇/辛甘醇0.5％、透明质酸0.02％、辛酸甘油酯0.3％、油溶性维生素E醋酸酯0.2％、丙烯酰二甲基牛磺酸胺/VP共聚物0.65％、黄原胶0.15％、植酸钠0.1％、鲸蜡硬脂醇橄榄油酸酯/山梨坦橄榄油酸酯1％、植物控油因子2％、硅弹体0.5％、小核酸(BM06)0.001％、香精0.15％、余量为去离子水。实施例11一种小核酸祛痘化妆品，该化妆品由以下重量百分比的组分组成：霍霍巴油2％、二甲基硅油1％、甘油7.5％、1,3-丁二醇5％、1,2-戊二醇2％、1,2-已二醇/辛甘醇0.5％、透明质酸0.02％、辛酸甘油酯0.3％、油溶性维生素E醋酸酯0.2％、丙烯酰二甲基牛磺酸胺/VP共聚物0.65％、黄原胶0.15％、植酸钠0.1％、鲸蜡硬脂醇橄榄油酸酯/山梨坦橄榄油酸酯1％、植物控油因子2％、硅弹体0.5％、小核酸(BM06)0.003％、香精0.15％、余量为去离子水。实施例12制备实施例7-11小核酸祛痘化妆品的方法，具体如下：1)A相混合物配置，分别称取以下组分混合：霍霍巴油2％、二甲基硅油1％、甘油7％、1,3-丁二醇5％、1,2-戊二醇2％、1,2-已二醇/辛甘醇0.5％、辛酸甘油酯0.3％、油溶性维生素E醋酸酯0.2％、丙烯酰二甲基牛磺酸胺/VP共聚物0.65％、黄原胶0.15％、植酸钠0.1％、鲸蜡硬脂醇橄榄油酸酯/山梨坦橄榄油酸酯1％，余量为去离子水；2)B相混合物配置，分别称取以下组分混合：透明质酸0.02％、去离子水3％、硅弹体0.5％；3)C相混合物配置，分别称取以下组分混合：甘油0.5％、小核酸0.001-0.5％、去离子水3％、植物控油因子2％、香精0.15％；4)取A相在30-45rpm的转速下搅拌并加热至85℃，保温30分钟，开真空并改搅拌为最大速72rpm，均质5分钟，改搅拌速度至30-45rpm，降温至60℃；5)加入B相，开真空，最大速72rpm搅拌，均质2分钟，改搅拌速度至30-45rpm，冷却至50℃；6)加入C相，开真空，最大速72rpm搅拌，，均质2分钟，改搅拌速度至30-45rpm，继续冷却，3分钟后改搅拌低速至20-30rpm，冷却至25-40℃放料，即得小核酸祛痘化妆品。实施例13用本发明实施例7-11的小核酸祛痘化妆品进行试用，具体如下：1、实验对象：年龄分布于15～33岁(平均年龄22.9岁)的男性和女性。面部和颈脖部位有不同程度的痤疮，诱因有激素分泌旺盛、内分泌失调、服用药物、化妆品使用不当等。2、实验方法：每天早晚净脸后均匀涂抹小核酸祛痘化妆品于患处，也可全脸或颈脖部位均匀涂抹。两周为一个观察周期。3、将痤疮按严重程度分为(按国际上通用的痤疮的三度四级分类法)：1)I(轻度)：粉刺为主要损害，可有少量的丘疹和脓包，总病灶数少于30个；2)II(中度)：有粉刺，并有中等数量的丘疹和脓包，总病灶数在31-50个之间；3)III(亚重度)：有大量的丘疹和脓包，总病灶数在51-100个之间，偶尔有大的炎性损坏，结节小于3个；4)IV(重度)：主要为结节、囊肿或聚合性痤疮。总病灶数在100个以上，病损数在100个以上，结节或囊肿在3个以上。4、疗效评价分级(参照卫生部皮肤病药物临床研究指导原则)：“-”(无效)，皮损消退<20％或加重；“+”(有效)，皮损消退>20％～60％；“++”(显效)，皮损消退>60％；“+++”(痊愈)，皮损消退。5、治疗效果如下：6、图9-11显示了具有代表性的患者祛痘效果照片(使用前和使用后比较)。从这些照片可以看出，使用本发明的祛痘化妆品涂抹皮肤两周后，原来的痤疮部位的症状都明显减轻，有患者的痤疮几近消失。实施例14一种小核酸祛痘药物，该药物为乳膏剂，由以下组分组成：小核酸BMX1g、硬脂酸40g、单硬脂酸甘油酯40g、凡士林20g、液体石蜡70g、甘油50g、三乙醇胺3g、十二烷基硫酸钠3g、月桂氮卓酮2g、纯化水适量，全量1000g。制备该小核酸祛痘药物的方法如下：(1)油相：准确称取硬脂酸、单硬脂酸甘油酯、凡士林、液体石蜡置水浴上加热熔化，搅匀，保温在75℃左右；(2)水相：准确称取甘油、三乙醇胺、月桂氮卓酮、十二烷基硫酸钠和水，在水浴中加热搅拌溶解，并加热至75℃。(3)将上述油相缓缓加入水相中，搅拌15分钟后，保持搅拌。(4)降温至55℃左右，加入处方量的小核酸BMX，继续搅拌。(5)待温度降至室温，得到乳膏。实施例15一种小核酸祛痘药物，该药物为乳膏剂，由以下组分组成：小核酸BM061g、硬脂酸40g、单硬脂酸甘油酯40g、凡士林20g、液体石蜡70g、甘油50g、三乙醇胺3g、十二烷基硫酸钠3g、月桂氮卓酮2g、纯化水适量，全量1000g。制备该小核酸祛痘药物的方法如下：(1)油相：准确称取硬脂酸、单硬脂酸甘油酯、凡士林、液体石蜡置水浴上加热熔化，搅匀，保温在75℃左右；(2)水相：准确称取甘油、三乙醇胺、月桂氮卓酮、十二烷基硫酸钠和水，在水浴中加热搅拌溶解，并加热至75℃。(3)将上述油相缓缓加入水相中，搅拌15分钟后，保持搅拌。(4)降温至55℃左右，加入处方量的小核酸BM06，继续搅拌。(5)待温度降至室温，得到乳膏。实施例16一种小核酸祛痘药物，该药物为凝胶剂，由以下组分组成：小核酸BM011g、卡波姆10g、丙二醇50g、甘油50g、三乙醇胺10ml、乙醇20ml、月桂氮卓酮5g、纯化水适量，全量1000g。制备该小核酸祛痘药物的方法如下：将甘油、丙二醇加入到卡波姆中使其润湿，并加入约500ml纯化水，静置24h使其充分溶胀；在搅拌下加入三乙醇胺，调节pH至6.5-7.5，形成透明基质备用；另称取小核酸BM01，加入到上述凝胶中，搅匀；最后加入月桂氮卓酮，加纯化水至足量，搅匀，即得凝胶剂。实施例17用本发明实施例14-16的小核酸祛痘药物进行试用，具体如下：1、实验对象：年龄分布于18～33岁(平均年龄23.5岁)的男性和女性。面部和颈脖部位有不同程度的痤疮，诱因有激素分泌旺盛、内分泌失调、服用药物、化妆品使用不当等。2、实验方法：每天早晚净脸后均匀涂抹小核酸祛痘化妆品于患处，也可全脸或颈脖部位均匀涂抹。两周为一个观察周期。3、将痤疮按严重程度分为(按国际上通用的痤疮的三度四级分类法)：1)I(轻度)：粉刺为主要损害，可有少量的丘疹和脓包，总病灶数少于30个；2)II(中度)：有粉刺，并有中等数量的丘疹和脓包，总病灶数在31-50个之间；3)III(亚重度)：有大量的丘疹和脓包，总病灶数在51-100个之间，偶尔有大的炎性损坏，结节小于3个；4)IV(重度)：主要为结节、囊肿或聚合性痤疮。总病灶数在100个以上，病损数在100个以上，结节或囊肿在3个以上。4、疗效评价分级(参照卫生部皮肤病药物临床研究指导原则)：“-”(无效)，皮损消退<20％或加重；“+”(有效)，皮损消退>20％～60％；“++”(显效)，皮损消退>60％；“+++”(痊愈)，皮损消退。5、治疗效果如下：祛痘药物例数痊愈显效有效无效总有效率实施例14小核酸祛痘药物251192388.00％实施例15小核酸祛痘药物19971289.47％实施例16小核酸祛痘药物20881385.00％综上所述，本发明的祛痘化妆品和祛痘药物能够有效地用于面部痤疮的祛除，且安全无毒，具有广阔的商业前景。当前第1页1 2 3