本发明涉及一种中药有效成分的检测方法，特别涉及一种用于治疗儿童脾胃虚弱、饮食积滞、厌食的神曲消食口服组合物的检测方法。
背景技术：
小儿厌食症(anorexia)是指较长期的食欲减退或消失、食量减少为主要症状，是现今小儿中常见的病症。严重者可造成营养不良及多种维生素与微量元素缺乏，影响小儿生长发育。
现有技术如湖北中医学院学报，湖北中医杂志，中国医院药学杂志等公开了一种脾胃宁口服液，其由：山楂(炒焦)75g，六神曲(炒焦)75g，麦芽(炒焦)75g，白芍125g，党参75g，茯苓75g，白术(炒)42g等药物组成。方中以焦三仙为君药，即焦山楂酸甘温主消肉食，焦神曲主消面食，焦麦芽主消米食。白芍、党参、茯苓、白术共为臣药，白芍味酸性寒，敛阴益阴，且能缓急止痛；党参味甘性平，补中益气，配合茯苓、白术、使健脾和胃，使化源充实，主治小儿厌食症属脾虚食积型者。
另外的文献公开了一种脾胃宁口服液，以焦三仙为君药，即焦山楂酸甘温主消肉食，焦神曲主消面食，焦麦芽主消米食；白芍、党参、茯苓、白术共为臣药，白芍味酸性寒，敛阴益阴，配甘草更得酸甘化阴，且能缓急止痛，党参味甘、性平，补中益气，配合茯苓、白术、甘草健脾和胃，化源充实；木香、砂仁、延胡索为佐药，理气消胀、开胃醒脾止痛；甘草味甘、性平，补脾益气，又能调和诸药，故为佐使药。全方合用，功可消食导滞、理气止痛、健脾益气。
但上述文献没有公开以下配方组成的药物及其检测方法
山楂(炒焦)10-18重量份，六神曲(炒焦)10-18重量份，麦芽(炒焦)12-20重量份，白芍20-28重量份，党参12-18重量份，茯苓8-18重量份，白术(炒)6-10重量份，木香6-12重量份，砂仁2-8重量份，延胡索(醋制)10-18重量份，炙甘草8-15重量份。
现有检测方法并不适合上述配方组合物的检测，阴性略有干扰，而且对照品以甲醇溶解导致色谱峰对称性不是十分理想，理论塔板数通常在3000至4200 之间，流动相中酸含量较高，对色谱柱的性能可能影响比较大，导致色谱柱使用不了多长时间，其理论塔板数就会下降而达不到要求，因此有待进一步优化。
本发明经过研究开发出一种适合上述配方制备的药物的检测方法，对照品色谱峰对称性好、灵敏度高、准确度好，为更好地控制产品质量提供了保证。
技术实现要素：
本发明提供一种中药口服组合物的检测方法，所述口服组合物由以下重量配比的中药原料药制备而成：
山楂(炒焦)10-18重量份，六神曲(炒焦)10-18重量份，麦芽(炒焦)12-20重量份，白芍20-28重量份，党参12-18重量份，茯苓8-18重量份，白术(炒)6-10重量份，木香6-12重量份，砂仁2-8重量份，延胡索(醋制)10-18重量份，炙甘草8-15重量份。
本发明所述口服组合物(称为神曲消食口服组合物)，可以包括任何一种供口服的药物剂型，如：片剂，胶囊剂，颗粒剂，口服液，滴丸剂、丸剂等，本发明优选的剂型为口服液(称为神曲消食口服液)。
本发明的中药组合物，是通过将上述配方组成的中药原料经过提取或其他方式加工，制成药物活性物质，随后，以该物质为原料，需要时加入药物可接受的载体，按照制剂学的常规技术制成的。所述活性物质可以通过分别提取中药原料得到，也可以通过共同提取中药原料得到，也可以通过其他方式得到，如：通过粉碎、压榨、煅烧、研磨、过筛、渗漉、萃取、水提、醇提、酯提、酮提、层析等方法得到、这些活性物质可以是浸膏形式的物质，可以是干浸膏也可以是流浸膏，根据制剂的不同需要决定制成不同的浓度。
本发明的口服组合物中的药物活性物质，其在制剂中所占重量百分比可以是0.1-99.9％，其余为药物可接受的载体。本发明的药物组合物，以单位剂量形式存在，所述单位剂量形式是指制剂的单位，如片剂的每片，胶囊的每粒胶囊，口服液的每瓶，颗粒剂每袋等。
本发明的口服组合物，其口服给药的制剂可含有常用的赋形剂，诸如粘合剂、填充剂、稀释剂、压片剂、润滑剂、崩解剂、着色剂、调味剂和湿润剂，必要时可对片剂进行包衣。适用的填充剂包括纤维素、甘露糖醇、乳糖和其它类似的填充剂。适宜的崩解剂包括淀粉、聚乙烯吡咯烷酮和淀粉衍生物，例如羟基乙酸淀粉钠。适宜的润滑剂包括，例如硬脂酸镁。适宜的药物可接受的湿润剂包括十二烷基硫酸钠。可通过混合，填充，压片等常用的方法制备固体口服组合物。进行反复混合可使活性物质分布在整个使用大量填充剂的那些组合物中。
本发明的口服组合物，口服液体制剂的形式例如可以是水性或油性悬浮液、溶液、乳剂、糖浆剂或酊剂，或者可以是一种在使用前可用水或其它适宜的载体复配的干燥产品。这种液体制剂可含有常规的添加剂，诸如悬浮剂，例如山梨醇、糖浆、甲基纤维素、明胶、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、硬脂酸铝凝胶或氢化食用脂肪，乳化剂，例如卵磷脂、脱水山梨醇一油酸酯或阿拉伯胶；非水性载体(它们可以包括食用油)，例如杏仁油、分馏椰子油、诸如甘油的酯的油性酯、丙二醇或乙醇；防腐剂，例如对羟基苯甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸，并且如果需要，可含有常规的香味剂或着色剂。
本发明的口服组合物，在制备成药剂时可选择性的加入适合的药物可接受的载体，所述药物可接受的载体选自：甘露醇、山梨醇、焦亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠、盐酸半胱氨酸、巯基乙酸、蛋氨酸、维生素C、EDTA二钠、EDTA钙钠，一价碱金属的碳酸盐、醋酸盐、磷酸盐或其水溶液、盐酸、醋酸、硫酸、磷酸、氨基酸、氯化钠、氯化钾、乳酸钠、木糖醇、麦芽糖、葡萄糖、果糖、右旋糖苷、甘氨酸、淀粉、蔗糖、乳糖、甘露糖醇、硅衍生物、纤维素及其衍生物、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、土温80、琼脂、碳酸钙、碳酸氢钙、表面活性剂、聚乙二醇、环糊精、β-环糊精、磷脂类材料、高岭土、滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁等。
优选的本发明口服组合物的制备方法，所述方法步骤如下：
步骤1，砂仁，木香，白术水提取并收集挥发油；
步骤2，收集挥发油后的药渣、药液与其余药材共同加水煎煮1-3次，每次1-3小时，煎煮液滤过，浓缩，得浓缩液；
步骤3，浓缩液加乙醇使含醇量达到40-80％，冷藏放置8-96小时，醇沉后滤过，滤液减压回收乙醇至无醇味；得到无醇液；
步骤4，无醇液加入步骤1所得挥发油，与药物可接受的载体混合，制备成口服制剂组合物。
最优选的，本发明口服组合物的制备方法，步骤如下：
步骤1，砂仁，木香，白术加8-40倍量水提取并收集挥发油；
步骤2，收集挥发油后的药渣药液与其余药材共同加水煎煮2-3次，每次加水6-10倍，煎煮1-3小时，合并煎煮液，滤过，浓缩；
步骤3，加乙醇使含醇量达到55-75％，冷藏10-48小时，沉淀析出，滤过，滤液减压回收乙醇至无醇味，
步骤4，加入挥发油及适量表面活性剂，再加入天门冬酰苯丙氨酸甲酯或三氯蔗糖适量、防腐剂适量，用蒸馏水调至总量1000ml，冷藏，滤过，滤液灌装，灭菌即得口服液，在以下实验中称为神曲消食口服液。
本发明提供一种本发明药物(称为神曲消食口服组合物)的检测方法，特别是针对上述神曲消食口服液的检测方法，所述方法包括以下步骤：
1)对照品溶液的制备
取芍药苷对照品加甲醇水溶液制成芍药苷对照品溶液；
2)供试品溶液的制备
取供试品上聚酰胺吸附柱，用水洗脱，收集洗脱液，滤过，取续滤液，即得。
3)测定
分别取对照品溶液、供试品溶液注入液相色谱仪，得到色谱图，根据峰面积计算供试品溶液中有效成分的含量。
其中的色谱条件如下：
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.1％的磷酸溶液(14：86)为流动相；检测波长为232nm，理论塔板数按芍药苷峰计算应不低于3000。
优选的，本发明的测定方法，步骤如下：
1)对照品溶液的制备
取芍药苷对照品适量，精密称定，加甲醇水溶液制成每0.5-1.5ml含芍药苷100-130μg的溶液，即得。
2)供试品溶液的制备
精密量取本品8-14ml，加到聚酰胺吸附柱上，用水25-40ml洗脱，收集洗脱液置量瓶中，加水定容，摇匀。用微孔滤膜(0.45μm)滤过，取续滤液，即得。
5)测定法
分别取对照品溶液、供试品溶液各5-15μl注入液相色谱仪，得到色谱图，根据峰面积计算供试品溶液中有效成分的含量。
最优选的，本发明的测定方法，步骤如下：
1)对照品溶液的制备
取芍药苷对照品适量，精密称定，加甲醇水溶液制成每1ml含芍药苷110-120μg的溶液，即得。
2)供试品溶液的制备
精密量取本品10-12ml，加到聚酰胺吸附柱上，用水30-40ml洗脱，收集洗脱液置50ml量瓶中，加水至刻度，摇匀。用微孔滤膜(0.45μm)滤过，取续滤液，即得。
5)测定法
分别取对照品溶液、供试品溶液各10μl注入液相色谱仪，得到色谱图，根据峰面积计算供试品溶液中有效成分的含量。
本发明优选的方法、色谱条件和溶剂提取方法，是经过筛选得到的，筛选过程如下：
一、改进前的检测方法及系统适用性初步试验
表1系统适用性试验
结果表明，对照品溶液中芍药苷色谱峰的理论塔板数均大于3000，连续5 针对照品溶液峰面积和保留时间的RSD均小于2％，色谱峰的对称性较差(对称因子约1.84)，峰形不好。
另外还进行了其他多项实验，实验结果不理想。
结论
该方法阴性略有干扰，对照品色谱峰对称性不理想，理论塔板数通常在3000至4200之间，流动相中酸含量较高，对色谱柱的性能影响比较大，导致色谱柱使用不了多长时间，其理论塔板数就会下降而达不到要求，因此有待进一步优化。二、测定方法的优化
鉴于上述原因，我们对现有的含量测定方法进行了改进，在不改变提取方法的前提下，对流动相系统和配制方法进行了调整，并对新方法进行了验证，详情如下。
系统适用性与专属性试验
表3系统适用性试验
结果表明，对照品溶液中芍药苷色谱峰的理论塔板数均大于10000，连续5针对照品溶液峰面积和保留时间的RSD均小于2％，对称因子在0.8-1.2之间，系统适用性良好。
表4专属性试验
结果表明，供试品溶液和对照品溶液中芍药苷峰的保留时间基本一致，空白溶液和阴性供试品溶液在该保留时间无色谱峰检出，供试品对照品混合溶液色谱峰未开裂。
线性关系考察
取芍药苷对照品约24mg，精密称定，置于20ml容量瓶中，加甲醇至刻度，作为对照品储备液。
分别精密量取对照品储备液2mL、2mL、3mL、2mL、5mL，分别置于20mL、10mL、10mL、5mL、10mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，得到相当于试验水平100％、200％、300％、400％、500％的对照品溶液。分别精密量取相当于试验水平100％的对照品溶液4mL、8mL，分别置于10mL、10mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，分别得到相当于试验水平40％、80％的对照品溶液。分别精密吸取上述对照品溶液各10μl，注入液相色谱仪，按2.4.3.1的色谱条件记录色谱图，以芍药苷对照品浓度(mg/ml)为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。
表5芍药苷的线性关系
结果表明，芍药苷在0.0461～0.5758mg/ml范围内线性关系良好。
重复性试验
配制6份供试品溶液，进行测定，结果见表6。
表6重复性试验
结果表明，RSD＝0.67％，该方法重复性良好。
中间精密度试验
第二位实验人员另一天使用另一台仪器，重新制备对照品及供试品溶液，进行测定，结果见表7。
表7中间精密度试验
结果表明，RSD＝0.34％，该方法中间精密度良好。
上述所测定精密度的十二个数据的平均值为1.19mg/ml，RSD＝1.08％。
结果表明，该方法精密度良好。
准确度试验
耐用性
在其他条件不变的情况下，分别改变溶液放置时间、柱温、流速、流动相比例及色谱柱，对照品溶液和供试品溶液进样测定，考察对结果的影响。
稳定性试验
配制对照品溶液及供试品溶液，分别于配制后0、2、4、6、8、10、12小时进行测定，结果见表10。
表10稳定性试验
柱温改变
分别采用23℃、25℃和27℃的柱温测定，结果见表11。
流速改变
分别采用0.8ml/min、1.0ml/min和1.2ml/min的流速测定，结果见表11。
流动相比例改变
分别采用乙腈：0.1％磷酸溶液为16：84、14：86、12：88的流动相比例测定，结果见表11。
结果表明，对照品溶液及供试品溶液在12小时内稳定，柱温、流速、流动相比例的较小变动对测定结果没有影响。
结论
通过方法学各项指标(系统适用性及专属性、线性、重复性、中间精密度、准确度、耐用性)的考察，本发明建立的神曲消食口服液中芍药苷含量测定的方法均符合要求，说明该方法稳定可靠，重复性好，精密度高，准确度良好，是合理、可行的检测方法，能够有效地控制产品质量。
附图说明
图1芍药苷线性关系图，芍药苷在0.0461～0.5758mg/ml范围内线性关系良好。
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明。
实施例1
色谱条件
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.1％的磷酸溶液(14：86)为流动相；检测波长为232nm。理论塔板数按芍药苷峰计算应不低于3000。
对照品溶液的制备
取芍药苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含芍药苷110-120μg的溶液，即得。
供试品溶液的制备
精密量取本品10-12ml，加到聚酰胺吸附柱上，用水30-40ml洗脱，收集洗脱液置50ml量瓶中，加水至刻度，摇匀。用微孔滤膜(0.45μm)滤过，取续滤液，即得。
测定法
分别精密吸取对照品溶液、阴性溶液、供试品溶液、供试品加对照品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。