本发明涉及茯苓新酸制备方法及其在制备利尿药物中的应用，属于医药技术领域。
背景技术：
茯苓皮为真菌茯苓菌核的外皮。茯苓主要分布在中国、日本、韩国等地。茯苓始载于《神农草本经》，其后的其他医学著作如《中国医学大辞典》、《中华本草》、《医学启源》和《中国药典》均有记载，2010版《中国药典》开始收载茯苓皮作为一种利水渗湿类中药。《中国药典》记录茯苓皮甘、淡，平。归肺、脾、肾经，其功能利水消肿，主要用于水肿，小便不利。
茯苓皮是中药制备茯苓过程中的下脚料或副产品。茯苓新酸、茯苓酸、去氢土莫酸、去氢齿孔酮酸等四环三萜酸类化合物是茯苓皮是主要化学成分。中医记载茯苓素具有渗湿利尿之功效，茯苓素是由茯苓真菌中提取的多成分的四环三萜类混合物。茯苓饼对于水肿病人有显著的疗效。四环三萜类化学成分具有和醛固酮类似的化学结构。体外实验表明茯苓素可以与大鼠肾胞浆膜醛固酮受体结合，体内实验表明茯苓素可以拮抗醛固酮活性，茯苓素可以促进钠离子的排泄，提高尿中Na+/K+比值，且具有剂量依赖关系，但茯苓素不影响大鼠血浆醛固酮和血管紧张素的水平。实验表明它可能是一种醛固酮受体拮抗剂。其它的研究显示茯苓皮的乙醇提取物和乙酸乙酯提取物有显著的利尿活性。中医治疗肝硬化是依靠促腹水转化机制，茯苓皮对小鼠腹膜淋巴孔有一定的调控作用，使腹膜淋巴孔开放数目增多和孔径变大，具有一定的促腹水吸收作用。茯苓酸A具有一定的细胞毒活性和具有抗肿瘤的作用，3-表去氢土莫酸能够被人体小肠的上皮细胞吸收且具有清除自由基的活性。
目前已报到的对茯苓皮研究主要集中于化学成分的分离与结构鉴定(四环三萜类化合物和多糖)及提取物的活性评价(利尿、抗溶血、抗癌、抗炎、抗菌、抗病毒等)。部分研究报道了茯苓皮或复方制剂的利水渗湿作用的基础研究和临床应用，以水煎煮提取物为主，水提物大部分是极性大的化学成分，其利尿活性并不明显，目前对于茯苓皮的研究没有新的发现和突破。到目前为止，茯苓皮的利尿活性成分不清楚。为了明确茯苓皮的利尿活性成分，充分的利用和开发茯苓皮，申请者对茯苓皮乙醇提取物的化学成分进行了分离与结构鉴定并对部分化合物进行了利尿研究，结果发现茯苓皮的化学成分茯苓新酸具有显著的利尿活性，这与中医药茯苓皮利水渗湿功效相吻合。目前的化药利尿药吲达帕胺和呋塞米存在易引起低血钾和心律不齐的副作用；噻嗪类利尿剂氯噻嗪、氯噻酮和双氢克尿塞存在降低体内的钾含量的缺点，此外，噻嗪类利尿剂可增加患者胆汁中胆固醇的饱和度，进一步导致增加胆囊炎的发病率。因此有待于进一步从天然资源中寻找新的利尿药。
技术实现要素：
2010版《中国药典》收载茯苓皮的功能主治利水消肿，用于治疗水肿和小便不利等症。以生理盐水负荷的正常大鼠水潴溜模型对茯苓皮的四环三萜类化学成分进行利尿活性评价。收集6小时的大鼠尿液，记录每小时的尿量、测量尿液pH值、测定尿液钠、钾、氯离子的含量、计算钠/钾比值，本发明研究结果发现茯苓皮的化学成分茯苓新酸有显著的利尿作用。增加尿量的同时亦能增加大鼠体内钠离子排出和钾离子的保留，起到保钾排钠的作用。
本发明提供了茯苓新酸用于制备利尿药物的应用。
本发明用茯苓新酸制备利尿药物以常规药用制剂的形式来使用；所述的常规药物用制剂含作为活性组分在制剂中与药学上可接受的载体，如适宜于肠胃内和肠胃外给药的有机或无机的固体或液体赋形剂混合，该药用制剂可以是固体形式如片剂、胶囊剂、散剂、丸剂、颗粒剂等。
本发明的药物制剂中可含有辅助物质、稳定剂、润湿剂和其它常用的添加剂，如硬脂酸、乳糖、柠檬酸、硬脂酸镁、石膏粉、玉米淀粉、明胶、琼脂、橄榄油、乙二醇、抗坏血酸等。
本发明的药物制剂可按照各种制剂常规的制备工艺制成。
本发明研究发现茯苓新酸对生理盐水负荷的水潴溜大鼠有较好的利尿作用，茯苓新酸有促进钠离子排出的同时有减少钾离子排出的效应，说明茯苓新酸有保钾排钠的作用。其利尿作用虽然不及呋塞米快，但是却比呋塞米作用时间长，具有长效温和的效果，可为临床提供一种新的利尿药物候选药物。
附图说明
图1为不同时间段茯苓新酸灌胃给药对大鼠尿量的影响图。
具体实施方式
为了验证茯苓新酸利尿的效果，申请人以生理盐水负荷的水潴溜大鼠模型进行了药效学实验，实验药物、动物、仪器、方法及结果如下：
1.实验药物
螺内酯片：杭州民生药业有限公司产品，批号T15L035，生产日期151225；呋塞米片：上海朝晖药业有限公司产品，批号1602N14，生产日期20160225；茯苓新酸是从茯苓皮中提取分离并通过各种波谱与光谱技术(1H NMR,13C NMR,2D NMR,MS,UV和IR)进行鉴定结构。
2.实验动物
体重180-220g的雄性Sprague-Dawley大鼠购买于西安交通大学医学部实验动物中心，动物生产许可证号：SCXK(陕)2012-003。
3.实验仪器
ZH-B6型大鼠代谢笼(安徽淮北正华生物仪器有限公司)，TD型电子天平(余姚市金诺天平仪器有限公司)，美特列-托利多十万分子一分析天平。
4.实验方法
1)茯苓新酸的利尿实验
SD大鼠随机分为6组：正常对照组、茯苓新酸小剂量组(5mg/kg)、茯苓新酸中剂量组(10mg/kg)、茯苓新酸大剂量组(20mg/kg)、螺内酯组(40mg/kg)、呋塞米组(20mg/kg)，每组8-12只大鼠，禁食不禁水12h后各组均按5ml/100g体重灌胃给予生理盐水，并用手轻压腹部使其排尽余尿，给药各组均按1ml/100g体重灌胃，正常对照组给自来水1ml/100g。给药后立即将大鼠分别放入方形不锈钢的代谢笼，每笼1只。给药后在代谢笼下面放置带刻度的试管，每小时记录1次尿量，连续收集6小时尿量，记录每小时每只动物的尿量，计算每组动物每小时的尿量的平均值和标准误，计算6h每组动物总尿量的平均值和标准误，测定尿液pH值，测定尿样中电解质钠(Na+)、钾(K+)及氯(Cl-)的含量，进行统计学分析。
2)药效计算
结果均以平均值±SE表示，采用t检验，计算t，P值，将治疗组与空白组进行组间差异性比较，t检验，P<0.05为有显著性差异；P<0.01为有非常显著性差异，判断茯苓新酸对生理盐水负荷的水潴溜大鼠模型的利尿效果。
3)实验结果
(1)茯苓新酸的提取及结构鉴定
茯苓新酸的提取制备工艺：经过干燥的茯苓皮药材粉碎后用3-5倍体积的95％乙醇浸泡48小时，开始渗漉，浓缩提取物，回收乙醇，得棕色膏状物。膏状物用蒸馏水溶解后乙酸乙酯萃取3次，乙酸乙酯萃取物溶于甲醇，用MCI填料拌样，上MCI色谱柱，采用10:90-60:40甲醇-水梯度洗脱；洗脱成分浓缩再上200-300目的硅胶柱，二氯甲烷-甲醇洗脱，收集馏分，合并浓缩，最后得茯苓新酸，茯苓新酸用于利尿实验。
白色粉末，C30H46O3，MW：454，EI-MS m/z:453[M-H]－；1H NMR(pyridine-d5,800MHz)δ:0.98(3H,s,H3-18),1.03(3H,s,H3-30),1.11(3H,s,H3-19),1.14(3H,s,H3-29),1.20(3H,s,H3-28),1.60(3H,s,H3-27),1.64(3H,s,H3-26),2.64(1H,td,J＝11.45,3.29Hz,H-20),3.43(1H,t,J＝7.55,H-3),5.32(1-H,tt,J＝7.11,H-24),5.34(IH,brd,J＝5.56,H-11),5.59(1H,brd,J＝4.38,H-7)；13C NMR(200MHz,Pyridine-d5)给出30个碳信号，根据DEPT谱推断分别为7个甲基，8个亚甲基，7个次甲基(包括3个双键碳δ121.21,116.65,124.92),7个季碳(含3个双键碳δ142.81,146.53,131.64和一个羧基碳δ178.72)。13C NMR(pyridine-d5,200MHz)δ:36.32(C-1),28.80(C-2),77.97(C-3),39.31(C-4),49.70(C-5),23.51(C-6),121.21(C-7),142.81(C-8),146.53(C-9),37.80(C-10),116.65(C-11),35.98(C-12),44.23(C-13),50.44(C-14),31.58(C-15),27.27(C-16),48.14(C-17),16.24(C-18),22.95(C-19),49.70(C-20),178.72(C-21),33.32(C-22),26.76(C-23),124.92(C-24),131.64(C-25),25.76(C-26),17.70(C-27),28.65(C-28),16.60(C-29),25.84(C-30)。根据以上数据与文献对照，鉴定该化合物为：茯苓新酸，英文名称：3β-hydroxylanosta-7,9(11),24-trien-21-oic acid；中文名称：3β-羟基羊毛甾烷-7,9(11),24-三烯-21-酸。茯苓新酸(3β-hydroxylanosta-7,9(11),24-trien-21-oic acid)的化学结构式如下所示：
(2)不同剂量的茯苓新酸对大鼠尿量的影响
图1和表1显示茯苓新酸小、中、大3个剂量组对尿量均有增加的趋势，与正常对照组相比，小、中、大3个剂量组均存在不同时间的不同程度的利尿效果。以正常对照组为参照，则茯苓新酸三组尿量分别增加了20.6％、25.8％、11.5％。增加率均超过10％，特别是茯苓新酸中剂量组利尿效果最显著，与阳性对照药螺内酯的尿量接近，提示茯苓新酸有较好的利尿效果。但茯苓新酸三个不同的剂量组大鼠6h尿量低于螺内酯和呋塞米组，结果表明茯苓新酸的利尿程度弱于螺内酯和呋塞米，与螺内酯和呋塞米组比较，茯苓新酸的利尿作用呈现温和而持久的效果。
表1不同剂量的茯苓新酸灌胃给药大鼠的尿量的影响
注：给药组与水对照组组间进行t检验，与对照组比*P<0.05，**P<0.01
(3)不同剂量的茯苓新酸对大鼠尿液pH值的影响
与正常对照组大鼠相比，茯苓新酸三个剂量组增加尿液pH值并存在统计学上的显著性差异。螺内酯也增加尿液的pH值并存在统计学上的显著性差异。呋塞米对尿液的pH值没有影响。
(4)不同剂量的茯苓新酸对大鼠尿液电解质钠、钾及氯离子排出量的影响
表2显示茯苓新酸对大鼠尿液电解质钠、钾及氯离子的影响，与正常对照组大鼠相比，茯苓新酸有增加电解质钠离子的排出的趋势，茯苓新酸小、中、大三个剂量组对钠离子的排出量分别增加了11.1％、11.0％、11.0％，且三个剂量组均存在统计学上的显著性差异。与正常对照组大鼠相比，茯苓新酸小剂量组增加电解质钾离子的排出，而中和大剂量组减少电解质钾离子的排出，且中和大剂量组存在统计学上的显著性差异。与正常对照组大鼠相比，茯苓新酸小、中、大三个剂量组虽然对氯离子的排出量有一定影响，但是没有存在统计学上的显著差异。茯苓新酸小、中、大三个剂量组均增加钠/钾离子的比值，中和大剂量组存在统计学上的显著性差异。螺内酯和呋塞米能增加钠离子排出，同时增加钠/钾离子的比值，但对钾离子排出没有显著的影响。
发明人的研究结果证明了茯苓新酸在促进钠排泄的同时具有保钾的作用。抑制肾小管对电解质钠离子和水的重吸收可能是茯苓新酸的利尿的作用机制，茯苓新酸是四环三萜类化学结构，四环三萜类化学结构与醛固酮及醛固酮的拮抗剂(如螺内酯)结构相似，所以茯苓新酸的利尿作用是拮抗醛固酮使钠/钾离子平衡发生改变。
表2不同剂量茯苓新酸对大鼠排尿电解质钠、钾及氯离子含量的影响
注：给药组与水对照组组间进行t检验，与对照组比*P<0.05，**P<0.01
茯苓新酸对生理盐水负荷的水潴溜大鼠有较好的利尿作用，茯苓新酸有促进钠离子排出的同时有减少钾离子排出的效应，说明茯苓新酸有保钾排钠的作用，可为临床提供一种新的利尿药物候选药物。