一种广州管圆线虫蛋白Galectin‑1的应用的制作方法

技术特征：

1.一种广州管圆线虫(Angiostrongylus Cantonensis)蛋白Galectin-1的应用，其特征在于：所述应用为广州管圆线虫蛋白Galectin-1在制备具有免疫抑制功能的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的广州管圆线虫蛋白Galectin-1的应用，其特征在于：所述广州管圆线虫蛋白Galectin-1具有免疫抑制作用。

3.根据权利要求2所述的广州管圆线虫蛋白Galectin-1的应用，其特征在于：所述广州管圆线虫蛋白Galectin-1具有免疫抑制作用的验证方法，步骤如下：

⑴免疫小鼠

将广州管圆线虫Galectin-1蛋白分别与等体积的弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂充分混合，用注射器反复吹打乳化直至出现油包水状态，皮下注射免疫C57BL/6小鼠；具体免疫方法为：

初次免疫：每只小鼠100μg蛋白，与弗氏完全佐剂混合；

加强免疫：每只小鼠50μg蛋白，与弗氏不完全佐剂混合；

每次免疫间隔一周，共免疫三次；

⑵广州管圆线虫Ⅲ期幼虫感染小鼠

①Ⅲ期幼虫的获得

将阳性SD大鼠新鲜粪便加入人工建立的福寿螺生活环境中，连续感染3-4次；2周后将福寿螺去壳，取出内脏和肌肉组织，剁碎后按照1g螺肉加入10mL人工消化液，在37℃保温箱中消化2-3h；然后经滤网过滤，静置沉淀，用生理盐水洗2-3次，沉淀在解剖镜下镜检；

②Ⅲ期幼虫感染

显微镜下挑出Ⅲ期幼虫，并按照每只小鼠以30±2条幼虫感染小鼠；

⑶体液免疫调节

在Ⅲ期幼虫感染后0周、1周、2周、3周眼球采血收集小鼠血清，得小鼠血清样品，采用ELISA方法检测不同时期小鼠血清中Total IgG、IgG1、IgG2a和IgE抗体水平，评估体液免疫调节作用；

将Total IgG和IgE作为指标，与对照组相比，若实验组水平降低，说明Galectin-1蛋白具有免疫抑制作用；

采用ELISA检测试剂盒检测血清抗体水平；

具体步骤为：

①包被：用包被液分别将捕获抗体按照捕获抗体：包被液的体积比为1:250的比例稀释后，100μL/_孔加入ELISA板中，4℃包被过夜；

其中，所述包被液为PBS，捕获抗体为相应的抗-鼠单克隆抗体，即抗-鼠IgG、抗-鼠IgG1、抗-鼠IgG2a、抗-鼠IgE单克隆抗体；

②洗板：次日弃去孔内液体，300μL/_孔洗涤缓冲液洗板2次，最后一次洗板后将孔板倒扣在吸水纸上将孔内液体全部弃掉；

③封闭：250μL/_孔封闭液，室温封闭2h；

④洗板：弃去孔内液体，300μL/_孔洗涤缓冲液洗板2次，最后一次洗板后将孔板倒扣在吸水纸上将孔内液体全部弃掉；

⑤准备标准品和样品：将标准品鼠Total IgG抗体、鼠IgG1抗体、鼠IgG2a抗体、鼠IgE抗体分别用去离子水稀释至鼠Total IgG抗体的浓度为100ng/mL、50ng/mL、25ng/mL、12.5ng/mL、6.25ng/mL、3.13ng/mL、1.56ng/mL；鼠IgG1抗体的浓度为200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、25ng/mL、12.5ng/mL、6.25ng/mL、3.13ng/mL；鼠IgG2a抗体的浓度为250ng/mL、125ng/mL、62.5ng/mL、31.25ng/mL、15.63ng/mL、7.81ng/mL、3.90ng/mL；鼠IgE抗体的浓度为250ng/mL、125ng/mL、62.5ng/mL、31.25ng/mL、15.63ng/mL、7.81ng/mL、3.90ng/mL；100μL/_孔加至标准品孔内，设3个复孔；

同时，将小鼠血清样品用封闭液稀释，稀释的体积比为鼠IgG-血清：封闭液＝1:100000；鼠IgG1-血清：封闭液＝1:10；鼠IgG2a-血清：封闭液＝1:10000；鼠IgE-血清：封闭液＝1:50；

⑥孵一抗：100μL/_孔稀释的血清样品加入样品孔内，每组设3个复孔，同时设空白对照孔；

⑦孵二抗：50μL/_孔稀释的检测抗体加入ELISA板中，室温孵育3h；

其中，所述稀释的检测抗体为HRP标记的抗鼠IgG单克隆抗体，使用封闭液稀释，稀释体积比例为封闭液：抗体＝250:1；

⑧洗板：弃去孔内液体，300μL/_孔洗涤缓冲液洗板4次，最后一次洗板后将孔板倒扣在吸水纸上将孔内液体全部弃掉；

⑨显色：100μL/_孔TMB显色液，室温避光孵育15min；

⑩终止：100μL/_孔2M H₂SO₄终止液终止反应；

最后将ELISA板置于酶标仪中，读取450nm波长处的光吸收值，绘制标准曲线，根据标准曲线计算抗体浓度；

⑷细胞免疫调节

为了观察目的蛋白对细胞免疫的调节作用，进行小鼠脾淋巴细胞细胞因子IFN-γ、IL-4、IL-5和IL-10检测；

广州管圆线虫感染为急性感染，急性期以Th1免疫应答为主，将IFN-γ作为确认指标，与对照组相比，若实验组IFN-γ降低，则认为Galectin-1蛋白具有免疫抑制作用；

具体步骤为：

①小鼠脾淋巴细胞分离

取脾：将小鼠眼球取血后颈椎脱臼处死，放入装有体积百分数为75％乙醇的烧杯中，无菌条件下解剖取小鼠脾脏；

研磨：将小鼠脾脏放入1mLDMEM细胞培养液中清洗，充分研磨，并不断向组织上滴加DMEM培养液，直至组织内95％以上的细胞被分离，将细胞悬液小心移至无菌的离心管中；

离心：1400rpm，室温离心5min；

淋巴细胞分离：弃上清，加入500μLAck红细胞裂解液，静置1min，加DMEM培养液定容至2mL；

离心：1400rpm，室温离心5min；

过滤：弃上清，加500μL DMEM重悬细胞，经200目滤网过滤至另一个干净无菌的离心管中，用DMEM清洗后将清洗液一起移至新的离心管中；

染色：98μL台盼蓝与2μL细胞悬液充分混匀后充池；

细胞计数：显微镜下计数4个大方格内的细胞数量，根据C＝N/4×10×10³×50计算细胞浓度；

②小鼠脾淋巴细胞分泌细胞因子检测

用含体积百分数为10％FBS的DMEM将脾淋巴细胞悬液稀释至1×10⁶个细胞/mL，加到96孔板中，100μL/_孔，然后加入广州管圆线虫Galectin-1蛋白25ng/mL、100μL/_孔刺激脾细胞；同时设刀豆素ConA25ng/mL、100μL/_孔阳性对照组、灭菌PBS 100μL/_孔阴性对照组；在5％CO₂培养箱37℃培养72h后收集细胞上清，得细胞上清样品，-80℃保存备用，用于细胞因子检测；

采用ELISA检测试剂盒检测细胞因子IFN-γ、IL-4、IL-5和IL-10水平，具体操作步骤为：

包被：用包被液分别将捕获抗体抗-鼠IFN-γ、抗-鼠IL-4、抗-鼠IL-5、抗-鼠IL-10单克隆抗体按照捕获抗体：包被液的体积比为1:250的比例稀释后，按照每孔100μL加到ELISA板中，4℃包被过夜；其中，所述抗-鼠IFN-γ、抗-鼠IL-4、抗-鼠IL-5单克隆抗体的包被液为7.13g NaHCO₃+1.59gNa₂CO₃加入1L蒸馏水后的混合液；抗-鼠IL-10单克隆抗体的包被液为12.49gNa₂HPO₄+15.47g NaH₂PO₄加入1L蒸馏水后的混合液；

洗板：次日，将孔内液体弃掉，用300μL/_孔洗涤缓冲液洗板3次，最后一次将孔板倒扣在吸水纸上将孔内液体拍干；

封闭：每孔200μL含体积百分数为10％FBS的PBS封闭ELISA板，室温孵育2h；

洗板：将孔内液体弃掉，用300μL/_孔洗涤缓冲液洗板3次，最后一次将孔板倒扣在吸水纸上将孔内液体拍干；

准备标准品和样品：将标准品重组鼠IFN-γ、重组鼠IL-4、重组鼠IL-5、重组鼠IL-10分别按倍比用含体积百分数为10％FBS的PBS稀释成7个浓度梯度，即IFN-γ:2000pg/mL、1000pg/mL、500pg/mL、250pg/mL、125pg/mL、62.5pg/mL、31.3pg/mL；IL-4:500pg/mL、250pg/mL、125pg/mL、62.5pg/mL、31.3pg/mL、15.6pg/mL、7.8pg/mL；IL-5:1000pg/mL、500pg/mL、250pg/mL、125pg/mL、62.5pg/mL、31.3pg/mL、15.6pg/mL；IL-10:2000pg/mL、1000pg/mL、500pg/mL、250pg/mL、125pg/mL、62.5pg/mL、31.3pg/mL；将收集的细胞培养上清样品用含体积百分数为10％FBS的PBS进行1:20稀释，每组设置3个复孔，同时设空白对照孔；

孵一抗：将标准品组、样品组和空白对照组每孔100μL加到ELISA板中，室温孵育1h；

洗板：将孔内液体弃掉，用300μL/_孔洗涤缓冲液洗板5次，最后一次将孔板倒扣在吸水纸上将孔内液体拍干；

孵二抗：每孔加100uL稀释的检测抗体和SAv-HRP标记的酶标试剂，室温孵育1h；

其中，所述检测抗体分别为Biotinylate标记的抗鼠IFN-γ单克隆抗体、Biotinylate标记的抗鼠IL-4单克隆抗体、Biotinylate标记的抗鼠IL-5单克隆抗体、Biotinylate标记的抗鼠IL-10单克隆抗体；稀释时使用含体积百分数为10％FBS的PBS稀释，PBS：检测抗体：SAv-HRP酶标试剂的体积比为500:1:2；

洗板：将孔内液体弃掉，用300μL/_孔洗涤缓冲液洗板7次，每次洗板均将洗涤缓冲液置于ELISA板中停留1min；

显色：每孔加100μLTMB显色液，室温下避光孵育15min；

终止反应：每孔加50μL2M H₂SO₄终止液；

读板：将ELISA板置于酶标仪中，读取450nm波长处的光吸收值；

计算浓度：绘制标准曲线，根据标准曲线计算细胞因子浓度；

⑸小鼠脾淋巴细胞分化群检测

采用流式细胞仪检测CD4⁺T细胞和CD4⁺CD25⁺PoxP3⁺Treg细胞变化；与对照组相比，实验组CD4⁺T细胞降低和/或CD4⁺CD25⁺PoxP3⁺Treg细胞升高，则说明Galectin-1蛋白具免疫抑制作用；

将分离得到的脾淋巴细胞悬液用DMEM调整至1.5×10⁷个细胞/mL，加到96孔板100μL/_孔中，采用检测试剂盒按照如下步骤操作：

①每孔加入200μLFacs缓冲液，1400rpm，室温离心5min，弃上清；

②每孔加入25μLFacs缓冲液冰上封闭1min；

③每孔加入25μL稀释的抗体混合物冰上孵育30min，其中，稀释体积比例为Facs缓冲液：CD4-FITC：CD8-PerCP-Cy5.5：CD25-APC＝200：1：1：1；

④每孔加200μLFacs缓冲液，1400rpm，室温离心5min，弃上清；

⑤每孔加100μL新鲜配制的破膜固定缓冲液，冰上孵育30min；

⑥直接向孔内加200μL清洗液，1400rpm，室温离心5min，弃上清；

⑦重复步骤⑥；

⑧每孔加50μL清洗液，FoxP3-PE抗体按清洗液：FoxP3-PE的体积比为100:1直接加入孔内，4℃避光孵育30min；

⑨重复步骤⑥，清洗2次；

⑩每孔加100μL清洗液重悬细胞后加入流式管中上机检测；

⑹脑组织HE染色

取小鼠脑组织进行HE染色，显微镜观察脑组织病理损伤严重程度及炎症细胞变化，进一步验证Galectin-1蛋白的免疫调节作用；若在实验组小鼠的脑膜炎好发部位炎症细胞浸润明显减少，说明Galectin-1蛋白具免疫抑制作用；

步骤如下：

①取材与固定

取新鲜小鼠脑组织投入预先配好的质量百分数为4％的多聚甲醛固定液中，使组织、细胞的蛋白质变性凝固，以防止细胞死后自溶或细菌分解，从而保持细胞本来的形态结构；

②脱水透明

用由低浓度到高浓度酒精作脱水剂，逐渐脱去组织块中的水分，再将组织块置于既溶于酒精，又溶于石蜡的透明剂二甲苯中透明，以二甲苯替换出组织块中的酒精；

③浸蜡包埋

将已透明的组织块置于已溶化的石蜡中，放入熔蜡箱保温；

待石蜡完全浸入组织块后进行包埋：制备好容器，倒入已溶化的石蜡，迅速夹取已浸透石蜡的组织块放入其中，冷却凝固成块即可；

待包埋好的组织块变硬，才能在切片机上切成很薄的切片；

④切片与贴片

将包埋好的蜡块固定于切片机上，切成薄片，为5-8μm厚；切下的薄片皱褶，要放到加热的水中烫平，再贴到载玻片上，放45℃恒温箱中烘干；

⑤脱蜡染色

将烘干的标本进行HE染色，以增加组织细胞结构各部分的色彩差异，利于观察；苏木精染色剂是一种碱性染料，能将细胞核和细胞内核糖体染成蓝紫色；伊红是一种酸性染料，能将细胞质染成红色或淡红色。染色前，用二甲苯脱去切片中的石蜡，再经由高浓度到低浓度酒精，最后入蒸馏水，即可染色；

HE染色过程是：

将已入蒸馏水1-2s后的切片放入苏木精染色剂中染色3min，自来水冲洗5-10s；

放入体积百分数为70％乙醇与浓盐酸按体积比100-200:1组成的混合液中分化5-10s；

流水冲洗1-2s；

放入浓氨水与蒸馏水按体积比1:99配制的混合液中5-10s；

流水冲洗15-30s；

入伊红染色液染色8-10s；

⑥脱水透明

染色后的切片经纯酒精脱水，再经二甲苯使切片透明；

⑦封固

将已透明的切片滴上加拿大树胶，盖上盖玻片封固，待树胶略干后，贴上标笺，切片标本即可使用，并进行显微镜观察。

4.根据权利要求3所述的广州管圆线虫蛋白Galectin-1的应用，其特征在于：所述步骤⑵中感染方式为灌胃感染。

5.根据权利要求3所述的广州管圆线虫蛋白Galectin-1的应用，其特征在于：所述步骤⑶中采用eBioscience ELISA检测试剂盒检测血清抗体水平；所述步骤⑶中封闭液为含体积百分数为1％的吐温-20、体积百分数为10％的牛血清白蛋白的PBS。

6.根据权利要求3所述的广州管圆线虫蛋白Galectin-1的应用，其特征在于：所述步骤⑷②中采用BD Biosciences ELISA检测试剂盒检测细胞因子IFN-γ、IL-4、IL-5和IL-10水平。

7.根据权利要求3所述的广州管圆线虫蛋白Galectin-1的应用，其特征在于：所述步骤⑸中Facs缓冲液为含体积百分数为2％FBS的PBS；所述步骤⑸中检测试剂盒为BDBiosciences；所述步骤⑸中破膜固定缓冲液的货号：562574，批次51-9008100和51-9008101；所述步骤⑸中清洗液的货号：562574，批次51-9008102。

8.根据权利要求5所述的广州管圆线虫蛋白Galectin-1的应用，其特征在于：所述步骤⑹中炎症细胞为中性粒细胞、嗜酸性粒细胞；所述步骤⑹中脑膜炎好发部位为脑室、蛛网膜下腔；所述步骤⑹②中低浓度到高浓度酒精的体积浓度分别为：70％酒精30min；90％酒精30min；95％酒精30min；100％酒精1h；100％酒精1h；所述步骤⑹⑤中高浓度到低浓度酒精的体积浓度分别为：100％酒精2min；95％酒精1min；80％酒精1min；75％酒精1min。