一种具有强筋骨的麋鹿角活性部位及其制备方法与应用与流程

本发明涉及中药材麋鹿角，具体涉及一种具有强筋骨的麋鹿角活性部位及其制备方法和其应用。

背景技术：
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麋鹿角是鹿科动物麋鹿(Elaphurus davidianus Milne-Edwards)骨化脱落的老角。麋鹿角是传统补益类中药材，至清末麋鹿在中国的灭绝，入药已逾千年。中医认为麋鹿角性温味咸，入肝补肾，可以滋补耗损之阴津，故能安心神，治疗五心烦热、暴躁易怒等症状。由于近代麋鹿在中国的灭绝，麋鹿角的近代药用记载及其相关研究甚为稀少。近代张德昌等对比了麋鹿角和鹿角的成分含量，发现麋鹿角除了有和鹿角相当的氨基酸含量外，其微量元素和膳食纤维含量远高于鹿角，提示了麋鹿角可能具有与鹿角相当的药学价值。而鹿角作为一传统补益药，其益肾助阳已为多年的临床应用和实验研究所证实。但是对麋鹿角的活性部位、活性物质基础及其作用机制尚未有研究报道。

技术实现要素：
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发明目的：本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种活性部位明确、功效好的具有强筋骨的麋鹿角活性部位，本发明另一个目的是提供该具有强筋骨的麋鹿角活性部位的制备方法和其在制备治疗骨质疏松药物中的应用。

技术方案：为了实现以上目的，本发明所采取的技术方案为：

一种具有强筋骨的麋鹿角活性部位，它是由下列方法制备得到的：

取麋鹿角，镑片，加水回流提取，滤液减压浓缩，得麋鹿角总水提物；麋鹿角总水提物依次通入截留分子量分别为3K，1W，10W的中空纤维超滤膜组件，得到分子量大于100kDa，分子量位于10kDa和100kDa之间，分子量位于3kDa和10kDa之间和分子量小于3kDa的四个不同分子量的具有强筋骨的麋鹿角活性部位部位。

作为优选方案，以上所述的具有强筋骨的麋鹿角活性部位，采用的回流溶剂为超纯水，加水量为药材重量的6～15倍，回流提取次数为1～3次，每次4～12小时。

本发明所述的具有强筋骨的麋鹿角活性部位的制备方法，包括以下步骤：

(1)取麋鹿角，镑片，加6～15倍量超纯水加热回流提取1～3次，每次每次4～12小时，滤过，合并滤液，减压浓缩，得麋鹿角总水提物，备用；

(2)取步骤(1)麋鹿角总水提物通入截留分子量为3K的中空纤维超滤膜组件，经超滤分离后得到透过液，即为分子量小于3000的麋鹿角水提溶液和截流液；截流液再依次用截留分子量为1W、10W的超滤膜组件，得到分子量大于100kDa，分子量位于10kDa和100kDa之间和分子量位于3kDa和10kDa之间的活性部位。

作为优选方案，以上所述的具有强筋骨的麋鹿角活性部位的制备方法，其特征在于，步骤(1)取麋鹿角，镑片，加8倍量超纯水加热回流提取3次，每次每次8小时，滤过，合并滤液，减压浓缩，得麋鹿角总水提物。

本发明所述的具有强筋骨的麋鹿角活性部位在制备治疗骨质疏松药物中的应用。

本发明所述的具有强筋骨的麋鹿角活性部位在制备妇女更年期骨质疏松药物中的应用。

本发明所述的具有强筋骨的麋鹿角活性部位在制备治疗骨质疏松药物中的应用，把麋鹿角活性部位和药学上可接受的载体制成胶囊剂、片剂、颗粒剂、注射剂或微囊的药物制剂。

有益效果：本发明提供的具有强筋骨的麋鹿角活性部位具有以下优点：

(1)本发明提供的具有强筋骨的麋鹿角活性部位，经过现代分离手段和药理实验跟踪，确定了麋鹿角水提取物的精制活性部位，通过现代分析仪器确定活性部位主要成分为水溶性蛋白质、多肽、氨基酸和核苷类等成分，活性成分更清楚。

且通过药理实验表明，本发明提供的鹿角活性部位能增强泼尼松龙致斑马鱼骨质疏松模型中斑马鱼头部骨骼骨矿化量和骨密度，显示出较好的阻止斑马鱼骨量丢失作用。并且具有显著的拟雌激素样作用，具有很好的抗骨质疏松功效。

(2)本发明提供的具有强筋骨的麋鹿角活性部位的制备方法，可操作性强，提取活性成分效率高，且制备方法成本低、环保、可实现工业化大生产。

附图说明

图1为麋鹿角水提溶液(ML2)对斑马鱼幼鱼9dpf的腹面头骨染色矿化面积的柱状图。

图2为麋鹿角水提溶液(ML2)对斑马鱼幼鱼9dpf的腹面头骨染色IOD值的的柱状图。

图3为麋鹿角水提溶液(ML3)对斑马鱼幼鱼9dpf的腹面头骨染色矿化面积的柱状图。

图4为麋鹿角水提溶液(ML3)对斑马鱼幼鱼9dpf的腹面头骨染色IOD值的的柱状图。

图5为麋鹿角水提溶液(ML4)对斑马鱼幼鱼9dpf的腹面头骨染色矿化面积的柱状图。

图6为麋鹿角水提溶液(ML4)对斑马鱼幼鱼9dpf的腹面头骨染色IOD值的的柱状图。

图7为麋鹿角水提溶液(ML5)对斑马鱼幼鱼9dpf的腹面头骨染色矿化面积的柱状图。

图8为麋鹿角水提溶液(ML5)对斑马鱼幼鱼9dpf的腹面头骨染色IOD值的的柱状图。

图9为麋鹿角不同提取物对MG-63-ERE细胞荧光素酶强度的影响柱状图。

图10为麋鹿角不同提取物对MG-63-ERE细胞荧光素酶强度的影响柱状图。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1麋鹿角强筋骨活性部位的制备方法

(1)取麋鹿角20g，镑片，置于烧瓶中，加8倍量超纯水加热回流提取3次，每次8h，滤过，合并滤液，减压浓缩至适当体积(0.2g生药/mL)，得麋鹿角总水提物(ML1)，减压浓缩，备用。

(2)取步骤(1)中麋鹿角总水提物通入截留分子量为3K的中空纤维超滤膜组件，经超滤分离后，麋鹿角总水提物溶液被分为透过液和截流液两个部分。从膜组件下端的出口端流出的透过液即为分子量小于3000的麋鹿角水提溶液(ML5)；截流液返回储液罐中继续进行循环超滤。同理，依次用截留分子量为1W、10W的超滤膜组件，依次得到分子量大于100kDa(ML2)，分子量位于10kDa和100kDa之间(ML3)和分子量位于3kDa和10kDa之间(ML4)的活性部位，减压浓缩，冷冻干燥，即得。

将水提取后的麋鹿角药渣，加95％乙醇回流提取2次，每次3小时，滤液减压回收乙醇，冷冻干燥，得乙醇提取物(ML6，0.0151g/g生药)。

实施例2麋鹿角对泼尼松龙致斑马鱼骨质疏松作用

1实验材料

1.1仪器与试药

ZEISS荧光倒置显微镜Axio observer.A1(蔡司光学仪器国际贸易有限公司)；生化培养箱SPX-80(宁波海曙赛褔实验仪器厂)；专业图像分析软件image pro plus 6.0(美国Media Cybernetics公司)

泼尼松龙(苏州亚科化学试剂股份有限公司，批号YK2012020101)；依替膦酸二钠(中国药品生物制品检定所，批号101174-201001)；二甲基亚砜(国药集团化学试剂有限公司，批号20120331)；多聚甲醛(成都市科龙化工试剂厂，批号20100504)；MS-222(3-氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐)(美国Acros Organics，批号A0288328)；茜素红S(郑州四季化工产品有限公司，批号20110806)；其余试剂均为分析纯。

1.2实验动物

斑马鱼成鱼由南京大学模式动物研究所提供，德国Tuebingen品系；幼鱼培养基组成为：5mM NaCl，0.17mM KCl，0.33mM CaCl2，0.33mM MgSO4，10-5％亚甲基蓝。

2方法与结果

2.1溶液配制与样品制备

2500μmol/L泼尼松龙储备液：精密称取泼尼松龙9.1mg，加入DMSO 1.3mL，溶解后用培养基稀释并定容至10mL，即得。

25μmol/L泼尼松龙溶液：取0.5mL 2500μmol/L泼尼松龙储备液，加入适量DMSO后，用培养基稀释并定容至50mL，即得。

150μg/mL依替膦酸二钠储备液：精密称取依替膦酸二钠7.62mg，用培养基溶解，稀释并定容至50mL，即得。

含25μmol/L泼尼松龙的15μg/mL依替膦酸二钠溶液(含0.5％DMSO)：取5mL 150μg/mL依替膦酸二钠储备液和0.5mL 2500μmol/L泼尼松龙储备液，加入适量DMSO，用培养基稀释并定容至50mL，即得。

含25μmol/L泼尼松龙的麋鹿角各提取物溶液：精密称取麋鹿角各样品约1～15mg，分别加入DMSO各0.4mL，然后加培养基溶解并稀释至10mL，得各样品贮备液。取各样品贮备液适量，分别加入2500μmol/L泼尼松龙储备液适量，用培养基依次稀释成含0.5％DMSO和25μmol/L泼尼松龙的相当于20μg生药/mL、100μg生药/mL和500μg生药/mL的麋鹿角各样品溶液。

2.2分组、造模及给药

取受精后4天(4dpf)的斑马鱼幼鱼置24孔板中，8个幼鱼/孔，共分成22组，每组设2个复孔，分别为空白培养基组、阴性对照组(0.5％DMSO)、模型组(25μmol/L泼尼松龙)、阳性药物组(含25μmol/L泼尼松龙的15μg/mL依替膦酸二钠溶液)、ML1-ML6低、中及高剂量组(含25μmol/L泼尼松龙的20、100、500μg生药/mL溶液)。除空白培养基组外，各组均用培养基配制成含0.5％DMSO的溶液。除空白培养基组和阴性对照组外，其余20组均给予泼尼松龙造模，培养48小时后，将其中的阳性药物组及ML1-ML6组分别替换成相应的药物，继续培养。造模及给药期间每天更换相应的含药培养基，换药时，吸净24孔板里的培养基后迅速加入新鲜含药培养基并润洗两遍，最终使每孔含溶液1mL，置28.5℃恒温培养箱中培养。

2.3斑马鱼头部骨骼荧光染色

培养周期5天，培养至9dpf，斑马鱼置于100mg/L MS-222溶液中麻醉致死，然后在4％多聚甲醛磷酸盐缓冲溶液中固定3小时；去除多聚甲醛，加入新鲜配制的含1％KOH和1.5％H2O2的漂白剂使鱼体上的色素细胞脱色；去除漂白剂，加入含0.5％KOH的茜素红染液染色，放置过夜；去除染色液并用纯水洗涤后，依次用不同浓度比的1％KOH和甘油的混合溶液浸泡使幼鱼透明，最后保存于甘油中。

2.4斑马鱼头部骨骼定量分析

染色处理后的斑马鱼头部腹面置于荧光倒置显微镜下，采集图像，运用专业图像软件Image pro plus 6.0计算其头部红色染色部分面积之和和累积光密度值(IOD)，进行骨矿化量和骨密度分析。结果应用SPSS 17.0统计软件分析，组间比较采用Indendent-Samples T Test方法。

2.5结果

结果表明，与DMSO溶媒阴性对照组相比，泼尼松龙模型组的斑马鱼头部骨骼染色面积和染色强度明显减小；阳性药物组的染色面积和强度较泼尼松龙模型组显著增强；本发明制备得到的麋鹿角活性部位ML2、ML3、ML4和ML5的染色面积较模型组明显增加，说明具有显著的强筋骨作用。

图1至图8为应用图像分析软件计算的各组斑马鱼头骨染色矿化面积和累积光密度值(IOD)的统计结果。ML2低剂量组染色面积显著增加(P<0.05)，但其IOD值增加不明显；ML3低、中剂量时均有显著性差异(P<0.01或0.05)，中剂量组染色面积亦有显著性差异(P<0.05)；ML4染色面积和IOD值随剂量的升高呈增加趋势，高剂量时有显著性差异(P<0.05或0.01)；ML5染色面积随剂量的升高亦呈增加趋势，高剂量时染色面积和IOD值均有显著性差异(P<0.05或0.01)。ML2-ML5强筋骨活性不尽相同，可选择适宜剂量联合制备成制剂。

通过以上实验表明，本发明提供的麋鹿角活性部位ML2-ML5均具有一定的增加斑马鱼头部骨骼骨矿化量和骨密度的作用，显示出较好的阻止斑马鱼骨量丢失作用。

实施例3利用MG-63-ERE稳转细胞筛选麋鹿角不同提取物拟雌激素样作用

1仪器与材料

1.1实验仪器

EnSpire多模式微孔板检测仪(美国PerkinElmer公司)；CKX31SF型倒置显微镜(OLYMPUS公司)；CO₂恒温培养箱(美国Thermo公司)；96孔培养板(美国Costar公司)。1.2样品与试剂

麋鹿角总水提取物(ML1)及其不同分子量段MW>100kDa(ML2)、10kDa<MW<100kDa(ML3)、3kDa<MW<10kDa(ML4)、MW<3kDa(ML5)和乙醇提取物(ML6)样品同“实例1中活性部位制备。

荧光素酶报告基因检测试剂盒Luciferase Assay(美国Promega公司，0000076591)；MEM培养基、胎牛血清(FBS)购自美国Gibco公司；青霉素(市售80万单位/瓶)；链霉素(市售1g/瓶)；无水乙醇(批号12042510668，南京化学试剂有限公司)；PBS(pH7.2-7.4，广州翔博生物科技有限公司)；MTT(批号M2128，美国Sigma公司)；DMSO(批号20131106，国药集团化学试剂有限公司)。

1.3细胞与细胞培养

细胞株：MG-63-ERE细胞株。细胞培养：用含10％(体积分数)灭活标准胎牛血清、1％Non-Essential Amino Acids、1％Sodium Pyruvate、250μg/mL G418、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素的MEM培养液，于37℃，5％CO₂，饱和湿度的培养箱中培养，每2天更换培养基，每4天传代1次。

2方法与结果

2.1麋鹿角不同提取物对MG-63-ERE细胞存活率的影响

MG-63-ERE细胞以1×l0⁴个/mL密度接种于96孔板，每孔200μl，边缘孔用无菌PBS填充，37℃，5％CO₂培养24h，吸去培养基，加入新鲜培养基90μL，孵育3小时后，加入不同浓度的麋鹿角提取物各10μL，每个浓度样品设3个复孔，37℃，5％CO₂继续培养24h，再按前法加药一次。24小时后，吸出含药培养基，加入新鲜培养基90μL，孵育3小时后，每孔加MTT液10μL，使MTT终浓度为0.5mg/mL，继续孵育3h。终止培养，吸去培养基，每孔加150μLDMSO，振荡0.5h，酶标仪测定每孔570nm的光密度值(OD)，计算细胞存活率。存活率＝给药组OD值的均数/对照组OD值的均数×100％。结果显示麋鹿角各提取物样品在100μg/mL浓度以下对MG-63-ERE细胞生长没有明显的抑制作用。

2.2荧光素酶检测

麋鹿角不同提取物各样品的细胞最终给药浓度分别从高浓度100μg/mL开始依次稀释3倍，得5个浓度，照前法连续给药2天，每次给药前更换新鲜不含酚红培养基，3个小时后给药。给药结束后，移去培养基，用PBS洗涤两次，每次100μL，小心移去PBS，每孔加入细胞裂解液25μL，振摇20min。分取部分细胞裂解液测定蛋白含量，其余裂解液置于酶标仪中，每孔加入100μL荧光素酶检测试剂，延迟时间2秒，读数时间10秒，测定荧光强度。

如图9和图10结果显示，麋鹿角95％乙醇提取物和水提取物10kDa<MW<100kDa、3kDa<MW<10kDa和MW<3kDa分子量段均能显著增强MG63-ERE中荧光素酶表达，具有显著的拟雌激素样作用。

人成骨肉瘤细胞MG-63在很多生理学方面和人成骨细胞有相似的地方，在细胞分化增殖、细胞外基质成熟和矿化阶段，这两个细胞表现得极为相近，因此MG-63细胞可以作为研究骨质疏松疾病的模型。结果表示，活性部位ML3-ML5均能显著增强MG63-ERE中荧光素酶表达，具有显著的拟雌激素样作用，进一步研究麋鹿角的抗骨质疏松作用物质基础及作用机理提供依据。