一种碳酸钙增强的丝素纤维支架及其制备方法与流程

本发明涉及一种碳酸钙增强的丝素纤维支架及其制备方法，可用于软组织、硬组织修复及药物缓释等再生医学领域。

背景技术：

蚕丝蛋白是来源于自然界的天然高分子生物材料，具有优异的力学性质、可控的生物降解性、易加工性而成为理想的再生医学支架的原材料。随着现代医学和外科手术技术的发展，通过组织或器官移植来修复功能损失已经被广泛接受，然而却面临着巨大的供体缺口。通过再生医学手段体在体内或体外形成组织或器官为受损功能的修复提供了新的治疗方案。其中，组织工程支架材料的选择及构建成为该治疗方法的关键之一。

目前，制备丝素蛋白多孔支架的方法有很多，包括冷冻干燥、盐析法、气体发泡法、三维打印等，然而这些方法都依然存在一些难以克服的不足。例如，冷冻干燥法易形成片层结构，不利于细胞与组织生长，尽管现有技术报道了一种反复进行膜溶解控制丝素蛋白自组装形成纳米纤维结构，进而形成多孔支架，但效率低，重复性差，并且孔壁结构的存在直接限制细胞的迁移与相互作用，组织生长也因此受限。

为此，克服现有加工技术与丝蛋白支架结构的上述问题，开发一种制备方法，并构建出有利于细胞与组织生长的丝素支架对丝素蛋白在生物医用材料领域的应用及再生医学的临床应用都具有非常重大的意义。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种碳酸钙增强的丝素纤维支架的制备方法，及由该方法制备的碳酸钙增强的丝素纤维支架，具有多孔支架的大孔径高空隙率优点，同时具有纤维状的内部结构特征，特别是通过碳酸钙纳米线增强，能够在极大促进细胞生长，如细胞增殖与迁移、和组织生长的同时具有良好的力学性能，对组织工程技术临床应用非常有利。

为达到上述目的，本发明提供一种碳酸钙增强的丝素纤维支架的制备方法，包括以下步骤，

（1）对蚕丝进行脱胶处理，获得丝素蛋白纤维；

（2）将丝素蛋白纤维分散于钙盐/甲酸混合液中，得到丝素纤维分散液；

（3）将步骤（2）的丝素纤维分散液滴加入碳酸盐溶液中，得到反应液；然后过滤反应液，滤饼经过洗涤、干燥后得到碳酸钙纳米线；

（4）将氯化钠加入步骤（2）的丝素纤维分散液中，搅拌均匀，然后加入步骤（3）的碳酸钙纳米线；搅拌后挥发去除甲酸得到丝素纤维-氯化钠-碳酸钙固体；

（5）将丝素纤维-氯化钠-碳酸钙固体置于流动的水中处理，得到湿态丝素纤维支架；

（6）将湿态丝素纤维支架进行冷冻处理得到冷冻体，然后对冷冻体进行冷冻干燥即得到碳酸钙增强的丝素纤维支架。

上述技术方案中，所述蚕丝为桑蚕丝、柞蚕丝、蓖麻蚕丝或者天蚕丝，优选桑蚕丝。

上述技术方案中，所述甲酸的质量浓度为50-99%，优选80-98%；所述钙盐/甲酸混合液中，钙盐的质量浓度为1.1-1.8%，钙盐为氯化钙等。本发明以盐/甲酸分散丝素蛋白纤维，而不溶解，制备的天然丝素纤维支架内部结构以纤维为主，具有高孔隙率、高贯通率、优良的力学性能。

上述技术方案中，所述丝素纤维分散液中，丝素纤维的质量浓度为2-30%，优选5-10%。

上述技术方案中，所述氯化钠的粒径为1-20μm，优选10-15μm。由此得到的多孔结构更有利于细胞的黏附与生长，及组织长入，同时力学性能良好。

上述技术方案中，所述丝素纤维与氯化钠的质量比为1∶（80-100），优选1∶（88-92）。由此得到的支架具有更为均匀的多孔结构、适宜的孔隙率，更适合细胞与组织生长。

上述技术方案中，所述丝素纤维与碳酸盐的质量比为1∶（0.1-0.8）；所述碳酸盐为碳酸钠或者碳酸氢钠。碳酸盐滴入丝素纤维分散液中，可以形成碳酸钙纳米线，具有良好的生物相容性，与丝素纤维复合不但可以提高多孔支架的力学性能，增加可加工性，而且可以保持支架用作组织结构制作需要的生物特性；尤其是本发明方法制备的碳酸钙纳米线具有高的长径比，可以与丝素纤维形成良好的界面效应，避免现有无机材料导致的界面缺陷。

本发明首先溶胀制备丝素纤维分散液，以此为基础，用于碳酸钙纳米线以及丝素纤维多孔支架的制备，根据限定的质量比以及实际需要，选择所需要的丝素纤维分散液；所述丝素纤维与碳酸钙纳米线的质量比为1∶（0.01-0.05）。

上述技术方案中，冷冻处理的温度为-10～-196℃，冷冻干燥的温度为-10～-80℃，冷冻处理的时间少于冷冻干燥的时间；这样处理的优点是兼顾能源节约与多孔结构的稳定获取。

本发明还公开了根据上述制备方法制备的碳酸钙增强的丝素纤维支架，其内部主要由丝素纤维构成，纤维直径为50nm-50μm，同时纤维之间还存在碳酸钙纳米线；支架孔隙率大于50%，孔径范围为80-180μm，压缩模量为5kPa-100MPa。

本发明还公开了上述碳酸钙增强的丝素纤维支架在制备组织工程支架中的应用。

与现有技术相比，本发明直接以天然丝素纤维构建纤维多孔材料，该制备方法利用酸对蚕丝的良好分散性以及少量盐存在的微溶作用，结合处理工艺，所制备的碳酸钙增强的丝素纤维支架内部结构以纤维为主，同时存在碳酸钙纳米线，具有高孔隙率、高贯通率、优良的力学性能，非常有利于营养物质的输送、细胞的迁移、组织的生长，是理想的组织工程支架。

附图说明

图1为实施例一制备的碳酸钙纳米线的扫描电镜图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步描述：

实施例一

（1）桑蚕丝用0.5%的碳酸氢钠溶液煮沸30min脱胶，重复3次后获得丝素蛋白纤维；

（2）丝素蛋白纤维溶于1.1%氯化钙-98%甲酸溶液，丝素纤维分散液浓度5%；

（3）将丝素纤维分散液缓慢滴入碳酸钠溶液进行矿化反应，滴加时间0.5h；丝素纤维与碳酸钠的质量比为1∶0.1；将反应后的溶液过滤、洗涤、干燥得到外观白色、粉末状的碳酸钙纳米线；附图1是上述碳酸钙纳米线的扫描电镜图片；由图可见碳酸钙线直径在80-160nm，长度约650nm，具有高的长径比；

（4）通过分筛获得直径10-15μm的氯化钠颗粒，然后加入丝素纤维分散液中，并搅拌均匀，加入碳酸钙纳米线，去除甲酸后浸入流动水中去除氯化钠，得到湿态丝素纤维支架；湿态丝素纤维支架在-20℃冷冻，然后-20℃冷冻干燥，得到碳酸钙增强的丝素纤维支架，压缩模量约29kPa，支架内部纤维直径为880nm-50μm，纤维之间还存在碳酸钙纳米线，支架孔隙率大于50%，孔径范围为90-100μm，丝素纤维与氯化钠、碳酸钙纳米线的质量比为1∶100∶0.01。

实施例二

（1）桑蚕丝用0.5%的碳酸氢钠溶液煮沸30min脱胶，重复3次后获得丝素蛋白纤维；

（2）丝素蛋白纤维溶于1.6%氯化钙-90%甲酸溶液，丝素纤维分散液浓度5%；

（3）将丝素纤维分散液缓慢滴入碳酸钠溶液进行矿化反应，滴加时间0.5h；丝素纤维与碳酸钠的质量比为1∶0.1；将反应后的溶液过滤、洗涤、干燥得到外观白色、粉末状的碳酸钙纳米线；碳酸钙线直径在90-150nm，长度约630nm，具有高的长径比；

（4）通过分筛获得直径10-15μm的氯化钠颗粒，然后加入丝素纤维分散液中，并搅拌均匀，加入碳酸钙纳米线，去除甲酸后浸入流动水中去除氯化钠，得到湿态丝素纤维支架；湿态丝素纤维支架在-10℃冷冻，然后-20℃冷冻干燥，得到碳酸钙增强的丝素纤维支架，压缩模量约82kPa，支架内部纤维直径为500nm-25μm，纤维之间还存在碳酸钙纳米线，支架孔隙率大于50%，孔径范围为110-180μm，丝素纤维与氯化钠、碳酸钙纳米线的质量比为1∶100∶0.02。

实施例三

（1）桑蚕丝用0.5%的碳酸氢钠溶液煮沸30min脱胶，重复3次后获得丝素蛋白纤维；

（2）丝素蛋白纤维溶于1.5%氯化钙-98%甲酸溶液，丝素纤维分散液浓度10%；

（3）将丝素纤维分散液缓慢滴入碳酸钠溶液进行矿化反应，滴加时间0.5h；丝素纤维与碳酸钠的质量比为1∶0.5；将反应后的溶液过滤、洗涤、干燥得到外观白色、粉末状的碳酸钙纳米线；碳酸钙线直径在100-160nm，长度约670nm，具有高的长径比；

（4）通过分筛获得直径1-15μm的氯化钠颗粒，然后加入丝素纤维分散液中，并搅拌均匀，加入碳酸钙纳米线，去除甲酸后浸入流动水中去除氯化钠，得到湿态丝素纤维支架；湿态丝素纤维支架在-196℃冷冻，然后-30℃冷冻干燥，得到碳酸钙增强的丝素纤维支架，压缩模量约122kPa，支架内部纤维直径为500nm-25μm，纤维之间还存在碳酸钙纳米线，支架孔隙率大于50%，孔径范围为80-90μm，丝素纤维与氯化钠、碳酸钙纳米线的质量比为1∶100∶0.03。

实施例四

（1）天蚕丝用0.5%的碳酸氢钠溶液煮沸30min脱胶，重复3次后获得丝素蛋白纤维；

（2）丝素蛋白纤维溶于1.6%氯化钙-980%甲酸溶液，丝素纤维分散液浓度5%；

（3）将丝素纤维分散液缓慢滴入碳酸钠溶液进行矿化反应，滴加时间0.5h；丝素纤维与碳酸钠的质量比为1∶0.1；将反应后的溶液过滤、洗涤、干燥得到外观白色、粉末状的碳酸钙纳米线；碳酸钙线直径在90-150nm，长度约600nm，具有高的长径比；

（4）通过分筛获得直径10-15μm的氯化钠颗粒，然后加入丝素纤维分散液中，并搅拌均匀，加入碳酸钙纳米线，去除甲酸后浸入流动水中去除氯化钠，得到湿态丝素纤维支架；湿态丝素纤维支架在-90℃冷冻，然后-20℃冷冻干燥，得到碳酸钙增强的丝素纤维支架，压缩模量约10MPa，支架内部纤维直径为500nm-15μm，纤维之间还存在碳酸钙纳米线，支架孔隙率大于50%，孔径范围为120-180μm，丝素纤维与氯化钠、碳酸钙纳米线的质量比为1∶90∶0.02。

实施例五

（1）桑蚕丝用0.5%的碳酸氢钠溶液煮沸30min脱胶，重复3次后获得丝素蛋白纤维；

（2）丝素蛋白纤维溶于1.8%氯化钙-50%甲酸溶液，丝素纤维分散液浓度5%；

（3）将丝素纤维分散液缓慢滴入碳酸钠溶液进行矿化反应，滴加时间0.5h；丝素纤维与碳酸钠的质量比为1∶0.8；将反应后的溶液过滤、洗涤、干燥得到外观白色、粉末状的碳酸钙纳米线；碳酸钙线直径在90-110nm，长度约600nm，具有高的长径比；

（4）通过分筛获得直径10-20μm的氯化钠颗粒，然后加入丝素纤维分散液中，并搅拌均匀，加入碳酸钙纳米线，去除甲酸后浸入流动水中去除氯化钠，得到湿态丝素纤维支架；湿态丝素纤维支架在-150℃冷冻，然后-80℃冷冻干燥，得到碳酸钙增强的丝素纤维支架，压缩模量约982kPa，支架内部纤维直径为50nm-5μm，纤维之间还存在碳酸钙纳米线，支架孔隙率大于50%，孔径范围为80-110μm，丝素纤维与氯化钠、碳酸钙纳米线的质量比为1∶100∶0.04。

实施例六

（1）蓖麻蚕丝用0.5%的碳酸氢钠溶液煮沸30min脱胶，重复3次后获得丝素蛋白纤维；

（2）丝素蛋白纤维溶于1.6%氯化钙-90%甲酸溶液，丝素纤维分散液浓度30%；

（3）将丝素纤维分散液缓慢滴入碳酸钠溶液进行矿化反应，滴加时间0.5h；丝素纤维与碳酸钠的质量比为1∶0.1；将反应后的溶液过滤、洗涤、干燥得到外观白色、粉末状的碳酸钙纳米线；碳酸钙线直径在140-160nm，长度约680nm，具有高的长径比；

（4）通过分筛获得直径10-15μm的氯化钠颗粒，然后加入丝素纤维分散液中，并搅拌均匀，加入碳酸钙纳米线，去除甲酸后浸入流动水中去除氯化钠，得到湿态丝素纤维支架；湿态丝素纤维支架在-10℃冷冻，然后-20℃冷冻干燥，得到碳酸钙增强的丝素纤维支架，压缩模量约812kPa，支架内部纤维直径为500nm-0.8μm，纤维之间还存在碳酸钙纳米线，支架孔隙率大于50%，孔径范围为80-140μm，丝素纤维与氯化钠、碳酸钙纳米线的质量比为1∶100∶0.01。

实施例七

（1）柞蚕丝用0.5%的碳酸氢钠溶液煮沸30min脱胶，重复3次后获得丝素蛋白纤维；

（2）丝素蛋白纤维溶于1.2%氯化钙-98%甲酸溶液，丝素纤维分散液浓度24%；

（3）将丝素纤维分散液缓慢滴入碳酸钠溶液进行矿化反应，滴加时间0.5h；丝素纤维与碳酸钠的质量比为1∶0.6；将反应后的溶液过滤、洗涤、干燥得到外观白色、粉末状的碳酸钙纳米线；碳酸钙线直径在90-100nm，长度约620nm，具有高的长径比；

（4）通过分筛获得直径10-15μm的氯化钠颗粒，然后加入丝素纤维分散液中，并搅拌均匀，加入碳酸钙纳米线，去除甲酸后浸入流动水中去除氯化钠，得到湿态丝素纤维支架；湿态丝素纤维支架在-10℃冷冻，然后-20℃冷冻干燥，得到碳酸钙增强的丝素纤维支架，压缩模量约98MPa，支架内部纤维直径为500nm-5μm，纤维之间还存在碳酸钙纳米线，支架孔隙率大于50%，孔径范围为80-100μm，丝素纤维与氯化钠、碳酸钙纳米线的质量比为1∶100∶0.05。

实施例八

（1）桑蚕丝用0.5%的碳酸氢钠溶液煮沸30min脱胶，重复3次后获得丝素蛋白纤维；

（2）丝素蛋白纤维溶于1.5%氯化钙-98%甲酸溶液，丝素纤维分散液浓度10%；

（3）将丝素纤维分散液缓慢滴入碳酸钠溶液进行矿化反应，滴加时间0.5h；丝素纤维与碳酸钠的质量比为1∶0.3；将反应后的溶液过滤、洗涤、干燥得到外观白色、粉末状的碳酸钙纳米线；碳酸钙线直径在90-130nm，长度约640nm，具有高的长径比；

（4）通过分筛获得直径10-15μm的氯化钠颗粒，然后加入丝素纤维分散液中，并搅拌均匀，加入碳酸钙纳米线，去除甲酸后浸入流动水中去除氯化钠，得到湿态丝素纤维支架；湿态丝素纤维支架在-10℃冷冻，然后-60℃冷冻干燥，得到碳酸钙增强的丝素纤维支架，压缩模量约192kPa，支架内部纤维直径为800nm-12μm，纤维之间还存在碳酸钙纳米线，支架孔隙率大于50%，孔径范围为90-110μm，丝素纤维与氯化钠、碳酸钙纳米线的质量比为1∶100∶0.02。

实施例九

（1）桑蚕丝用0.5%的碳酸氢钠溶液煮沸30min脱胶，重复3次后获得丝素蛋白纤维；

（2）丝素蛋白纤维溶于1.1%氯化钙-90%甲酸溶液，丝素纤维分散液浓度8%；

（3）将丝素纤维分散液缓慢滴入碳酸钠溶液进行矿化反应，滴加时间0.5h；丝素纤维与碳酸钠的质量比为1∶0.12；将反应后的溶液过滤、洗涤、干燥得到外观白色、粉末状的碳酸钙纳米线；碳酸钙线直径在90-140nm，长度约630nm，具有高的长径比；

（4）通过分筛获得直径10-15μm的氯化钠颗粒，然后加入丝素纤维分散液中，并搅拌均匀，加入碳酸钙纳米线，去除甲酸后浸入流动水中去除氯化钠，得到湿态丝素纤维支架；湿态丝素纤维支架在-90℃冷冻，然后-20℃冷冻干燥，得到碳酸钙增强的丝素纤维支架，压缩模量约782kPa，支架内部纤维直径为780nm-2μm，纤维之间还存在碳酸钙纳米线，支架孔隙率大于50%，孔径范围为80-90μm，丝素纤维与氯化钠、碳酸钙纳米线的质量比为1∶100∶0.02。

实施例十

（1）桑蚕丝、天蚕丝分别用0.5%的碳酸氢钠溶液煮沸30min脱胶，重复3次后获得各自丝素蛋白纤维；

（2）丝素蛋白纤维溶于1.6%氯化钙-98%甲酸溶液，天蚕丝素纤维分散液浓度10%；桑蚕丝素纤维分散液浓度10%；

（3）将桑丝素纤维分散液缓慢滴入碳酸钠溶液进行矿化反应，滴加时间0.5h；丝素纤维与碳酸钠的质量比为1∶0.1；将反应后的溶液过滤、洗涤、干燥得到外观白色、粉末状的碳酸钙纳米线；碳酸钙线直径在110-150nm，长度约650nm，具有高的长径比；

（4）通过分筛获得直径10-15μm的氯化钠颗粒，然后加入天蚕丝素纤维分散液中，并搅拌均匀，加入碳酸钙纳米线，去除甲酸后浸入流动水中去除氯化钠，得到湿态丝素纤维支架；湿态丝素纤维支架在-40℃冷冻，然后-50℃冷冻干燥，得到碳酸钙增强的丝素纤维支架，压缩模量约88MPa，支架内部纤维直径为500nm-25μm，纤维之间还存在碳酸钙纳米线，支架孔隙率大于50%，孔径范围为80-180μm，丝素纤维与氯化钠、碳酸钙纳米线的质量比为1∶100∶0.02。