刺白胶囊及其在治疗白细胞减少症中的应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，具体涉及刺白胶囊及其在治疗白细胞减少症中的应用。

背景技术：

低剂量辐射所致的白细胞减少症，根据其主症有乏力、头晕、心悸、不寐、纳呆食少、低热、咽痛、舌糜等，属于中医学“血虚”、“虚劳”、“温病”等病证范畴。祖国医学认为，乃由先天禀赋不足，后天失养，素体亏损；或外感病邪；或久病误治；或气滞血瘀；或由药物所伤导致气血俱虚，阴阳失和，脏腑亏损。中医认为“血者水谷之精也，生化于脾”，脾为后天之本，主运化，主四肢，主肌肉，脾虚则不健运，血之生化无源，食欲差，消瘦，乏力。肾主骨，生髓，藏五脏六腑之精气，若肾虚则不满，血不能化。肾虚则髓空，腰膝酸软，遗精，耳鸣，元气衰弱，正气不足，卫外功能衰弱，极易感受外邪侵袭而发病。因此，大多数学者认为，本病应以脾肾论治，健脾养胃，滋阴补肾或温补肾阳。也有的学者从心、肝论治，补益心脾，或调肝补肾。

目前抗辐射药物的种类主要包括：含硫化合物、免疫调节剂、雌激素类、细胞因子类、钙拮抗剂和中草药等。但作为实用还有许多不足之处：含硫类辐射预防药物的效价一般不强，目前效价最强的化合物如WR－2721毒性很强；雌激素类辐射损伤防治药物有效剂量为生理浓度的上千倍，长期使用副作用不易克服。在治疗急性放射病的过程中，初期阶段以祛邪为主兼以扶正，在应用大量清热解毒药时使用利尿药以清热解毒。在假愈期仍以清热解毒、泻火中药为主，使用凉血止血、养阴清热类中药。在临床症状明显恢复阶段，以扶正祛邪为主，在第二阶段的基础上加重补肝肾、补气养血、填精补髓的中药。中药主要对急性放射病产生的造血抑制、免疫功能降低和胃肠功能紊乱起治疗作用。

目前辐射损伤防护天然药物的装备主要是茜草双酯，现有装备药物只能解决中度急性放射病的防治问题。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是如何治疗或辅助治疗低剂量辐射引起的白细胞减少症。

为了解决上述技术问题，本发明首先提供了一种药物。

本发明提供的药物的原料药的组成如下：

刺五加190-210重量份 白花蛇舌草290-310重量份 菟丝子140-160重量份

补骨脂140-160重量份 当归140-160重量份 黄芪190-210重量份

赤勺90-110重量份 熟地140-160重量份 枸杞子140-160重量份

鸡血藤140-160重量份。

上述药物中，制成所述药物的原料药的组成如下：

刺五加200重量份 白花蛇舌草300重量份 菟丝子150重量份

补骨脂150重量份 当归150重量份 黄芪200重量份

赤勺100重量份 熟地150重量份 枸杞子150重量份

鸡血藤150重量份。

上述药物中，所述药物中还含有辅料。

上述药物中，所述辅料为稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂、矫味剂或甜味剂。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了制备上述药物的方法。

本发明提供的制备上述药物的方法包括如下步骤：

(1)将刺五加190-210重量份用水至少提取一次，收集提取液A，浓缩，得到浸膏；

(2)将菟丝子140-160重量份、补骨脂140-160重量份、鸡血藤140-160重量份和白花蛇舌草290-310重量份混合，用乙醇溶液至少提取一次，收集提取液B，除去所述提取液B中乙醇，得到提取液C；

(3)将当归140-160重量份、枸杞子140-160重量份、黄芪190-210、熟地140-160重量份和赤勺90-110重量份混合，用水至少提取一次，得到提取液D，并将所述提取液D与所述提取液C混匀，浓缩，得到清膏；

(4)将所述浸膏和所述清膏混合，即得到所述药物。

上述药物中，

所述刺五加为200重量份、所述白花蛇舌草为300重量份、所述菟丝子为150重量份、所述补骨脂为150重量份、所述当归为150重量份、所述黄芪为200重量份、所述赤勺为100重量份、所述熟地为150重量份、所述枸杞子为150重量份、所述鸡血藤为150重量份。

上述药物中，

步骤(1)中，用水提取两次，每次加8倍量水，每次3小时；

步骤(2)中，用乙醇溶液提取三次，每次加8倍量乙醇溶液，每次2小时；所述乙醇溶液为体积分数为75％的乙醇水溶液；

步骤(3)中，用水提取三次，每次加10倍量水，每次3小时；

步骤(4)中，所述混合后还包括如下步骤：将步骤(4)得到的混合物干燥成干粉，再将所述干粉和干淀粉混匀后，装入空胶囊，得到胶囊剂。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了上述药物或上述方法制备的药物的新用途。

本发明提供了上述药物或上述方法制备的药物在制备具有如下(1)-(4)中任一功能的产品中的应用：

(1)治疗或辅助治疗辐射引起的白细胞减少症；

(2)提高辐射后外周血白细胞的数目；

(3)促进辐射后造血祖细胞的增殖。

上述应用中，所述造血祖细胞为CFU-GM和/或CFU-E和/或BFU-E和/或CFU-Mix。

上述应用中，所述辐射为低剂量辐射，所述低剂量辐射具体为1.0Gy ⁶⁰Coγ射线辐射。

本发明针对现有装备药物只能解决中度急性放射病的防治问题，从天然药物中发现对低剂量辐射和放射病中后期恢复确实有效的药物-刺白胶囊。本发明的刺白胶囊选用刺五加、白花蛇舌草作为君药，刺五加辛、微苦、温，益气健脾，补肾安神，主要用于脾肾阳虚，体虚乏力，食欲不振，腰膝酸痛等症；白花蛇舌草苦、甘、寒，清热解毒，制约方中的温燥之品，又有较好升高白细胞的作用；菟丝子和枸杞子为臣药，既能补肾养阴填精，又能补气健脾养胃。全方具有滋肾健脾，养血补血的作用，不过分温补，而且具有较好的升高白细胞的作用。特别用于防治辐射所致的白细胞减少症。通过实验证明：本发明的刺白胶囊可有效促进1.0Gy ⁶⁰Coγ射线连续3天全身照射外周血象和造血集落的恢复，效果明显优于阳性对照药茜草双脂，通过刺激骨髓干祖细胞增生，减轻其损伤程度，恢复外周血白细胞数，调节机体免疫功能等途径达到对小剂量特别是低剂量辐射所致白细胞减少症的治疗作用。本发明的刺白胶囊不仅对小剂量辐射和放射病后期恢复确有疗效，对辐射损伤防护药物的补缺配套和升级换代也具有重要作用。

附图说明

图1为刺白胶囊对1.0Gyγ射线照射小鼠外周血白细胞的影响。

图2为刺白胶囊对1.0Gyγ射线照射小鼠外周血红细胞的影响。

图3为刺白胶囊对1.0Gyγ射线照射小鼠外周血血红蛋白的影响。

图4为刺白胶囊对1.0Gyγ射线照射小鼠外周血血小板的影响。

图5为照射对照组对1.0Gyγ射线连续3天照射小鼠CFU-GM的影响。

图6为刺白胶囊对1.0Gyγ射线连续3天照射小鼠CFU-GM的影响。

图7为刺白胶囊对1.0Gyγ射线连续3天照射小鼠CFU-Mix的影响。

图8为照射对照组对1.0Gyγ射线连续3天照射小鼠CFU-E的影响。

图9为刺白胶囊对1.0Gyγ射线连续3天照射小鼠CFU-E的影响。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的溶血素，稀释液和清洗液均是山东兰桥科技有限公司的产品。

下述实施例中的RPMI1640是Gibco BRL公司的产品。

下述实施例中的胎牛血清和马血清均是北京军区兽医防治中心的产品。

下述实施例中的Epo、IL-3、L-谷氨酰胺均是Sigma公司的产品。

下述实施例中的甲基纤维素是Whatman公司的产品。

下述实施例中的所用试验仪器均经《中国人民解放军军事医学科学院计量测试站》检测合格，并发合格证。F820型血细胞分析仪是日本Sysmex公司的产品。CO₂培养箱是Thermo Forma公司的产品。

下述实施例中的茜草双脂在文献“宋书元，丁林茂，陈鹰，白玉珍.茜草双酯对造血功能的影响及其毒性研究[J]中西医结合杂志.1985.5(10)：625-626.”中公开过，公众可从中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所获得。

实施例1、刺白胶囊的制备

本发明的刺白胶囊(Cibai jiaonang)的配方如下：刺五加200g、白花蛇舌草300g、菟丝子150g、补骨脂150g、当归150g、黄芪200g、赤勺100g、熟地150g、枸杞子150g、鸡血藤150g。具体制备方法如下：

1、将刺五加200g加水煎煮两次，每次加8倍量水，每次3小时，合并煎液，过滤，将滤液浓缩成浸膏，得到刺五加浸膏；

2、将菟丝子150g、补骨脂150g、鸡血藤150g和白花蛇舌草300g加75％乙醇水溶液加热回流三次，每次8倍量75％乙醇水溶液，每次2小时，合并乙醇提取液，过滤，将滤液减压回收乙醇至无醇味，得到提取液；

3、将当归150g、枸杞子150g、黄芪200g、熟地150g和赤勺100g加水煎煮三次，每次加10倍量水，每次3小时，合并煎液，过滤，并将滤液与步骤2获得的提取液合并，浓缩至相对密度为1.20-1.25(50℃)的清膏；

4、将步骤1获得的刺五加浸膏和步骤3获得的清膏合并，干燥成干粉，并加入适量的干淀粉(质量分数为20-25％)，混匀，装入胶囊，制成1000粒，即得本发明的刺白胶囊。

实施例2、刺白胶囊在治疗低剂量辐射引发的白细胞减少症中的应用

本发明通过观察刺白胶囊对1.0Gy⁶⁰Coγ线连续3天全身照射小鼠外周血白细胞、CFU-GM、CFU-Mix、BFU-E、CFU-E的影响，研究其对低剂量照射小鼠白细胞减少症的治疗作用。具体步骤如下：

(一)实验材料和方法

1、实验材料

BALB/C小鼠，5-6周龄，体重16-20g。实验动物质量合格证号SCXK-(军)2007-004，动物实验设施许可证号SYXK-(军)2007-004。

2、实验方法

实验用BALB/C小鼠78只，雌性48只，雄性30只。其中外周血指标每组10只，共60只，雌雄各半；造血祖细胞培养每组3只，雌性，共18只。饲养3-5天后先称体重，测正常外周血白细胞数。经⁶⁰Coγ射线全身照射，剂量为1.0Gy，连续照射3天，剂量率分别为211.33cGy.min^-1、211.25cGy.min^-1、211.18cGy.min^-1。照射后即可灌胃给药，连续14天，对照组在相应的时间里给予等体积的蒸馏水。各组分别于照射前、照射后第1、4、7、11、14、17、21天检测外周血白细胞数，并于照射后第7天进行CFU-Mix、CFU-GM、BFU-E、CFU-E细胞培养。

根据给药不同分成如下六组：

正常对照组：不进行照射；在相应的时间里给予等体积的蒸馏水，0.25ml/只，每天1次，连续14天；

照射对照组：经⁶⁰Coγ射线全身照射，剂量为1.0Gy，连续照射3天后不给药，在相应的时间里给予等体积的蒸馏水，0.25ml/只，每天1次，连续14天；

茜草对照组(阳性对照)：经⁶⁰Coγ射线全身照射，剂量为1.0Gy，连续照射3天后进行灌胃给药，药物为茜草双脂(片剂)，剂量为125mg/kg，每天1次，连续14天；

刺白高剂量组：经⁶⁰Coγ射线全身照射，剂量为1.0Gy，连续照射3天后进行灌胃给药，药物为步骤一中制备的刺白胶囊，剂量为30g/kg，每天1次，连续14天；

刺白中剂量组：经⁶⁰Coγ射线全身照射，剂量为1.0Gy，连续照射3天后进行灌胃给药，药物为步骤一中制备的刺白胶囊，剂量为15g/kg，每天1次，连续14天；

刺白低剂量组：经⁶⁰Coγ射线全身照射，剂量为1.0Gy，连续照射3天后进行灌胃给药，药物为步骤一中制备的刺白胶囊，剂量为7.5g/kg，每天1次，连续14天。

(二)指标检测

1、外周血象检测

每组10只，雌雄各半，分别在照射前、照射后1、3、5、7、11、14、15、17、21天，每只小鼠尾静脉取血20μl。用F820型血细胞分析仪检测外周血象。

(1)外周血白细胞

与照射对照组比较，阳性药茜草双酯在照射后第7天白细胞数显著升高，本发明的刺白高剂量组在照射后第4-7天白细胞数也显著升高，(p<0.05，表1，图1)，且明显高于阳性对照组。说明本发明的刺白胶囊可以提高照射后小鼠外周血白细胞数，治疗辐射引发的白细胞减少症。

表1、刺白胶囊对1.0Gyγ射线连续3天照射后小鼠外周血白细胞(10⁹/L)的影响

注：与照射对照组比较，*p<0.05；与阳性对照组比较，#p<0.05；n＝10，下同。

(2)外周血红细胞与血红蛋白

照射后各组的红细胞、血红蛋白均呈现先上升后下降又逐渐恢复的趋势，但与正常对照组相比无统计学差异(表2、表3，图2、图3)。说明本发明的刺白胶囊对血红细胞与血红蛋白无显著作用。

表2、刺白胶囊对1.0Gyγ射线连续3天照射小鼠外周血红细胞(10¹²/L)的影响

表3、刺白胶囊对1.0Gyγ射线连续3天照射小鼠外周血血红蛋白(g/L)的影响

(3)血小板数

照射对照和其他用药组的血小板，在照射后1天均呈现先上升后下降的趋势，照后7天达最低值，此后缓慢回升。其中，刺白高剂量组和低剂量组在照射后第1天血小板数显著升高，阳性药茜草双酯在照射后第1天血小板数显著升高(p<0.05，表4，图4)。说明本发明的刺白胶囊可以提高照射后小鼠外周血血小板数目。

表4、刺白胶囊对1.0Gyγ射线连续3天照射小鼠外周血血小板(10⁹/L)的影响

注：与照射对照组比较，*p<0.05，***p<0.001，n＝10。

2、小鼠造血祖细胞影响

参照文献“刘秀珍.造血祖细胞培养技术实验手册.北京：北京出版社，1993.25-133”中的方法进行集落培养，计数各组小鼠造血祖细胞个数：CFU-GM(粒细胞巨噬细胞集落生成单位)、CFU-E(红细胞集落生成单位)、BFU-E(红细胞爆裂型集落生成单位)、CFU-Mix(混合集落生成单位)；并用Microsoft excel输入所有动物不同时间的测量结果，计算各组均数、标准差及组间均数的显著性t检验。具体步骤如下：

(1)照射后7天颈椎脱臼处死小鼠，每组3只，雌性。置75％酒精中浸泡片刻消毒，取小鼠股骨，用RPMI 1640培养液冲出骨髓细胞，过4号针头制成单细胞悬液，计数细胞并算出接种细胞量，按接种有核细胞5×10⁵/ml体系计算。

(2)配粒系体系(马血清2ml、G-CSF 100ng、步骤(1)获得的细胞1×10⁵/ml、RPMI 1640培养液补至7.6ml)，用恒温水浴法在37℃条件下预热10min后，向粒系体系中加入5％煮沸琼脂0.5ml立即混匀，用5ml注射器边加边摇快速混匀。每皿滴入上述体系1ml，放一塑料盒中并放几个加水的平皿后，于37℃、5％CO₂的条件下培养6天观察计数CFU-GM，多于50个细胞为一个细胞集落。

(3)配红系、混合系培养体系(浓度为10^-4M的巯基乙醇0.2ml、质量分数为3％的L-谷氨酰胺0.03ml、马血清0.7ml、Epo 4U、IL-3 60ng、质量分数为2.7％的甲基纤维素0.7ml、步骤(1)获得的细胞1×10⁶/ml)，振荡器混匀，加入24孔板中，每孔0.2ml，于37℃、5％CO₂的条件下培养3天观察计数CFU-E和CFU-GM，多于50个细胞为一个细胞集落。于37℃、5％CO₂的条件下培养7天观察计数BFU-E、CFU-mix。

结果如表5、图5、图6、图7、图8和图9所示。与照射对照组比较，刺白高剂量组与阳性对照茜草双酯组在照射7后均促进CFU-GM、CFU-E增殖(p<0.05-0.001)；但刺白高剂量组同时促进BFU-E、CFU-Mix增殖(p<0.05-0.01)。说明本发明的刺白胶囊可以促进照射后小鼠CFU-GM、CFU-E、BFU-E和CFU-Mix增殖。

表5、刺白胶囊对1.0Gyγ射线连续3天照射小鼠造血祖细胞的影响

注：与照射对照组比较，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

通过上述实验证明，小鼠经1.0Gy ⁶⁰Coγ射线全身照射3天后，白细胞降至正常值的50-60％左右，阳性药茜草双酯在照射后第7天白细胞数显著升高，同时促进CFU-GM和CFU-E增殖，本发明的刺白胶囊在照射后第1-7天白细胞数显著升高(p<0.05)；在照射后7天促进CFU-GM、CFU-E、BFU-E和CFU-Mix增殖(p<0.05-0.001)。说明本发明的刺白胶囊在照射后早期能提高外周血白细胞数，并促进CFU-GM、CFU-E、BFU-E和CFU-Mix增殖。