一种瓜子金提取物的制备及其促海马神经发生的应用的制作方法

本发明涉及一种促进成年海马神经干细胞增殖复合物的制备方法，尤其是涉及一种促进成年海马神经干细胞增值的瓜子金提取物制备方法。

背景技术：

海马神经干细胞位于海马齿状回颗粒细胞下层区域，其可以在一生中持续分裂增殖。神经干细胞分裂产生新的神经细胞，迁移进入海马齿状回区，少数新生细胞转化为胶质细胞，绝大多数转化为神经细胞，大约4-6周后神经细胞成熟，并入已有的神经回路这个过程被称为神经发生。成年后海马神经发生在维护大脑可塑性具有重要的作用。在成人中，大约一天可以产生700个新神经细胞，替换35%的海马齿状回细胞。目前研究表明绝大多数的神经系统的疾病均合神经发生改变相关。包括抑郁症，阿耳茨海默氏病，帕金森病以及因衰老可引起的认知能力下降等疾病。因此，增强海马成年神经发生是潜在神经系统的疾病治理方法。

瓜子金作为一种具有悠久历史的中草药，具有多种生物学功能，是一种优良的促进海马成年神经干细胞增加的天然产物。因此具有巨大的开发潜力和应用价值。

技术实现要素：

本发明的目的在于以植物瓜子金根为原料，提供一种促进成年海马神经干细胞增殖的瓜子金提取物制备方法，得到促进神经发生作用的提取物，利用该提取物再加入药物或食品载体可以制备促进神经发生作用试剂。

本发明所述方法包括以下工艺步骤：

（1）粉碎：将干燥瓜子金根粉碎至20~50目；

（2）粗提取：按照重量与体积比，1g上述瓜子金粉中加入10ml的水，煮沸2小时后过滤，得到滤液，再在过滤后的渣中加入第1次加水量的一半，煮沸2小时后过滤；

（3）乙醇沉淀：收集步骤（2）得到的滤液，在滤液中加入4倍于滤液的浓度为100％的乙醇，1-4℃搅拌过夜，离心收集上清液，浓缩，真空冷冻干燥，即得到瓜子金提取物。

本发明所制备复合物用于促海马神经发生作用：

本复合物作用物作用很多，但是其突出作用是促海马神经发生作用，瓜子金提取物溶于生理盐水中配制100 ug/ml溶度瓜子金溶液，腹腔注射小鼠体内，连续7天，每天1ml；对照小鼠每日注射1ml生理盐水，或者将瓜子金溶于水中（100 mg/ml），连续7天喂食小鼠（5 ml/天）；对照小鼠每天正常饮水，为了统计瓜子金提取物促海马神经发生的作用，在第六天，腹腔注射5-溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）。BrdU能够在细胞增殖时期代替胸腺嘧啶（T）渗入正在复制的DNA分子，而后利用抗Brdu抗体，免疫染色，显示增殖细胞；第七天取脑，切片，利用免疫组化技术分析大脑中海马齿状回颗粒细胞下层区域BrdU阳性细胞数目，用以计算海马神经干细胞分裂行成新生神经细胞数目；结果显示，瓜子金提取物可以提高50%的海马神经干细胞分裂。

本发明的有益效果是：制备工艺简单易行，非常适合推广应用。制备方法中有效的移除大分子化合物，尽量的保存了小分子两性化合物，这些小分子两性化合物可穿越血脑屏障，进入脑部。因此相对于普通水提取物，该提取物促神经发生作用明显。瓜子金提取物可加入到药物载体，混合，制粒，干燥，然后按照常规的药剂制备方法制成颗粒剂、或胶囊剂、或片剂、或口服液、或注射剂；或者加入载体，按照常规方法制成保健饮料或保健食品。

附图说明

图1为瓜子金增加了海马齿状回颗粒细胞下层区域；

图中：箭头为BrdU阳性细胞，A、C为对照小鼠，B、D为瓜子金喂食小鼠，箭头为BrdU阳性细胞；

图2海马齿状回颗粒细胞下层区域BrdU阳性细胞数目统计结果；

图中：PJ为瓜子金，control为对照鼠，***P<0.01。

具体实施方式

所述瓜子金提取物的制备方法

1）将瓜子金根洗净干燥后粉碎，过20目筛，称取100g瓜子金粉，加入1000mL水，煮沸2h，过滤得到滤液；再在过滤后的渣中加入500ml水，煮沸提取2h，过滤得到滤液；

2）收集两次滤液，再加入4倍于滤液的乙醇，4℃搅拌过夜，离心，过滤取滤液，浓缩后冷冻真空干燥，即得促神经发生作用瓜子金提取物。

瓜子金提取物的应用实例：

1）将瓜子金溶于生理盐水配制100ug/ml溶液，每天腹腔注射1ml瓜子金溶液，连续7天，对照小鼠每天注射生理盐水1ml；在第6天注射Brdu（50mg/kg），第7天，取脑，切片，PBS溶液洗3次，每次5分钟，加入Brdu一抗4℃孵育过夜，移除一抗，PBS溶液洗3次，每次5分钟，加入二抗，孵育一个小时后，移除二抗，PBS溶液洗3次，每次5分钟，加入Dapi（细胞核染料）孵育5分钟；PBS溶液洗3次，每次5分钟，封片，在荧光显微镜下观察海马齿状回颗粒细胞下层区域BrdU阳性细胞数目

2）将瓜子金溶于生理盐水配制100mg/ml溶液。每天喂食5ml瓜子金溶液，连续7天，对照小鼠每天喂食水，在第6天注射Brdu（50mg/kg），第7天，取脑，切片，PBS溶液洗3次，每次5分钟，加入Brdu一抗4℃孵育过夜；移除一抗，PBS溶液洗3次，每次5分钟；加入二抗，孵育一个小时后，移除二抗，PBS溶液洗3次，每次5分钟，加入Dapi（细胞核染料）孵育5分钟；PBS溶液洗3次，每次5分钟，封片，在荧光显微镜下观察海马齿状回颗粒细胞下层区域BrdU阳性细胞数目，图1为拍摄的海马齿状回颗粒细胞下层荧光照片，箭头所指的荧光细胞为BrdU细胞，代表新分裂产生的细胞；图2为海马齿状回颗粒细胞下层区域BrdU阳性细胞数目统计结果，结果显示正常对照鼠海马齿状回颗粒细胞下层区域BrdU阳性细胞数目大约有2200个，瓜子金提取物处理小鼠海马齿状回颗粒细胞下层区域BrdU阳性细胞数目大约有3500个，新生的细胞数目增加了59%。