本发明涉及疫苗制备，具体地说，涉及一种多价肺炎球菌荚膜多糖结合疫苗的制备方法。
背景技术：
：抗原与佐剂的吸附率是决定疫苗免疫效果的关键因素，在吸附过程中，抗原与佐剂通过静电力等物理作用力相互结合，通过增加抗原的表面积，可增强抗原的免疫效果。同时，佐剂吸附的疫苗可在接种点产生“储存库效应”，使抗原在局部组织内贮存，通过抗原的缓慢释放，充分延长抗原作用时间，提高免疫应答。一般认为，佐剂的吸附率越高，免疫效果相应也越好，反之吸附率越低，免疫效果则越差。WHO要求白喉和破伤风类毒素疫苗的吸附率不低于80％，但肺炎球菌结合疫苗的吸附率普遍偏低。因此，在现有技术的基础上，进一步提高肺炎球菌结合疫苗的吸附率，对于提高肺炎球菌结合疫苗的免疫效果是很有必要的。铝佐剂是目前使用最广泛的佐剂之一，也是国内目前批准的唯一可用于人体的佐剂，广泛用于疫苗产品，国内目前的乙型肝炎疫苗，无细胞百白破疫苗等都是含铝佐剂的吸附疫苗。目前，关于肺炎球菌结合疫苗吸附工艺的报道尚少，现有已公开的肺炎球菌结合疫苗铝佐剂吸附工艺是将13种肺炎球菌荚膜多糖-蛋白结合物混合后直接加入铝佐剂进行吸附，该方法易造成少数血清型吸附率较低，影响免疫效果。技术实现要素：为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种制备多价肺炎球菌荚膜多糖结合疫苗的新方法。为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：第一方面，本发明提供了一种多价疫苗的制备方法，根据抗原的吸附率，由低到高将其与佐剂进行有先后顺序的分步吸附。具体而言，本发明提供了一种多价肺炎球菌荚膜多糖结合疫苗的制备方法，相应的，在肺炎球菌荚膜多糖-蛋白结合物与佐剂进行吸附的过程中：先将吸附率较低的血清型肺炎球菌荚膜多糖-蛋白结合物与铝佐剂进行吸附，再将其他血清型肺炎球菌荚膜多糖-蛋白结合物与铝佐剂进行吸附。需要说明的是，所述“吸附率较低”为一种相对概念，即根据所要制备的多价疫苗中各单价血清型肺炎球菌荚膜多糖-蛋白结合物原液与铝佐剂的吸附率，选择吸附率相对较低的单价血清型肺炎球菌荚膜多糖-蛋白结合物原液优先与铝佐剂进行吸附。所述制备方法主要包括以下步骤：基于配制的终体积，先加入氯化钠和聚山梨酯80，之后再加入铝佐剂，根据不同血清型肺炎球菌荚膜多糖-蛋白结合物原液与铝佐剂的吸附率，将吸附率较低的血清型优先进行吸附，再对其它血清型结合物进行吸附，最后加入琥珀酸提高溶液缓冲能力。更为具体地，所述制备方法包括如下顺序的步骤：S1、向配置容器中加入所需体积的0.15mol/L氯化钠溶液；S2、向氯化钠溶液中加入0.5～2％聚山梨酯80得到溶液1，使聚山梨酯80的终浓度为0.005-0.02％；S3、向溶液1中加入浓度为1～2mg/mL的铝佐剂溶液得到溶液2，充分搅拌5-10分钟，使铝佐剂的终浓度为0.1～0.25mg/mL；S4、向溶液2中先加入吸附率较低的血清型肺炎球菌荚膜多糖-蛋白结合物，吸附30～120分钟后，再加入其他血清型肺炎球菌荚膜多糖-蛋白结合物，继续吸附16～24小时，得到溶液3；S5、向溶液3中加入浓度为0.1～1M、pH为5～7的琥珀酸溶液，调节体系pH为5.4～7.4，并使琥珀酸的终浓度为0.5～5mM，充分搅拌20-30分钟，即得多价肺炎球菌荚膜多糖结合疫苗。“终浓度”系指该组分相对于最后疫苗制品中的浓度。上述步骤中的“％”如无特殊说明，指体积百分比。进一步地，鉴于本发明制备的疫苗为多价疫苗，所述肺炎球菌荚膜多糖-蛋白结合物需为多种。其中，前述吸附率较低的血清型肺炎球菌荚膜多糖-蛋白结合物为：对多种肺炎球菌荚膜多糖-蛋白结合物进行吸附率测定后，多种肺炎球菌荚膜多糖-蛋白结合物中吸附率较低的30％-50％的血清型。需要说明的是，本发明所提出的分步吸附，并不局限于前述的两步吸附，还可为多步吸附。例如，测定各单价血清型肺炎球菌荚膜多糖-蛋白结合物的吸附率后，由低到高排列，将吸附率最低的几种结合物先进行吸附，再将吸附率次低的几种结合物进行吸附，最后将其他结合物进行吸附。因此，只要是依据吸附率由低到高进行先后分步吸附的方法，均属于本发明的保护范围。进一步地，所述肺炎球菌荚膜多糖-蛋白结合物为肺炎球菌荚膜多糖和载体蛋白经共价连接形成的复合物。其中，所述肺炎球菌荚膜多糖的血清型为1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19F、19A、20、22F、23F或33F型，所述载体蛋白为DT、TT或CRM197。需要说明的是，本发明人在具体实施方式中虽然仅具体给出了13价肺炎球菌荚膜多糖结合疫苗的制备方法，但本发明请求保护的制备方法适用于其他多价疫苗的制备，如7价肺炎球菌荚膜多糖结合疫苗、24价肺炎球菌荚膜多糖结合疫苗等。随着科学技术的发展，将来或可发现其他新的血清型肺炎球菌荚膜多糖。但无论所述血清型肺炎球菌荚膜多糖是否为一种新产品，只要利用了本发明所述制备方法(分步吸附或吸附过程中各试剂的添加顺序)，均属于本发明的保护范围。可选地，所述铝佐剂为磷酸铝佐剂和/或氢氧化铝佐剂。第二方面，本发明提供了一种多价肺炎球菌荚膜多糖结合疫苗，所述疫苗中各血清型肺炎多糖的的吸附率均大于75％。具体而言，所述疫苗由本发明前述制备方法制备得到。该方法通过分步吸附技术使抗原与佐剂充分吸附，通过该方法制备的肺炎球菌荚膜多糖结合疫苗吸附率高，稳定性好，因蛋白载体存在一定的不良反应，因此本发明旨在有限范围内尽可能的降低蛋白含量，提高佐剂吸附率，从而最大限度的发挥肺炎球菌结合疫苗的免疫效果。作为优选，所述疫苗的多种血清型肺炎球菌荚膜多糖中，6B型肺炎球菌荚膜多糖的浓度为8±1.6μg/mL，其余血清型肺炎球菌荚膜多糖的浓度为4±0.8μg/mL。本发明涉及到的原料或试剂均为普通市售产品，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，得到具体实施方式。本发明的有益效果在于：本发明提供了一种多价肺炎球菌荚膜多糖结合疫苗的制备方法，与传统方法相比，避免了同时吸附血清型肺炎球菌荚膜多糖-蛋白结合物导致个别血清型吸附率低的缺点，利用分步吸附技术使吸附率较低的血清型优先吸附，并通过优化赋形剂与缓冲溶液的添加次序，使吸附过程更加完善，从而提高了肺炎球菌结合疫苗的吸附率。采用本发明提供的方法制备得到的多价肺炎球菌荚膜多糖结合疫苗，吸附率高，稳定性好，可在控制多糖及蛋白载体含量的条件下，最大限度的发挥13价肺炎球菌结合疫苗的免疫效果。具体实施方式下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例113价肺炎球菌荚膜多糖结合疫苗配制13价肺炎球菌荚膜多糖结合疫苗800mL。本实施例中的13价肺炎球菌荚膜多糖-蛋白结合物包含血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19F、19A、23F。分别对单价血清型肺炎球菌荚膜多糖-蛋白结合物原液与铝佐剂进行吸附，测定13种血清型肺炎球菌荚膜多糖-蛋白结合物原液与铝佐剂的吸附率，选出吸附率较低的5种血清型为：5、6A、6B、18C、19F。按照本发明的疫苗制备方法，吸附过程步骤如下：(1)配制13价肺炎球菌荚膜多糖-蛋白结合物的混合液1及混合液2，混合液1包含血清型：5、6A、6B、18C、19F，混合液2包含血清型：1、3、4、7F、9V、14、19A、23F，配制的混合液中除6B外各型多糖浓度为16±3.2μg/mL，6B为32±6.4μg/mL。(2)在配置容器中加入347.06mL的0.15mol/L氯化钠溶液。(3)加入1％(V/V)聚山梨酯808mL，使其终浓度为0.01％(V/V)。充分搅拌10分钟。(4)加入浓度为1.52mg/mL磷酸铝佐剂溶液141.54mL，使其终浓度为0.25mg/mL。充分搅拌10分钟。(5)将100.14mL的混合液1加入至上述溶液中优先吸附，充分搅拌60分钟后，加入混合液2195.26mL，继续搅拌吸附18小时。此时各血清型多糖的终浓度为：除6B外各型多糖浓度为4±0.8μg/mL，6B为8±1.6μg/mL。(6)向上述溶液加入浓度为0.1M，pH为6.0的琥珀酸溶液8mL，使其终浓度为0.5mM，充分搅拌混合，测量pH值为5.98，充分搅拌30分钟，即得吸附的13价肺炎球菌结合疫苗。对比例1不同吸附方法对13价肺炎球菌结合疫苗吸附率的影响设置对比例1，其与实施例1的不同之处在于：将13种单价血清型肺炎球菌荚膜多糖-蛋白结合物进行混合，混合后直接加入铝佐剂进行吸附。分别将实施例1与对比例1制备的疫苗解吸附，测定各型多糖含量以及离心后上清多糖含量，从而计算吸附率。吸附率＝(1-上清多糖含量/解吸附后总糖含量)×100％。比较两种方法制得的13价肺炎球菌结合疫苗各型多糖吸附率，见表1。结果显示本发明方法制备的13价肺炎球菌结合疫苗与传统制备方法相比总体吸附率高，各血清型之间吸附率差异较小。表113价肺炎球菌结合疫苗吸附率对比例2不同吸附顺序对13价肺炎球菌结合疫苗吸附率的影响设置对比例2，其与实施例1的不同之处在于，步骤如下：(1)配制13价肺炎球菌荚膜多糖-蛋白结合物的混合液1及混合液2，混合液1包含血清型：5、6A、6B、18C、19F，混合液2包含血清型：1、3、4、7F、9V、14、19A、23F，配制的混合液中除6B外各型多糖浓度为16±3.2μg/mL，6B为32±6.4μg/mL。(2)在配置容器中加入347.06mL0.15mol/L氯化钠溶液。(3)加入浓度为0.1M，pH为6.0的琥珀酸溶液8mL，使其终浓度为0.5mM，充分搅拌混合。(4)加入1％聚山梨酯808mL，使其终浓度为0.01％。充分搅拌10分钟。(5)加入浓度为1.52mg/mL磷酸铝佐剂溶液141.54mL，使其终浓度为0.25mg/mL。充分搅拌10分钟。(6)将适当体积的混合液1加入至上述溶液中优先吸附，充分搅拌60分钟后，加入混合液2，继续搅拌吸附18小时。即得吸附的13价肺炎球菌结合疫苗。分别将实施例1与对比例2制备的疫苗解吸附，测定各型多糖含量以及离心后上清多糖含量，从而计算吸附率。吸附率＝(1-上清多糖含量/解吸附后总糖含量)×100％。比较两种方法制得的13价肺炎球菌结合疫苗各型多糖吸附率，见表2。结果显示本发明方法制备的13价肺炎球菌结合疫苗与传统制备方法相比总体吸附率高，各血清型之间吸附率差异较小。表213价肺炎球菌结合疫苗吸附率实验例113价肺炎球菌结合疫苗吸附率稳定性考察本实验例采用实施例1制备的13价肺炎球菌结合疫苗进行吸附率的稳定性考察。即通过对13个血清型肺炎球菌荚膜多糖-蛋白结合物与铝佐剂吸附率的测定，考察在2-8℃条件下13价肺炎球菌结合疫苗吸附率的稳定性。具体实施步骤如下：将13价肺炎球菌结合疫苗于2-8℃条件下放置六个月，到期当天将疫苗取出，解吸附后对各个血清型进行吸附率测定，结果见表3。结果表明该方法制备的13价肺炎球菌结合疫苗吸附率稳定性好。表3各血清型多糖吸附率稳定性考察血清型0个月3个月血清型0个月3个月183.2180.059V82.0880.39385.5182.321485.2085.15486.6785.1418C78.2577.63581.3680.3319A82.6080.226A78.6677.4619F80.5879.586B80.3279.2823F86.8485.127F86.1584.56实验例213价肺炎球菌结合疫苗免疫原性考察本实验例采用实施例1制备的13价肺炎球菌结合疫苗进行免疫原性的考察。通过酶联免疫法(ELISA)测定13价肺炎球菌结合疫苗免疫小鼠后，其血清中抗特定血清型肺炎链球菌荚膜多糖抗体IgG。具体实施方案：注射部位：皮下注射；免疫程序：0、14、28天免疫，第35天眼眶采血，离心取血清；免疫剂量：0.1mL/只，结果见表4。表413价肺炎球菌结合疫苗免疫小鼠抗体效价测定血清型抗体效价血清型抗体效价151209V5120312801425604512018C25605256019A51206A128019F25606B256023F12807F2560本实施例结果表明，采用本发明所述方法制备的13价肺炎球菌结合疫苗免疫小鼠后，各血清型的抗肺炎球菌荚膜多糖特异性抗体效价较高，即该疫苗有较好的免疫效果。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。当前第1页1 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