本发明属于医学治疗领域，具体地，本发明提供了一种预防、改善或减少接受者中移植后的移植物衰竭(graft failure)的方法。
背景技术：
移植是一种复杂的医学治疗，其允许将器官从供体移植到器官不能充分发挥作用的接受者，以改善接受者的生活质量，延长预期寿命，以及挽救生命。
移植物衰竭(transplant failure)是移植最大的挑战之一。在器官移植后，宿主和移植物中存在不可避免的应答。这种应答可由于与器官摘取、灌注、保存和手术有关的创伤而发生。这种应答也可涉及免疫系统对供体和接受者之间的抗原差异的特异性识别(1)。总之，这些机制可急性发展或在几周、几个月或甚至几年后发展，并导致最终引起移植物丧失的破坏性应答。这个过程也经常被称为移植排斥。
移植物丧失是多种应答的结果，并且始于细胞死亡过程，此过程如果不停止，则会增加并导致移植物衰竭。无法完全阻止导致细胞死亡并由器官摘取、保存和缺血/再灌注损伤引起的创伤性损伤。因此，减少负面影响的适当的治疗策略是至关重要的。遗憾的是，可用的选项并不多。
排斥是免疫系统对外来物质或抗原的天然应答的结果。这种复杂的过程主要是由T淋巴细胞介导的，虽然其涉及外来抗原、抗体、T淋巴细胞、巨噬细胞、细胞因子(也称为淋巴因子或白细胞介素)、粘附分子(即共刺激分子)和增强T淋巴细胞与B淋巴细胞结合的膜蛋白之间的一系列相互作用。
通常进行免疫抑制治疗以预防和治疗移植排斥以及延长移植物和患者的存活期。然而，由于免疫抑制剂的效力以及个体间和个体内药代动力学的可变性，需要剂量个体化来维持适当的免疫抑制，同时使不良反应最小化。差的水溶性和生物利用度导致给药免疫抑制剂如环孢素和西罗莫司的复杂性。移植排斥可以是由预先形成的抗体引起的超急性移植排斥(在移植后前几个小时内或在前几天期间)，由T淋巴细胞引起的急性移植排斥(在前几天或几个月期间)，或主要由抗体引起的慢性移植排斥(在数月或甚至数年后)。
供体器官持续短缺。这导致了重大的健康问题，因为器官移植等候名单上的患者可能由于没有器官移植而死亡。由于他们的治疗成本高，他们是卫生保健系统的沉重的财政负担(2-10)。
因此，迫切需要提高移植成功率的方法。
技术实现要素：
我们发现抗凝血活性降低的肝素，特别是戊糖贫化的肝素(pentasaccharide-depleted heparin)可以用于减少、改善或预防接受者中外来器官的移植物衰竭。戊糖贫化的肝素的抗凝血活性显著降低。此外，它显示出显著的中和组蛋白介导的细胞毒性的能力。这种组蛋白介导的细胞毒性是造成移植中移植物衰竭的原因。因此，本发明涉及用于治疗或预防人或动物体中的移植物衰竭的戊糖贫化的肝素。
发明详述
肝素是多糖链的混合物(Casu，B.(1989).“Structure of heparin and heparin fragments(肝素和肝素片段的结构)”.Ann N Y A cad Sci 556：1-17)。所述多糖链的组成及其长度是变化的。具有所谓的戊糖结构域的链与抗凝血酶(AT)牢固结合，抗凝血酶(AT)是主要的循环抗凝血蛋白之一(Casu，B.等，Biochem J 197(3)(1981)599-609)。
抗凝血活性降低的肝素是本领域已知的，并且有一些已知的制备方法。首先，可以通过亲和层析使肝素中的戊糖贫化，从而获得非抗凝血肝素或抗凝血活性降低的肝素。也可以对肝素进行化学处理，以获得抗凝血活性降低的肝素。
可通过本领域已知的方法从未分级肝素(UFH)获得戊糖贫化的肝素。在优选的方法中，通过亲和层析获得戊糖贫化的肝素。其中，使UFH穿过含有固定的AT的柱。含有戊糖序列的分子与柱结合，而其他物质则穿过。未结合的物质被称为低亲和性物质(LAM)，而结合的物质被称为高亲和性物质(HAM)。LAM的戊糖显著减少，因此其抗凝血活性也显著降低，而HAM具有完全的抗凝血活性。
LAM也可以被描述为天然肝素的戊糖贫化的级分。
在本文中，术语“戊糖贫化的肝素”用于指其中戊糖含量与市售肝素相比显著降低的肝素级分。
如本文所用，术语“显著减少或降低”是指减少至少10％，例如20％或30％，更优选40或50％，甚至更优选超过60％或70％或80％例如90％或超过98％例如超过99％或甚至100％。最优选的是，当如下文Hemker等(2003)所述测试凝血酶生成时，戊糖贫化的级分不含任何可检出的戊糖。相反，抗凝血活性降低的肝素是指具有降低的抗凝血活性的肝素，例如降低至少10％，例如20％或30％，更优选40或50％，甚至更优选超过60％或70％或80％例如90％或超过98％例如超过99％或甚至100％。最优选的是，当如下文Hemker等(2003)所述测试凝血酶生成时，所述抗凝血活性降低的肝素不含有任何可检出的抗凝血活性。
在实验部分中详细描述了如何可以获得戊糖贫化的肝素。它在其中被称为LAM，是低亲和性物质的缩写。
我们发现通过这样从UFH中去除抗凝血肝素级分产生了戊糖贫化的肝素，该戊糖贫化的肝素可中和组蛋白介导的细胞毒性，并且可以有利地用于预防供体器官和组织如心脏、肺、肝、角膜、皮肤、子宫、肾、胰腺和肠的移植物衰竭。
如本文所用，术语“移植物衰竭”是指移植的器官不能执行其正常功能。这可能意味着移植的器官完全不能执行其功能或只能执行其部分功能。移植物衰竭也可以指移植器官的功能显著降低或下降的状况。
附图说明
图1：将UFH分离成LAM和HAM。施加2mg UFH。该图显示了254nm处的光密度，其中第一个峰代表收集的LAM，第二个峰包含收集的HAM。第二条曲线表示洗脱物质的电导率。LAM以1ml/min的速率洗脱，HAM以4ml/min的速率洗脱。
图2：不同肝素制剂的抗凝血活性。该图显示脱硫和戊糖贫化两者均产生抗凝血活性降低的肝素级分。
图3：中和组蛋白H3的细胞毒性。该图显示组蛋白H3的细胞毒性在脱硫肝素级分中降低，但在戊糖贫化的肝素中保持完整。
实施例
实施例1：制备AT柱。
根据5ml HiTrap柱(GE Healthcare)的包装插页制备AT柱。用异丙醇洗涤柱后将含～2.5mg AT的5ml偶联缓冲液施加于柱上。然后，采用所描述的程序将蛋白质固定在柱材料上并洗涤柱(根据包装插页)。最后用140mM NaCl，20mM Tris(pH7.4)平衡所述柱。
实施例2：将UFH分离成LAM和HAM。
将2mg未分级肝素施加于柱上。用140mM NaCl，20mM Tris(pH7.4)洗脱LAM，并用2M NaCl，20mM Tris(pH7.4)洗脱HAM。以块梯度的方式施加最后的缓冲液。图1中示出了洗脱模式的实例。
为了获得更大量的LAM，将图1中描述的程序重复数次。
为了确定LAM中是否不含HAM，使用两次测试。首先，将收集的HAM重新施加于AT柱并进行如上所述的程序。没有发现HAM峰。其次，测量LAM对凝血酶生成的影响。反应混合物(120μl)包含1.5倍稀释的正常混合血浆，3μl LAM或缓冲液，4μM DOPL(60％DOPC，20％DOPC和20％DOPE)，5pM组织因子(Innovin)，100mM CaCl2和417μM ZGGR-AMC。反应从CaCl2+ZGGR-AMC开始。凝血酶生成的测量如Hemker，H.C.，P.Giesen等(2003)“Calibrated automated thrombin generation measurement in clotting plasma(凝血血浆中凝血酶生成的校准的自动测量)”.Pathophysiol Haemost Thromb 33(1)：4-15中所述。添加的3μl HAM不抑制凝血酶的生成。
收集含有LAM的柱级分。用交联葡聚糖(Sephadex)G-25介质将缓冲液转换成碳酸氢铵(pH7.8)并将该级分冻干。对干燥的LAM进行称重并溶解在磷酸盐缓冲盐水中以达到所需的浓度。
实施例3：预防移植物衰竭
我们在肾移植模型中进行了观察，其中我们移植了小鼠肾。我们确定了移植肾发生衰竭的几率增加的条件，然后进行了一个实验，其中向30只小鼠给予每只小鼠每次注射0.1-10mg LAM。一个适当的小鼠对照组没有接受任何治疗，另一个对照组接受相当量的HAM或天然肝素。
观察到接受LAM的组具有较低的移植物衰竭率。
实施例4：各种肝素制剂的抗凝血活性
在具有固定的抗凝血酶的柱上通过亲和层析使未分级肝素(UFH)中的戊糖贫化。未结合的流过物包含戊糖贫化的肝素(LAM)。
按照Yuko Inoue和Kinzo Nagasawa，Carbohydrate Research(1976)46：87-95所述的方法将未分级肝素脱硫。
在内源性凝血酶潜力(ETP)测定法中对脱硫的肝素(DS)、UFH和LAM进行测试以确定它们的抗凝血活性(图2)。我们得出结论：脱硫以及戊糖贫化几乎完全消除了UFH的抗凝血活性，至少降低到低于UFH原始活性的10％的程度。
实施例5：中和组蛋白H3的细胞毒性。
在如Wildhagen等(Blood 2014；123：1098-1101)所述的组蛋白H3细胞毒性测定法中对DS、UFH和LAM进行测试以确定它们对组蛋白H3的细胞毒性的保护活性(图3)。据观察，与未分级肝素相比，在LAM级分中保留了对组蛋白H3细胞毒性的保护作用(未分级肝素活性的100％(图3))，而脱硫肝素显示出保护作用的显著降低(超过50％)。我们得出结论：UFH和LAM中和组蛋白H3细胞毒性的程度相同，而肝素的脱硫(DS)导致丧失中和组蛋白H3细胞毒性的能力。
参考文献
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