本发明提供了一种新的组合，其包括下列成分中的至少两者：(i)胰岛素调节剂、(ii)免疫抑制剂和(iii)醛固酮拮抗剂，例如，包括下列中的至少两者的组合：(i)艾塞那肽(exenatide)，或其功能性衍生物或类似物，或其可药用的盐；(ii)环孢霉素，或其功能性衍生物或类似物，或其可药用的盐；以及(iii)坎利酸钾，或其功能性衍生物或类似物。所述组合适合用于心脏保护和/或用于治疗和/或预防缺血和/或再灌注损伤。
其他方面涉及包含根据本发明所述组合的药物产品和药物组合物，以及使用它们的治疗方法。
背景技术：
急性心肌梗死(ami)是世界范围内死亡和发病的主要原因。仅在美国，每年估计在785,000人(stemi500.000)中就将有一位新的ami患者，并且大约每分钟就有一个美国人将死于此疾病(roger等，circulation，2012，125：e2-e220)。在欧洲，六分之一的男性和七分之一的女性将死于心肌梗死(esc对于st段抬高型急性mi患者的治疗指南，eur.heartj.，2012，33：2569-2619)。
目前，使用血栓溶解疗法或直接经皮冠状动脉介入术(ppci)的及时心肌再灌注是急性st段抬高型心肌梗死(stemi)患者的选择疗法(worner等，revexpcardiol.，2013，66：5-11)。这些介入治疗抑制了心肌梗死(mi)，保留了左心室收缩功能并减少了心力衰竭的发作。
然而，这些患者的死亡率仍然很高，住院死亡率在6％和14％之间(mandelzweig等，eur.heartj.，2006，27：2285-2293)。此外，发病率仍然很高，约5％至6％的患者在30天内发生随后的心血管事件，并且约2.7％的患者在1年后再次住院治疗，心肌梗死是导致慢性心力衰竭的主要原因(lagerqvist等，n.engl.j.med.，2014，371：1111-20)。
矛盾的是，虽然心肌再灌注对心肌挽救至关重要，但为缺血性区域提供氧气和营养物质的代价却很高，因为它本身能够诱发心肌损伤和心肌细胞死亡，这种现象被称为“心肌再灌注损伤”，其不可逆的后果包括微血管阻塞和心肌梗死(yellow和hausenloy，n.engl.j.med.，2007，357：1121-1135)。据估计，缺血再灌注损伤占最终梗死面积的约50％(yetgin等，neth.heartj.，2010；28，389-392)。先前的将用于减少再灌注损伤的心脏保护疗法(即抗氧化剂、钙通道阻断剂和抗炎剂)转化到临床的尝试一直没有成功(frohlich等，eur.heartj.，2013，34：1714-1724)。目前还没有获批准的有效的疗法来预防经再灌注的stemi患者的心肌再灌注损伤，使其成为心脏保护的重要残留靶点。
20世纪90年代的开创性工作首先涉及线粒体通透性转换孔(mptp)作为致死性心肌再灌注损伤的关键介导物。mptp(内线粒体膜的非选择性通道)在再灌注的前几分钟打开，从而导致线粒体的ca2+超载、氧化应激、生理ph恢复并消耗atp(heusch等，basicrescardiol，2010，105：151-154)。这些事件通过解偶联氧化磷酸化来诱导心肌细胞死亡。
自由基对膜蛋白的改变是心肌再灌注损伤进展的重要因素之一。大量的活性氧物质(ros)导致细胞内源性抗氧化防御的绝对优势。除其他效应之外，这导致脂质膜的过氧化和膜完整性的丧失，从而导致坏死和细胞死亡(zweier和talukder，cardiovascres，2006，70：181-190)。在再灌注开始时重新引入大量的氧气会在回流的前几分钟内引发一系列额外的毒性氧衍生物，包括超氧阴离子、羟基自由基和过氧亚硝酸盐。而且，氧化应激还会降低再灌注时一氧化氮(血管舒张剂化合物)的生物利用度，并且no供体的施用在动物模型中具有心脏保护作用。
目前存在对有效治疗再灌注损伤、特别是心肌再灌注损伤的需求。
技术实现要素：
本发明提供了具有心脏保护性并适合用于预防和/或治疗再灌注损伤的新的组合。与使用单一活性药物制剂的治疗方法相比，本发明的组合和其他方面提供了更有效的治疗方法，并且提供了卓越的临床结果。
第一方面涉及一种组合，其包括下列成分中的至少两者：(i)胰岛素调节剂、(ii)免疫抑制剂和(iii)醛固酮拮抗剂。
第二方面涉及一种组合，其包括下列成分中的至少两者：(i)艾塞那肽，或功能性衍生物或类似物，或它们的可药用的盐；(ii)环孢霉素，或功能性衍生物或类似物，或它们的可药用的盐；以及(iii)坎利酸钾，或其功能性衍生物或类似物。
第三方面涉及一种药物组合物，其包括下列成分中的至少两者：(i)胰岛素调节剂、(ii)免疫抑制剂和(iii)醛固酮拮抗剂。
第四方面涉及一种药物组合物，其包含可药用的载体、稀释剂或赋形剂以及下列成分中的至少两者：(i)艾塞那肽，或功能性衍生物或类似物，或它们的可药用的盐；(ii)环孢霉素，或功能性衍生物或类似物，或它们的可药用的盐；以及(iii)坎利酸钾，或其功能性衍生物或类似物。
第五方面涉及一种药物产品，其包括下列成分中的至少两者：(i)胰岛素调节剂、(ii)免疫抑制剂和(iii)醛固酮拮抗剂。
第六方面涉及药物产品，其包括下列成分中的至少两者：(i)艾塞那肽，或功能性衍生物或类似物，或它们的可药用的盐；(ii)环孢霉素，或功能性衍生物或类似物，或它们的可药用的盐，以及(iii)坎利酸钾，或其功能性衍生物或类似物。
第七方面涉及如上定义的组合或药物组合物用于治疗和/或预防缺血和/或再灌注损伤、缺血性卒中、心脏骤停、急性心肌梗死、新生儿窒息和心源性休克中的一种或多种的应用，或用于针对心脏毒性药物而提供心脏保护的应用。
第八方面涉及如上定义的药物产品用于治疗和/或预防缺血和/或再灌注损伤、缺血性卒中、心脏骤停、急性心肌梗死、新生儿窒息和心源性休克中的一种或多种的应用，或用于针对心脏毒性药物而提供心脏保护的应用，其中所述成分用于同时、依次或单独施用。
第九方面涉及一种用于治疗和/或预防缺血和/或再灌注损伤、缺血性卒中、心脏骤停、急性心肌梗死、新生儿窒息和心源性休克中的一种或多种的方法，或针对心脏毒性药物而提供心脏保护的方法，所述方法包括同时、依次或单独将下列成分中的至少两者施用于有此需要的受试者：(i)胰岛素调节剂、(ii)免疫抑制剂和(iii)醛固酮拮抗剂。
第十方面涉及一种用于治疗和/或预防缺血和/或再灌注损伤、缺血性卒中、心脏骤停、急性心肌梗死、新生儿窒息和心源性休克中的一种或多种的方法，或针对心脏毒性药物而提供心脏保护的方法，所述方法包括同时、依次或单独将下列成分中的至少两者施用于有此需要的受试者：(i)艾塞那肽，或功能性衍生物或类似物，或它们的可药用的盐；(ii)环孢霉素，或功能性衍生物或类似物，或它们的可药用的盐，以及(iii)坎利酸钾，或其功能性衍生物或类似物。
第十一方面涉及下列成分中的至少两者在制造用于治疗和/或预防缺血和/或再灌注损伤、缺血性卒中、心脏骤停、急性心肌梗死、新生儿窒息和心源性休克中的一种或多种的药物中的应用，或用于针对心脏毒性药物而提供心脏保护的药物中的应用：(i)胰岛素调节剂、(ii)免疫抑制剂和(iii)醛固酮拮抗剂。
第十二方面涉及下列成分中的至少两者在制造用于治疗和/或预防缺血和/或再灌注损伤、缺血性卒中、心脏骤停、急性心肌梗死、新生儿窒息和心源性休克中的一种或多种的药物中的应用，或用于针对心脏毒性药物而提供心脏保护的药物中的应用：(i)艾塞那肽，或功能性衍生物或类似物，或它们的可药用的盐；(ii)环孢霉素，或功能性衍生物或类似物，或它们的可药用的盐，以及(iii)坎利酸钾，或其功能性衍生物或类似物。
第十三方面涉及一种组合用于在移植之前或移植期间治疗和/或预防离体器官的缺血和/或再灌注损伤中的应用，所述组合包括下列成分中的至少两者：(i)胰岛素调节剂、(ii)免疫抑制剂和(iii)醛固酮拮抗剂。
第十四方面涉及一种组合用于在移植之前或移植期间治疗和/或预防离体器官的缺血和/或再灌注损伤中的应用，所述组合包括下列成分中的至少两者：(i)艾塞那肽，或功能性衍生物或类似物，或它们的可药用的盐；(ii)环孢霉素，或功能性衍生物或类似物，或它们的可药用的盐，以及(iii)坎利酸钾，或其功能性衍生物或类似物。
发明详述
以下列出的优选实施方案适用于本发明上述方面的任何一者，视情况而定。
胰岛素调节剂
在一个实施方案中，本发明的组合包含胰岛素调节剂。
如本文所用，术语“胰岛素调节剂”是指能够直接或间接地提高或降低胰岛素活性，继而可以增加或减少胰岛素介导的生理反应的药剂。
在一个优选方面，组合、方法、组合物和应用包含作为基本特征的胰岛素调节剂。
在一个实施方案中，胰岛素调节剂可以选自glp-1激动剂、dpp-4抑制剂、ppar激动剂、胰岛素及其类似物。
glp-1激动剂的实例包括艾塞那肽、利西拉肽、阿必鲁肽、利拉鲁肽、他司鲁肽和杜拉鲁肽(ly2189265)以及它们的可药用的盐。
dpp-4抑制剂的实例包括西他列汀、维格列汀、沙格列汀、利格列汀、阿拉格列汀、特力利汀、阿格列汀、曲格列汀、吉格列汀、杜拓格列汀和奥格列汀(mk-3102)以及它们的可药用的盐。
ppar激动剂的实例包括氯贝丁酯、吉非贝齐、环丙贝特、苯扎贝特、非诺贝特、萨格列扎、阿格列扎、莫格他唑和替格列扎以及它们的可药用的盐。
胰岛素类似物的实例包括赖脯胰岛素、门冬胰岛素、赖谷胰岛素、地特胰岛素、德谷胰岛素、甘精胰岛素以及它们的可药用的盐。
因此，在一个实施方案中，胰岛素调节剂可以选自艾塞那肽、利西拉肽、阿必鲁肽、利拉鲁肽、他司鲁肽、杜拉鲁肽(ly2189265)、西他列汀、维格列汀、沙格列汀、利格列汀、阿拉格列汀、特力利汀、阿格列汀、曲格列汀、吉格列汀、杜拓格列汀、奥格列汀(mk-3102)、氯贝丁酯、吉非贝齐、环丙贝特、苯扎贝特、非诺贝特、萨格列扎、阿格列扎、莫格他唑、替格列扎、赖脯胰岛素、门冬胰岛素、赖谷胰岛素、地特胰岛素、德谷胰岛素、甘精胰岛素以及它们的可药用的盐。
在一个实施方案中，胰岛素调节剂为选自艾塞那肽、利西拉肽、阿必鲁肽、利拉鲁肽、他司鲁肽、杜拉鲁肽(ly2189265)以及它们的可药用的盐的glp-1激动剂。glp-1激动剂优选为艾塞那肽。
艾塞那肽
在一个优选的实施方案中，胰岛素调节剂选自艾塞那肽及其功能性衍生物和类似物，及其可药用的盐。
如本文所用，术语“艾塞那肽”是指具有以下序列的39个氨基酸的肽：
h-his-gly-glu-gly-thr-phe-thr-ser-asp-leu-ser-lys-gln-met-glu-glu-glu-ala-val-arg-leu-phe-ile-glu-trp-leu-lys-asn-gly-gly-pro-ser-ser-gly-ala-pro-pro-pro-ser-nh2
艾塞那肽(同义词为毒蜥外泌肽4)最初是在1992年由eng从希拉毒蜥(helodermasuspectum)的唾液中分离出来的。它是一种具有类似于人胰高血糖素样肽-1(glp-1)的葡萄糖调节作用的胰岛素促分泌素。
艾塞那肽模拟人胰高血糖素样肽1(glp-1)，一种响应于营养素摄入而释放的肠道肠降血糖素激素(goke等，j.biol.chem.，1993，268：19650-19655)。它通过glp-1受体而发挥促胰岛素性能和胰岛素模拟性能。glp-1受体广泛表达于许多器官中，包括心脏和血管内皮(bullock等，endocrinology，1996，137：2968-2978；nystrom等，amjphysiolendocrinolmetab，2004，287：e1209-e1215)。目前，艾塞那肽已被批准为抗糖尿病药物，用于罹患2型糖尿病的患者的治疗。该适应症的推荐剂量为起始剂量每次5μg(mcg)，每日两次，1个月后根据临床反应增加至每次10μg，每日两次。
glp-1作为治疗剂是无效的，因为其由于二肽基肽酶-4的快速降解而具有非常短的循环半衰期(不到2分钟)。艾塞那肽与glp-1具有50％的同源性，但由于不存在二肽基肽酶-4切割位点，因此在人体中的半衰期为2.4小时。
艾塞那肽通过胰腺β-细胞来增强葡萄糖依赖性胰岛素分泌，从而抑制不适当地升高的胰高血糖素分泌并减缓胃排空。艾塞那肽非常有效，在人体内的最低有效浓度为50pg/ml(12pm)。当前使用艾塞那肽的治疗方法涉及每日两次的注射
如本文所用，艾塞那肽的功能性类似物可以指具有相似结构但在某些方面与其不同的化合物(例如，该功能性类似物可能在一个或多个原子、官能团、氨基酸残基或亚结构方面有所不同，它们被其他部分所取代)。功能性类似物表现出相似的药理学性质，并可能在结构上相关。
在一个实施方案中，艾塞那肽的功能性衍生物或类似物为经修饰以便延长半衰期的艾塞那肽的形式，例如艾塞那肽的缀合物。
在一个优选实施方案中，艾塞那肽的功能性衍生物或类似物为peg化的艾塞那肽。例如，在一个优选实施方案中，功能性衍生物或类似物为具有40kda的peg单peg化的艾塞那肽。可以通过本领域的已知方法来制备peg化的艾塞那肽。举例来说，在wo2013/059323(prolynxllc)中描述了艾塞那肽的peg化形式。艾塞那肽还可以与其他分子缀合，例如蛋白质。
在一个特别优选的实施方案中，艾塞那肽的功能性衍生物或类似物为缓释形式，例如以商品名
在另一个特别优选的实施方案中，艾塞那肽为可注射形式，如以商品名
如本文所用，艾塞那肽的功能性衍生物或类似物可以指glp受体激动剂。合适的艾塞那肽功能性衍生物或类似物包括利西拉肽、阿必鲁肽、利拉鲁肽、他司鲁肽和杜拉鲁肽(ly2189265)。
在一个实施方案中，艾塞那肽的功能性类似物指经修饰的艾塞那肽，其中将一个或多个氨基酸残基替换为另一个氨基酸残基和/或其中使一个或多个氨基酸残基缺失和/或其中添加和/或插入一个或多个氨基酸残基。
在一个实施方案中，相对于艾塞那肽，功能性艾塞那肽类似物包括小于10个氨基酸修饰(替换、缺失、添加(包括插入)以及它们的任意组合)，或者相对于艾塞那肽，包含小于9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个或2个修饰。
在一个实施方案中，相对于艾塞那肽，功能性艾塞那肽类似物包括10个氨基酸修饰(替换、缺失、添加(包括插入)以及它们的任意组合)，或者相对于艾塞那肽，包含9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个或2个修饰。
如本文所用，艾塞那肽的功能性衍生物包括其盐、同分异构体、对映异构体、溶剂化物、多晶型物、前药和代谢物。
免疫抑制剂
在一个实施方案中，本发明的组合包含免疫抑制剂。
如本文所用，术语“免疫抑制剂”是指能够部分地或完全地抑制受试者体内的免疫应答的药剂。
在一个实施方案中，免疫抑制剂选自糖皮质激素、细胞生长抑制剂、细胞因子(例如干扰素、白细胞介素、趋化因子)、免疫抑制抗体、钙调神经磷酸酶抑制剂和tnf结合蛋白。
在一个实施方案中，免疫抑制剂选自抗代谢物、钙调神经磷酸酶抑制剂和tnf结合蛋白。
抗代谢物的实例包括甲氨蝶呤、硫唑嘌呤、巯嘌呤和氟尿嘧啶，以及它们的可药用的盐。
钙调神经磷酸酶抑制剂的实例包括环孢霉素、环孢霉素g、n-甲基-4-异亮氨酸环孢霉素(又名nim811)、他克莫司和吡美莫司，以及它们的可药用的盐。
tnf结合蛋白的实例包括英夫利昔单抗、依那西普和阿达木单抗，以及它们的可药用的盐。
因此，在一个实施方案中，免疫抑制剂选自甲氨蝶呤、硫唑嘌呤、巯嘌呤、氟尿嘧啶、环孢霉素、环孢霉素g、n-甲基-4-异亮氨酸环孢素(又名nim811)、他克莫司、吡美莫司、英夫利昔单抗、依那西普和阿达木单抗，以及它们的可药用的盐。
在一个实施方案中，免疫抑制剂为钙调神经磷酸酶抑制剂。在一个实施方案中，钙调神经磷酸酶抑制剂选自环孢霉素、环孢霉素g、n-甲基-4-异亮氨酸环孢霉素(又名nim811)、他克莫司和吡美莫司，以及它们的可药用的盐。优选地，钙调神经磷酸酶抑制剂为环孢霉素。
在另一个实施方案中，钙调神经磷酸酶抑制剂选自环孢霉素、环孢霉素g和n-甲基-4-异亮氨酸环孢霉素(又名nim811)，以及它们的可药用的盐。
在另一个实施方案中，钙调神经磷酸酶抑制剂为环孢霉素，或其功能性衍生物或类似物，或其可药用的盐。
本发明还包含上述免疫抑制剂的功能性衍生物和类似物，特别是那些经修饰以便延长药剂半衰期的药剂，例如药剂的缀合物。
环孢霉素
如本文所用，术语“环孢霉素”或“环孢菌素”(又名环孢霉素a)是指天然多孔木霉(tolypocladiuminflatum)的环状非核糖体肽，系统(iupac)名称为：(3s,6s,9s,12r,15s,18s,21s,24s,30s,33s)-30-乙基-33-[(1r,2r,4e)-1-羟基-2-甲基-4-己烯-1-基]-6,9,18,24-四异丁基-3,21-二异丙基-1,4,7,10,12,15,19,25,28-九甲基-1,4,7,10,13,16,19,22,25,28,31-十一氮杂环三十三烷基-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32-十一烷。
环孢霉素是广泛用于预防同种异体移植后的器官排斥反应的免疫抑制剂。对于此适应症，该适应症的推荐iv剂量为初始5mg/kg/天至6mg/kg/天。尽管对肾脏结构和功能有不利影响，它仍然是控制器官移植的重要工具。环孢霉素在治疗牛皮癣、过敏性皮炎、坏疽性脓皮病、慢性自身免疫性荨麻疹和类风湿性关节炎方面也有一定疗效。在这些适应症中，推荐的口服初始剂量为2.5mg/kg/天，每天分为两次施用。然而，由于与药物相关的高度毒性，环孢霉素通常适用于这些情况的重症病例。对于移植患者，通常只是间歇性或周期性施用环孢霉素，并密切监测肾功能。
在一个实施方案中，本发明涉及环孢霉素的功能性衍生物或类似物。在一个实施方案中，环孢霉素的功能性衍生物或类似物是经修饰以便延长半衰期的环孢霉素的形式，例如环孢霉素的缀合物。
如本文所用的环孢霉素的功能性衍生物包括其盐、同分异构体、对映异构体、溶剂化物、多晶型物、前药和代谢物。
如本文所用的环孢霉素的功能性类似物可以指具有相似结构但在某些方面与其不同的化合物(例如，该功能性类似物可能在一个或多个原子、官能团、氨基酸残基或亚结构方面有所不同，它们被其他部分所取代)。功能类似物表现出相似的药理学性质，并可能在结构上相关。
在一个实施方案中，环孢霉素的功能性衍生物或类似物选自环孢霉素g、n-甲基-4-异亮氨酸环孢霉素(又名nim811)、他克莫司和吡美莫司，以及它们的可药用的盐。在另一个实施方案中，环孢霉素的功能性衍生物或类似物选自环孢霉素g和n-甲基-4-异亮氨酸环孢霉素(又名nim811)以及它们的可药用的盐。
环孢霉素g在2位氨基酸上不同于环孢霉素a，其中l-正缬氨酸取代了α-氨基丁酸。(通常参见wenger，r.m.1989，synthesisofcyclosporineandanalogues:structuralandconformationalrequirementsforimmunosuppressiveactivity.progressinallergy，38：46-64)。
醛固酮拮抗剂
在一个实施方案中，本发明的组合包括醛固酮拮抗剂。
在一个优选的方面，本发明的组合、方法、组合物和应用包括作为基本特征的醛固酮拮抗剂。
急性心肌梗死及其随后的血液动力学变化导致复杂的神经激素活化作用。肾素-血管紧张素-醛固酮途径是这种神经激素活化作用的基础。据报道，在急性心肌梗死后呈现最高水平的醛固酮会促进广谱的有害心血管作用，包括急性内皮功能障碍、对no活性的抑制、增加的内皮氧化应激、增加的血管紧张度、对组织再获取儿茶酚胺的抑制、血管平滑肌细胞和心肌细胞坏死的快速发生、血管中胶原沉积、心肌肥大和纤维化(struthers，amheartj，2002，144：s2-s7；zannad和radauceanu，heartfailrev，2005，10：71-78)。此外，已经发现可预测其不良后果(beygui等，circulation，2006，114：2604-2610)。
醛固酮拮抗剂或抗盐皮质激素为拮抗醛固酮对盐皮质激素受体的作用的利尿剂。这组药物经常用于治疗慢性心力衰竭。此类成员还用于治疗醛固酮过多症(包括conn综合征)和女性多毛症(由于额外的抗雄激素作用)。大多数抗盐皮质激素为甾体类螺内酯。
盐皮质激素受体的拮抗作用抑制了肾脏中肾单位的集合管中钠的再吸收。这干扰了钠/钾交换，从而降低了尿钾排泄并稍微提高了水排泄(利尿)。在充血性心力衰竭中，除其他药物之外，还使用醛固酮拮抗剂用于附加的利尿作用，从而减轻水肿和心脏负荷。
根据ephesus试验的结果，目前的指南推荐对心肌梗死后出现心力衰竭的患者使用盐皮质激素受体拮抗剂。
对于急性心肌梗死的动物模型和临床的几项研究表明了醛固酮阻断对于stemi患者的再灌注损伤的预防和改善心功能方面的益处。
醛固酮拮抗剂的实例包括螺内酯(此类中第一个也是使用最广泛的成员)、依普利酮(对靶标的选择性比螺内酯更强，但不那么有力和有效)、坎利酮和坎利酸钾、非奈利酮(非甾体类并且比依普利酮或螺内酯的有效性和选择性更好)和丙利酮(prorenone)。
在一个特别优选的实施方案中，醛固酮拮抗剂为坎利酸钾。
一些药物除了它们的主要作用机制之外，还具有次要的抗盐皮质激素作用。实例包括黄体酮、屈螺酮、孕二烯酮和贝尼地平。
本发明还包括醛固酮拮抗剂的功能性衍生物和类似物，特别是那些经修饰以便延长药剂半衰期的药剂，例如醛固酮拮抗剂的缀合物。
坎利酸钾
坎利酸钾或烯睾丙酸钾又名坎利酸的钾盐，其为螺内酯组的醛固酮拮抗剂。如同螺内酯，它是一种前体药物，在体内被代谢为坎利酮。通常以200mg/天至600mg/天的剂量静脉内给予坎利酸钾用于治疗醛固酮过多症或低钾血症。
坎利酸钾的系统(iupac)名称为3-[(8r,9s,10r,13s,14s,17r)-17-羟基-10,13-二甲基-3-氧-2,8,9,11,12,14,15,16八氢-1h-环戊并[a]菲-17-基]丙酸钾，分子式为c22h29ko4并且化学结构如下：
本发明还包括坎利酸钾的功能性衍生物和类似物，特别是那些经修饰以便延长药剂半衰期的药剂，例如坎利酸钾的缀合物。
组合
一方面，本发明涉及一种组合，其包括下列成分中的至少两者：(i)胰岛素调节剂、(ii)免疫抑制剂和(iii)醛固酮拮抗剂。
以下描述的优选实施方案在加以必要的修改后适用于本发明的其他方面，包括方法、应用、产品和组合物。
在一个高度优选的实施方案中，所述组合包括胰岛素调节剂和醛固酮拮抗剂。
在另一个优选实施方案中，所述组合包括胰岛素调节剂和免疫抑制剂。
在另一个实施方案中，所述组合包括免疫抑制剂和醛固酮拮抗剂。
在另一个优选实施方案中，所述组合包括包含(i)胰岛素调节剂、(ii)免疫抑制剂和(iii)醛固酮拮抗剂。
在一个实施方案中，根据胰岛素调节剂的上述任意实施方案来定义胰岛素调节剂。
在一个实施方案中，根据免疫抑制剂的上述任意实施方案来定义免疫抑制剂。
在一个实施方案中，根据醛固酮拮抗剂的上述任意实施方案来定义醛固酮拮抗剂。
另一方面，本发明涉及一种组合，其包括下列成分中的至少两者：(i)艾塞那肽，或功能性衍生物或类似物，或它们的可药用的盐；(ii)环孢霉素，或功能性衍生物或类似物，或它们的可药用的盐和(iii)坎利酸钾，或功能性衍生物或类似物。
在一个实施方案中，本发明涉及一种组合，其包括(i)艾塞那肽，或其功能性衍生物或类似物，或其可药用的盐；以及(iii)坎利酸钾，或其功能性衍生物或类似物。
在一个实施方案中，本发明涉及一种组合，其包括下列成分中的至少两者：(i)艾塞那肽、利西拉肽、阿必鲁肽、利拉鲁肽、他司鲁肽和杜拉鲁肽(ly2189265)或它们的可药用的盐中的至少一者，(ii)环孢霉素a、环孢霉素g、n-甲基-4-异亮氨酸环孢菌素、他克莫司和吡美莫司或它们的可药用的盐中的至少一者以及(iii)坎利酸钾、坎利酮、螺内酯、依普利酮、非奈利酮和丙利酮或它们的可药用的盐中的至少一者，视情况而定(例如，坎利酮、螺内酯、依普利酮、非奈利酮和丙利酮的可药用的盐)。
在一个实施方案中，本发明涉及一种组合，其包括(i)艾塞那肽、利西拉肽、阿必鲁肽、利拉鲁肽、他司鲁肽和杜拉鲁肽(ly2189265)或它们的可药用的盐中的至少一者，以及(iii)坎利酸钾、坎利酮、螺内酯、依普利酮、非奈利酮和丙利酮或它们的可药用的盐中的至少一者，视情况而定。
在一个实施方案中，本发明涉及一种组合，其包括下列成分中的至少两者：(i)艾塞那肽、利西拉肽、阿必鲁肽、利拉鲁肽、他司鲁肽和杜拉鲁肽(ly2189265)或它们的可药用的盐中的至少一者，(ii)环孢霉素a、环孢霉素g和n-甲基-4-异亮氨酸环孢霉素或它们的可药用的盐中的至少一者以及(iii)坎利酸钾、坎利酮、螺内酯、依普利酮、非奈利酮和丙利酮或它们的可药用的盐中的至少一者，视情况而定。
在一个实施方案中，本发明涉及下列的组合：(i)艾塞那肽或其可药用的盐，以及(ii)环孢霉素a、环孢霉素g、n-甲基-4-异亮氨酸环孢霉素、他克莫司和吡美莫司或它们的可药用的盐中的至少一者。
在一个实施方案中，本发明涉及下列物质的组合：(i)艾塞那肽或其可药用的盐，(ii)环孢霉素a、环孢霉素g和n-甲基-4-异亮氨酸环孢霉素或它们的可药用的盐中的至少一者。
在一个实施方案中，本发明涉及下列物质的组合：(i)艾塞那肽、利西拉肽、阿必鲁肽、利拉鲁肽、他司鲁肽和度拉鲁肽(ly2189265)或它们的可药用的盐中的至少一者，以及(ii)环孢霉素a或其可药用的盐。
在一个实施方案中，本发明涉及下列物质的组合：(i)艾塞那肽或其可药用的盐，(ii)环孢霉素a或其可药用的盐，以及(iii)坎利酸钾。
药物组合的效果本质上是不可预知的，并且经常存在一种药物部分地或完全地抑制另一种药物的效果的倾向。本发明证明了当同时、单独或依次施用包含下列物质中的至少两者的组合时，不会导致两种药剂之间的任何显著的或巨大的不利相互作用：(i)胰岛素调节剂(如艾塞那肽或其功能性衍生物或类似物或可药用的盐)，(ii)免疫抑制剂(如环孢霉素或其功能性衍生物或类似物或可药用的盐)，以及(iii)醛固酮拮抗剂(如坎利酸钾或功能性衍生物或类似物)。出人意料地不产生任何此类拮抗性相互作用对于组合的临床应用至关重要。
此外，根据本发明的优选组合令人惊讶地表现出各组分的效果的增强作用，从而使得药剂的最佳剂量低于这些药剂在批准的适应症中的推荐剂量，和/或也低于(除坎利酸钾之外的所有的情况下)文献报道的用于再灌注损伤的剂量。
在一个实施方案中，相比于单独施用各药物，本发明的活性剂的组合(参见上文(i)、(ii)和(iii))产生了增强的效果。
此外，在另一个实施方案中，本发明的活性剂的组合(参见上文(i)、(ii)和(iii))(例如)在治疗和/或预防再灌注损伤，特别是心肌再灌注损伤中，产生了出人意料的协同效应。
两种或更多种药物的组合可能导致不同类型的药物相互作用。当两种药物的联合效果等于单独给予各药剂的效果的总和时，药物相互作用被认为是叠加的。如果两种药物的联合效果超过单独给予各药剂的总效果，则药物相互作用被认为是协同的(goodman和gilmans的“thepharmacologicalbasisoftherapeutics”，第12版)。
联合治疗是许多疾病情况(包括心血管疾病、癌症和传染病)的重要治疗方式。最近的科学进展加深了我们对于这些和其他复杂疾病背后的病理生理过程的理解。这种加深的理解为开发新的治疗方法提供了进一步的推动力，所述新的治疗方法使用针对多种治疗靶点的药物的组合以改善治疗响应，使抗性的发展最小化，或使不良事件最小化。在联合治疗提供显著治疗优势的情况下，人们对两种或更多种药物的新组合的开发越来越感兴趣。
有利的是，协同组合可以使各成分以较低剂量存在，由此降低治疗的毒性，同时产生和/或维持相同的治疗效果或增强的治疗效果。因此，在特别优选的实施方案中，各成分以亚治疗量存在。
术语“亚治疗有效量”是指这样的量，其低于单独使用各药剂的治疗所产生的治疗效果通常所需的量。
在一个实施方案中，本发明涉及一种协同组合，其包括(i)胰岛素调节剂和(iii)醛固酮拮抗剂。
在一个实施方案中，根据胰岛素调节剂的上述任意实施方案来定义胰岛素调节剂。
在一个实施方案中，根据醛固酮拮抗剂的上述任意实施方案来定义醛固酮拮抗剂。
在一个实施方案中，本发明涉及下列物质的协同组合：(i)艾塞那肽、利西拉肽、阿必鲁肽、利拉鲁肽、他司鲁肽和度拉鲁肽(ly2189265)或它们的可药用的盐中的至少一者，以及(iii)坎利酸钾、坎利酮、螺内酯、依普利酮、非奈利酮和丙烯酮或它们的可药用的盐中的至少一者，视情况而定。
在一个实施方案中，本发明涉及下列物质的协同组合：(i)艾塞那肽或其可药用的盐和(iii)坎利酸钾。
在一个实施方案中，本发明涉及下列物质的协同组合：(i)艾塞那肽、利西拉肽、阿必鲁肽、利拉鲁肽、他司鲁肽和度拉鲁肽(ly2189265)或它们的可药用的盐中的至少一者，以及(iii)坎利酸钾。
其他活性药物成分
在一个实施方案中，上述组合包含至少一种其他活性药物成分(api)。
在一个实施方案中，上述组合可以进一步包含选自下列物质的至少一种其他api：β阻滞剂、肾素-血管紧张素抑制剂、他汀(hmg-coa还原酶抑制剂)、血小板激活或聚集抑制剂、磷酸二酯酶-3抑制剂、钙增敏剂、抗氧化剂和抗炎剂。
β-阻滞剂的实例包括普萘洛尔、美托洛尔、布新洛尔、卡替洛尔、卡维地洛、拉贝洛尔、纳多洛尔、氧烯洛尓、喷布洛尔、吲哚洛尔、索他洛尔和噻吗洛尔。
肾素-血管紧张素抑制剂包括血管紧张素转换酶抑制剂、血管紧张素at1受体抑制剂和肾素抑制剂。
血管紧张素转换酶抑制剂的实例包括卡托普利、佐芬普利、依那普利、雷米普利、喹那普利、培哚普利、赖诺普利、贝那普利、咪达普利、群多普利、西拉普利和福辛普利。
血管紧张素at1受体拮抗剂的实例包括氯沙坦、厄贝沙坦、奥美沙坦、坎地沙坦、缬沙坦、非马沙坦和替米沙坦。
肾素抑制剂的实例包括雷米克仑和阿利克仑。
钙增敏剂的实例包括左西孟旦及其类似物。
他汀类药物的实例包括阿托伐他汀、洛伐他汀、普伐他汀、罗苏伐他汀和辛伐他汀。
血小板激活或聚集抑制剂的实例包括前列环素(依前列醇)及其类似物和衍生物(例如曲前列环素、伊洛前列素)、不可逆环加氧酶抑制剂(例如阿司匹林、三氟柳)、二磷酸腺苷(adp)受体抑制剂(例如氯吡格雷、普拉格雷、替卡格雷、噻氯匹定)、磷酸二酯酶抑制剂(例如西洛他唑)、蛋白酶激活受体-1(par-1)拮抗剂(例如沃拉帕沙)、糖蛋白iib/iiia抑制剂(例如阿昔单抗、依替巴肽、替罗非班)、腺苷再摄取抑制剂(例如双嘧达莫)以及血栓烷抑制剂，包括血栓素合成酶抑制剂和血栓素受体拮抗剂(例如特鲁曲班)。
磷酸二酯酶-3(pde-3)抑制剂的实例包括氨力农、米力农及其类似物。
抗氧化剂的实例包括抗坏血酸、硫辛酸、谷胱甘肽和褪黑激素。
抗炎剂的实例包括cox-2抑制剂(例如塞来昔布)、糖皮质激素(例如氢化可的松)和非甾体抗炎药(例如布洛芬)。
在一个实施方案中，上述组合包括至少一种选自下列物质的其他api：普萘洛尔、美托洛尔、布新洛尔、卡替洛尔、卡维地洛、拉贝洛尔、纳多洛尔、氧烯洛尓、喷布洛尔、吲哚洛尔、索他洛尔、噻吗洛尔、卡托普利、佐芬普利、依那普利、雷米普利、喹那普利、培哚普利、赖诺普利、贝那普利、咪达普利、群多普利、西拉普利、福辛普利、氯沙坦、厄贝沙坦、奥美沙坦、坎地沙坦、缬沙坦、非马沙坦、替米沙坦、雷米克仑和阿利克仑。
在另一个实施方案中，上述组合包括至少一种选自下列物质的其他api：卡维地洛、美托洛尔、氯沙坦、厄贝沙坦、奥美沙坦、坎地沙坦、缬沙坦、非马沙坦、替米沙坦、卡托普利、佐芬普利、依那普利、雷米普利、喹那普利、培哚普利、赖诺普利、贝那普利、咪达普利、群多普利、西拉普利、福辛普利、雷米克仑和阿利克仑。
在另一个实施方案中，上述组合包括至少一种选自卡维地洛和美托洛尔的其他api。
可药用的盐
本发明的活性药物制剂可以以可药用的盐的形式存在。
本发明的药剂的可药用的盐包括其合适的酸加成盐或碱盐。对合适的药用盐的综述可以参考berge等，jpharmsci，66，1-19(1977)。盐是用(例如)下列酸形成的：强无机酸，如矿物酸，例如硫酸、磷酸或氢卤酸；强有机羧酸，如具有1至4个碳原子的未取代或取代(例如，被卤素取代)的链烷羧酸，如乙酸；饱和或不饱和二羧酸，例如草酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、邻苯二甲酸或四邻苯二甲酸；羟基羧酸，例如抗坏血酸、乙醇酸、乳酸、苹果酸、酒石酸或柠檬酸；氨基酸，例如天冬氨酸或谷氨酸；苯甲酸；或有机磺酸，如未取代或取代(例如，被卤素取代)的(c1-c4)-烷基磺酸或芳基磺酸，如甲磺酸或对甲苯磺酸。
对映异构体/互变异构体
本发明还适当地包括活性药物制剂的全部对映异构体和互变异构体。本领域技术人员将会识别出具有光学性质(一个或多个手性碳原子)或互变异构特性的化合物。可以通过本领域已知的方法分离/制备相应的对映异构体和/或互变异构体。
立体和几何异构体
本发明的一些活性剂药物制剂可以以立体异构体和/或几何异构体的形式存在，它们可能具有一个或更多个不对称中心和/或几何中心，因此可以两个或更多个立体异构和/或几何异构的形式存在。本发明涵盖那些抑制剂的所有单独的立体异构体和几何异构体，以及它们的混合物的应用。权利要求中所使用的术语包括这些形式，条件是所述形式保持了合适的功能活性(虽然不必具有相同程度)。
本发明还包括活性药物制剂或其可药用盐的所有合适的同位素变型。本发明的制剂或其可药用盐的同位素变型被定义为这样的情况：至少一个原子被具有相同原子序数但原子量与通常在自然界中所发现的原子量不同的原子替代。能够引入药剂及其可药用盐的同位素的例子包括氢、碳、氮、氧、磷、硫、氟和氯的同位素，例如它们分别为2h、3h、13c、14c、15n、17o、18o、31p、32p、35s、18f和36cl。药剂及其可药用盐的某些同位素变型在药物和/或基底组织分布研究中是有用的，例如那些引入放射性同位素(例如3h或14c)的同位素变型。对于容易制备和检测而言，氚(即3h)和碳-14(即14c)同位素是特别优选的。此外，利用同位素(例如氘，即2h)进行置换可以提供一定程度的治疗优势，这归因于其具有更大的代谢稳定性，例如体内半衰期的延长或剂量需求的减少，因此其在某些情况下可能是优选的。通常，可以通过常规方法采用合适药剂的适当同位素变型来制备本发明药剂和其可药用盐的同位素变型。
溶剂化物
本发明还包括本发明的活性药物制剂的溶剂化物形式。权利要求中使用的术语包括这些形式。
多晶型物
本发明还涉及以它们各种结晶形式、多晶形式和无水/水合形式存在的本发明的活性药物制剂。制药领域中已经很好地建立起这样的方法：通过稍微改变用于合成制备所述化合物的纯化方法和/或溶剂的分离形式，可以分离处于任何所述形式的化合物。
药物组合物
另一方面，本发明涉及包含这样的组合的药物组合物，所述组合包括下列成分中的至少两者：(i)胰岛素调节剂、(ii)免疫抑制剂和(iii)醛固酮拮抗剂；以及可药用的载体、稀释剂或赋形剂。
另一方面，本发明涉及包含组合的药物组合物，所述组合包括可药用的载体、稀释剂或赋形剂以及下列成分中的至少两者：(i)艾塞那肽，或功能性衍生物或类似物，或它们的可药用的盐；(ii)环孢霉素，或功能性衍生物或类似物，或它们的可药用的盐和(iii)坎利酸钾，或功能性衍生物或类似物。
虽然本发明的化合物(包括它们的可药用的盐)可以单独施用，但它们通常与药物载体、赋形剂或稀释剂混合施用，特别是用于人类治疗。药物组合物可以分别用于人类医学或兽医学中的人类或非人类动物应用。
用于本文所述的各种不同形式的药物组合物的这些合适的赋形剂的实例可以见于由awade和pjweller所编的“handbookofpharmaceuticalexcipients”，第2版，(1994)。
能够用于治疗应用的可接受的载体或稀释剂在制药领域是众所周知的，并且(例如)在remington'spharmaceuticalsciences，mackpublishingco.(a.r.gennaro编辑，1985)中进行描述。
药物载体、赋形剂或稀释剂的选择可以根据预期的施应用径和标准药物惯例进行选择。施应用径的实例包括肠胃外(例如，静脉内、肌内、皮内、腹膜内或皮下)、口服、吸入、经皮(局部)、眼内、离子电渗和经粘膜施用。
在一个实施方案中，药物组合物用于肠胃外施用(例如，静脉内、动脉内、鞘内、肌内、皮内、腹膜内或皮下)。优选地，由无菌或可灭菌溶液制备组合物。
在另一个实施方案中，所述药物组合物用于静脉内、肌内或皮下施用。
在另一个实施方案中，所述药物组合物用于静脉内施用。
用于肠胃外、皮内或皮下施用的溶液或悬浮液可以包含下列成分：无菌稀释剂，如注射用水、盐水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗菌剂，如苄醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，如乙二胺四乙酸；缓冲剂，如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，以及渗透压调节剂，如氯化钠或葡萄糖。可以用酸或碱(如盐酸或氢氧化钠)来调节ph。
适合于注射应用的药物组合物可以包括无菌水溶液(在水溶性的情况下)或分散体以及用于临时配制无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。对于静脉内施用，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、cremophoreltm或磷酸盐缓冲盐水(pbs)。在所有的情况下，用于肠胃外施用的组合物必须是无菌的并且应当为达到易于注射程度的流体。在制造和储存条件下应该是稳定的，并且必须防腐以抵抗微生物(如细菌和真菌)的污染作用。
可以通过这样的方法来制备无菌可注射溶液：将所需量的活性化合物与上文列举的一种成分或成分的组合添加到合适的溶剂中，(根据需要)然后过滤灭菌。通常，通过将活性化合物添加到无菌载体中来制备分散体，所述无菌载体含有基础分散介质和来自上文列举的所需的其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，典型的制备方法包括真空干燥和冷冻干燥，这些方法可以从其先前无菌过滤的溶液中产生活性成分加上任何其他所需成分的粉末。本发明还包括包含活性药剂的脂质体和纳米颗粒制剂。这些制剂以及它们的制备方法对于本领域普通技术人员而言是熟悉的。
药物产品
另一方面，本发明涉及一种药物产品，其包括下列成分中的至少两者：(i)胰岛素调节剂、(ii)免疫抑制剂和(iii)醛固酮拮抗剂。
另一方面，本发明涉及一种药物产品，其包括下列成分中的至少两者：(i)艾塞那肽，或功能性衍生物或类似物，或它们的可药用的盐；(ii)环孢霉素，或功能性衍生物或类似物，或它们的可药用的盐和(iii)坎利酸钾，或功能性衍生物或类似物。
在一个实施方案中，所述药物产品为包含用于治疗过程的所有必要设备(例如，药物小瓶、稀释剂小瓶、注射器和针头)的组件套盒。
在一个实施方案中，所述组件套盒包括用于各活性药剂的单独容器。所述容器可以为安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶。
在另一个实施方案中，所述组件套盒包括含有各活性药剂的组合制剂的容器。
所述组件套盒可进一步包含用于治疗和/或预防再灌注损伤的说明书。
医疗应用
一方面，本发明涉及一种组合，其用于治疗和/或预防缺血和/或再灌注损伤、缺血性卒中、心脏骤停、急性心肌梗死、新生儿窒息和心源性休克中的一种或多种，或用于针对心脏毒性药物而提供心脏保护，所述组合包括下列成分中的至少两者：(i)胰岛素调节剂、(ii)免疫抑制剂和(iii)醛固酮拮抗剂。
一方面，本发明涉及一种组合，其用于治疗和/或预防缺血和/或再灌注损伤、缺血性卒中、心脏骤停、急性心肌梗死、新生儿窒息和心源性休克中的一种或多种，或用于针对心脏毒性药物而提供心脏保护，所述组合包括下列成分中的至少两者：(i)艾塞那肽，或功能性衍生物或类似物，或它们的可药用的盐；(ii)环孢霉素，或功能性衍生物或类似物，或它们的可药用的盐；以及(iii)坎利酸钾，或功能性衍生物或类似物。
另一方面，本发明涉及一种包含组合的药物组合物，其用于治疗和/或预防缺血和/或再灌注损伤、缺血性卒中、心脏骤停、急性心肌梗死、新生儿窒息和心源性休克中的一种或多种，或用于针对心脏毒性药物而提供心脏保护，所述组合包括下列成分中的至少两者：(i)胰岛素调节剂、(ii)免疫抑制剂和(iii)醛固酮拮抗剂。
另一方面，本发明涉及一种包含组合的药物组合物，其用于治疗和/或预防缺血和/或再灌注损伤、缺血性卒中、心脏骤停、急性心肌梗死、新生儿窒息和心源性休克中的一种或多种，或用于针对心脏毒性药物而提供心脏保护，所述组合包括下列成分中的至少两者：(i)艾塞那肽，或功能性衍生物或类似物，或它们的可药用的盐；(ii)环孢霉素，或功能性衍生物或类似物，或他们的可药用的盐；以及(iii)坎利酸钾，或功能性衍生物或类似物。
另一方面，本发明涉及一种药物产品，其用于治疗和/或预防缺血和/或再灌注损伤、缺血性卒中、心脏骤停、急性心肌梗死、新生儿窒息和心源性休克中的一种或多种，或用于针对心脏毒性药物而提供心脏保护，所述药物产品包含下列成分中的至少两者：(i)胰岛素调节剂、(ii)免疫抑制剂和(iii)醛固酮拮抗剂，其中所述成分用于同时、依次或单独施用。
另一方面，本发明涉及一种药物产品，其用于治疗和/或预防缺血和/或再灌注损伤、缺血性卒中、心脏骤停、急性心肌梗死、新生儿窒息和心源性休克中的一种或多种，或用于针对心脏毒性药物而提供心脏保护，所述药物产品包含下列成分中的至少两者：(i)艾塞那肽，或功能性衍生物或类似物，或他们的可药用的盐；(ii)环孢霉素，或功能性衍生物或类似物，或它们的可药用的盐以及(iii)坎利酸钾，或功能性衍生物或类似物损伤，其中所述成分用于同时、依次或单独施用。
另一方面，本发明涉及下列成分中的至少两者在制造用于治疗和/或预防缺血和/或再灌注损伤、缺血性卒中、心脏骤停、急性心肌梗死、新生儿窒息和心源性休克中的一种或多种的药物中的应用，或用于针对心脏毒性药物而提供心脏保护的药物中的应用：(i)胰岛素调节剂和(ii)免疫抑制剂和(iii)醛固酮拮抗剂。
另一方面，本发明涉及下列成分中的至少两者在制造用于治疗和/或预防缺血和/或再灌注损伤、缺血性卒中、心脏骤停、急性心肌梗死、新生儿窒息和心源性休克中的一种或多种的药物中的应用，或用于针对心脏毒性药物而提供心脏保护的药物中的应用：(i)艾塞那肽，或功能性衍生物或类似物，或它们的可药用的盐；(ii)环孢霉素，或功能性衍生物或类似物，或它们的可药用的盐以及(iii)坎利酸钾，或其功能性衍生物或类似物。
在一个实施方案中，本发明涉及一种组合，其用于治疗和/或预防再灌注损伤，所述组合包括下列成分中的至少两者：(i)胰岛素调节剂、(ii)免疫抑制剂和(iii)醛固酮拮抗剂。
在一个实施方案中，本发明涉及一种组合，其用于治疗和/或预防再灌注损伤，所述组合包括下列成分中的至少两者：(i)艾塞那肽，或功能性衍生物或类似物，或它们的可药用的盐；(ii)环孢霉素，或功能性衍生物或类似物，或它们的可药用的盐以及(iii)坎利酸钾，或其功能性衍生物或类似物。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种药物组合物，其用于治疗和/或预防再灌注损伤，所述药物组合物包含含有下列成分中的至少两者的组合：(i)胰岛素调节剂、(ii)免疫抑制剂和(iii)醛固酮拮抗剂。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种药物组合物，其用于治疗和/或预防再灌注损伤，所述药物组合物包含含有下列成分中的至少两者的组合：(i)艾塞那肽，或功能性衍生物或类似物，或它们的可药用的盐；(ii)环孢霉素，或功能性衍生物或类似物，或它们的可药用的盐；以及(iii)坎利酸钾，或其功能性衍生物或类似物。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种药物产品，其用于治疗和/或预防的再灌注损伤，所述药物产品包含下列成分中的至少两者：(i)胰岛素调节剂、(ii)免疫抑制剂和(iii)醛固酮拮抗剂，其中所述成分用于同时、依次或单独施用。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种药物产品，其用于治疗和/或预防再灌注损伤，所述药物产品包含下列成分中的至少两者：(i)艾塞那肽，或功能性衍生物或类似物，或它们的可药用的盐；(ii)环孢霉素，或功能性衍生物或类似物，或它们的可药用的盐；以及(iii)坎利酸钾，或其功能性衍生物或类似物，其中所述成分用于同时、依次或单独施用。
在另一个实施方案中，本发明涉及下列成分中的至少两者在制造用于治疗和/或预防再灌注损伤的药物中的应用：(i)胰岛素调节剂、(ii)免疫抑制剂和(iii)醛固酮拮抗剂。
在另一个实施方案中，本发明涉及下列成分中的至少两者在制造用于治疗和/或预防再灌注损伤的药物中的应用：(i)艾塞那肽，或功能性衍生物或类似物，或它们的可药用的盐；(ii)环孢霉素，或功能性衍生物或类似物，或它们的可药用的盐；以及(iii)坎利酸钾，或其功能性衍生物或类似物。
在一个实施方案中，本发明涉及一种组合，其用于治疗和/或预防缺血，所述组合包括下列成分中的至少两者：(i)胰岛素调节剂、(ii)免疫抑制剂和(iii)醛固酮拮抗剂。
在一个实施方案中，本发明涉及一种组合，其用于治疗和/或预防缺血，所述组合包括下列成分中的至少两者：(i)艾塞那肽，或功能性衍生物或类似物，或它们的可药用的盐；(ii)环孢霉素，或功能性衍生物或类似物，或它们的可药用的盐；以及(iii)坎利酸钾，或其功能性衍生物或类似物。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种药物组合物，其用于治疗和/或预防缺血，所述药物组合物包含含有下列成分中的至少两者的组合：(i)胰岛素调节剂、(ii)免疫抑制剂和(iii)醛固酮拮抗剂。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种药物组合物，其用于治疗和/或预防缺血，所述药物组合物包含含有下列成分中的至少两者的组合：(i)艾塞那肽，或功能性衍生物或类似物，或它们的可药用的盐；(ii)环孢霉素，或功能性衍生物或类似物，或它们的可药用的盐；以及(iii)坎利酸钾，或其功能性衍生物或类似物。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种药物产品，其用于治疗和/或预防缺血，所述药物产品包含下列成分中的至少两者：(i)胰岛素调节剂、(ii)免疫抑制剂和(iii)醛固酮拮抗剂，其中所述成分用于同时、依次或单独施用。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种药物产品，其用于治疗和/或预防缺血，所述药物产品包含下列成分中的至少两者：(i)艾塞那肽，或功能性衍生物或类似物，或它们的可药用的盐；(ii)环孢霉素，或功能性衍生物或类似物，或它们的可药用的盐；以及(iii)坎利酸钾，或其功能性衍生物或类似物，其中所述成分用于同时、依次或单独施用。
在另一个实施方案中，本发明涉及下列成分中的至少两者在制造用于治疗和/或预防缺血的药物中的应用：(i)胰岛素调节剂、(ii)免疫抑制剂和(iii)醛固酮拮抗剂。
在另一个实施方案中，本发明涉及下列成分中的至少两者在制造用于治疗和/或预防缺血的药物中的应用：(i)艾塞那肽，或功能性衍生物或类似物，或它们的可药用的盐；(ii)环孢霉素，或功能性衍生物或类似物，或它们的可药用的盐；以及(iii)坎利酸钾，或其功能性衍生物或类似物。
如本文所用，术语“再灌注损伤”是指在缺血期后当血液供应返回组织时造成的组织损伤。血液中缺乏氧气和营养物质会造成这样的情况，其中通过诱导氧化应激，从而循环的恢复导致炎症、线粒体功能障碍和氧化损伤，而不是恢复正常功能。再灌注损伤可以在自发发生事件(例如动脉阻塞)或计划事件(例如多次手术治疗中的任一者)之后发生。心肌再灌注损伤可发生在(例如)心肌梗死之后，或作为心脏移植的结果而发生。
在一个实施方案中，缺血和/或再灌注损伤可以为脑、心脏、肺、肾脏或其他对缺血和/或再灌注损伤敏感的器官/组织的缺血和/或再灌注损伤。
在一个实施方案中，缺血和/或再灌注损伤为心脏的缺血和/或再灌注损伤，优选为心肌缺血和/或心肌再灌注损伤。
胰岛素调节剂、免疫抑制剂和醛固酮拮抗剂可以同时、依次或单独(作为给药方案的一部分)施用。
艾塞那肽或功能性衍生物或类似物或它们的可药用的盐、环孢霉素或功能性衍生物或类似物或它们的可药用的盐以及坎利酸钾或其功能性衍生物或类似物可以同时、依次或单独(作为给药方案的一部分)施用。
如本文所用的“同时”用于表示将两种药剂同时施用。
如本文所用的“依次”用于表示活性药剂不是同时施用，而是一种接一种施用。因此，“依次”施用可允许在一种药剂后5分钟、10分钟或大约几小时内施用另一种药剂，只要第一种施用药剂的循环半衰期能使两者同时以治疗有效量存在即可。各成分的施用之间的时间延迟根据各成分的确切性质、它们之间的相互作用以及它们各自的半衰期而变化。
与“依次”相反，本文中使用“单独”表示施用一种药剂与另一种药剂之间的间隔是明显的，即，当施用第二种药剂时，在血流中可以不再存在治疗有效量的第一种施用药剂。
在一个实施方案中，组合的各成分用于同时施用。
治疗方法
另一方面，本发明涉及一种治疗和/或预防缺血和/或再灌注损伤的方法，所述方法包括同时、依次或单独向受试者施用下列成分中的至少两者：(i)胰岛素调节剂、(ii)免疫抑制剂和(iii)醛固酮拮抗剂。
另一方面，本发明涉及一种治疗和/或预防缺血和/或再灌注损伤的方法，所述方法包括同时、依次或单独向有此需要的受试者施用下列成分中的至少两者：(i)艾塞那肽，或功能性衍生物或类似物，或它们的可药用的盐；(ii)环孢霉素，或功能性衍生物或类似物，或它们的可药用的盐；以及(iii)坎利酸钾，或其功能性衍生物或类似物。
在一个实施方案中，本发明涉及一种治疗和/或预防再灌注损伤的方法，所述方法包括同时、依次或单独向有此需要的受试者施用下列成分中的至少两者：(i)胰岛素调节剂、(ii)免疫抑制剂和(iii)醛固酮拮抗剂。
在一个实施方案中，本发明涉及治疗和/或预防再灌注损伤的方法，所述方法包括同时、依次或单独向有此需要的受试者施用下列成分中的至少两者：(i)艾塞那肽，或功能性衍生物或类似物，或它们的可药用的盐；(ii)环孢霉素，或功能性衍生物或类似物，或它们的可药用的盐；以及(iii)坎利酸钾，或其功能性衍生物或类似物。
在另一个实施方案中，本发明涉及治疗和/或预防缺血的方法，所述方法包括同时、依次或单独向有此需要的受试者施用下列成分中的至少两者：(i)胰岛素调节剂、(ii)免疫抑制剂和(iii)醛固酮拮抗剂。
在另一个实施方案中，本发明涉及治疗和/或预防缺血的方法，所述方法包括同时、依次或单独向有此需要的受试者施用下列成分中的至少两者：(i)艾塞那肽，或功能性衍生物或类似物，或它们的可药用的盐；(ii)环孢霉素，或功能性衍生物或类似物，或它们的可药用的盐；以及(iii)坎利酸钾，或其功能性衍生物或类似物。
在一个实施方案中，所述方法涉及治疗和/或预防脑、心脏、肺、肾脏或其他对缺血和/或再灌注损伤敏感的器官/组织的缺血和/或再灌注损伤。
在一个实施方案中，所述方法涉及治疗和/或预防脑、心脏、肺、肾脏或其他对再灌注损伤敏感的器官/组织的再灌注损伤。
在一个实施方案中，所述方法涉及治疗和/或预防脑、心脏、肺、肾脏或其他对缺血敏感的器官/组织的缺血。
在另一个实施方案中，所述方法涉及治疗和/或预防心脏的缺血和/或再灌注损伤，优选心肌缺血和/或心肌再灌注损伤。
在另一个实施方案中，所述方法涉及治疗和/或预防心脏的再灌注损伤，优选心肌再灌注损伤。
在一个特别优选的实施方案中，所述方法涉及治疗和/或预防急性心肌梗死。急性心肌梗死为再灌注损伤最常见的临床指征之一。
在另一个实施方案中，所述方法涉及治疗和/或预防新生儿窒息。
新生儿窒息(或围产期窒息)是由于新生儿缺乏氧气而造成的医疗症状，其在出生过程中持续足够长的时间从而造成身体损害，通常是对大脑的损害。新生儿窒息最常见的原因是(例如)由于循环或灌注不充分、呼吸困难或通风不充分，从而导致分娩期间产妇血压下降或其他对婴儿脑部血流的干扰。
新生儿窒息会对大部分婴儿的器官(心脏、肺、肝脏、肠道、肾脏)造成缺氧性损伤，但脑损伤是最令人担忧的，并且或许最不可能快速或完全治愈。在更明显的情况下，婴儿会存活下来，但其大脑受损，表现为脑力残疾(如发育迟缓)或智力残疾，或身体残疾(如痉挛)。患有严重围产期窒息的婴儿通常在颜色(发绀)、灌注、反应性、肌肉紧张度和呼吸行为方面较差。重度窒息可导致心脏骤停和死亡。每1000名足月出生的新生儿中就有2到10名出现新生儿窒息，而对于早产新生儿则出现更多的病例。据who估计，每年有400万例新生儿由于出生窒息而死亡，占5岁以下儿童死亡数的38％。
在另一个实施方案中，所述方法涉及治疗和/或预防心脏缺血，优选心肌缺血。
在一个实施方案中，所述受试者为哺乳动物，更优选为人。
在一个实施方案中，所述方法包括将成分经肠胃外(例如，静脉内、肌内、皮内、腹膜内或皮下)施用于受试者。
在另一个实施方案中，所述方法包括将各成分经静脉内、肌内或皮下施用于受试者。
在另一个实施方案中，所述方法包括将各成分经静脉内施用于受试者。
可以通过与其他成分相同或不同的途径来施用各成分。优选地，通过相同的途径施用各成分。
在一个实施方案中，将要求保护的组合在心脏移植之前和/或期间和/或之后施用于供体受试者和/或受体受试者。例如，在一些实施方案中，可将联合施用于第一个受试者，从该受试者体内移除心脏器官用以移植到第二个受试者体内。此外或可选地，在一些实施方案中，在将心脏器官引入第二受试者体内之前，将联合施用于取出的心脏器官。此外或可选地，在一些实施方案中，在心脏移植之前、期间和/或之后，将联合疗法施用于第二受试者。
在一个实施方案中，要求保护的组合用于对心源性休克患者施用。心源性休克是威胁生命的医疗症状，其由心脏的心室的原发性故障而无法有效发挥功能所带来的血液循环不足而造成。这种情况在2％至10％的由于心肌梗死而住院的患者中发生，并且是这些患者中的主要死亡原因(holmes等，1995，jamcollcardiol，26：668-674)。更具体而言，心源性休克是氧递送失败、全身性atp缺乏以及由心脏泵衰竭引发的多器官功能障碍的复杂过程的结果(okuda，2006，shock，25：557-570)。由于这是一种循环性休克，组织灌注不足以满足对氧气和营养素的需求。症状涉及由氧气不足(缺氧)和营养不足(例如低血糖)引起的越来越普遍的细胞死亡。因此这样，它可能导致心脏骤停(或血液循环骤停)，这是心脏泵功能的突然停止(以及停止呼吸和意识丧失)。心源性休克被定义为持续低血压伴组织灌注不足，尽管有足够的左心室充盈压。组织灌注不足的迹象包括低尿量(<30ml/小时)、四肢变凉和意识水平的改变。若干大型试验已经证明冠状动脉重建术是改善患者存活的最重要策略(hochman等，1999，nengljmed，341：625-634)。然而，发展为心源性休克的患者的急性重建术具有不良预后，这可能是由于再灌注损伤而导致的，并且认为与梗死面积相关。事实上，已经证明了降低体温在心肌缺血中能够提供组织保护，并且临床前研究已经表明在实验诱导的心肌梗死中降低梗死面积的有益结果(dae等，2002，amjphysiolheartcircphysiol，282：h1584-h1591)。因此，在猪模型中，轻度治疗性降低体温降低了心源性休克的急性死亡率，并改善了血液动力学参数(gotberg等，2010，resuscitation，81：1190-1196)。
在一个实施方案中，要求保护的联合施用于对心脏骤停的患者。心脏骤停是由于心脏无法有效收缩而造成的有效血流的突然停止。心脏骤停最常见的原因为冠状动脉疾病。心脏骤停的治疗为立即心肺复苏(cpr)，并且如果存在可电击心率，则进行去心脏纤颤。在美国，每年每10,000人中约有13人(326,000例)在医院外发生心脏骤停。在医院中，另有209,000例发生心脏骤停(kronic等，circulation，2015，132：s397-s413)。除了提供高质量的心肺复苏之外，优化心脏骤停后综合征的治疗对于改善心脏骤停患者的长期结果至关重要。在这种综合征(“心脏骤停后综合征”)中，重点主要有三个方面：(1)心脏骤停后的脑损伤；(2)心脏骤停后的心肌功能障碍和再灌注损伤；以及(3)全身性缺血-再灌注反应。现在清楚的是，复苏后的护理可以影响长期生存率以及幸存者的心肌和神经的恢复和功能(kern，2015，circj，79：1156-1163)。在缺血-再灌注期间抑制线粒体通透性转换孔(mptp)的开放可以减轻心脏和其他全身器官的损伤。事实上，在心脏骤停的动物模型中已经表明，可以通过环孢霉素治疗来改善心脏骤停后的心肌功能障碍和存活率(huang等，2011，resuscitation，82s：s41-s47)。
在一个实施方案中，要求保护的组合施用于卒中患者。卒中是指当不良血液流入大脑时导致细胞死亡。中风有两种主要类型：缺血性卒中(由于缺乏血流)和出血性卒中(由于出血)。它们导致部分大脑无法正常工作。中风的迹象和症状可能包括身体的一侧无法移动或没有感觉、理解或说话出现问题、感觉世界正在旋转、或其中一侧丧失视力。缺血性卒中通常是由血管阻塞造成的。缺血性卒中治疗包括手术开放(再灌注)动脉至患有狭窄问题的大脑。如果缺血性卒中是在三到四个半小时内发现的，则可以用能够分解凝块的药物治疗。2013年，卒中是冠状动脉疾病发病后的第二大常见死因，导致640万人死亡(占总数的12％)。
缺血性卒中和急性心肌梗死需要紧急再灌注以改善功能预后(patel和saver，2013，stroke，44：94-98)。长期以来，静脉内组织型纤溶酶原激活剂一直是经证明临床有益于急性缺血性卒中患者的唯一再灌注治疗方法。正如在急性心肌梗死中发生的那样，在急性缺血性卒中中恢复再灌注的血管内方法可能使患者遭受到更严重的缺血/再灌注损伤，由此通过促进作为再灌注损伤标志物的出血转化和严重的血管性水肿两者阻碍了再通的益处(bai和lyden，2015，intjstroke，10：143-152)。实验证据表明，脑缺血再灌注损伤(和发生在心肌再灌注损伤中一样)可能通过缺血预处理和后处理而减弱。此外，实验证据表明，线粒体通透性转换孔(mptp)在心肌和脑两者的缺血再灌注损伤中起重要作用(schinzel等，2005，procnatlacadsciusa，102：12005-12010)，而环孢霉素a(mptp开放抑制剂)可以预防动物模型中的脑缺血再灌注损伤(leger等，2011，expneurol，230：58-66；borlongan等，2005，lifesci，76：1503-1512)。
在一个实施方案中，受试者处于(或易感)血管闭塞损伤或心脏缺血再灌注损伤的风险中。
在一个实施方案中，要求保护的组合用于针对药物(例如安血定)的心脏毒性作用而向受试者提供心脏保护，或针对药物(例如安血定)的心脏毒性作用而向受试者提供心脏保护的方法。bovelli等人(annalsofoncology21(supplement5)：v277-v282，2010)描述了心脏毒性药物的实例。
如本文所用，术语“心脏保护”是指(例如)通过预防、减少或延迟心肌损伤来保护心脏。心脏毒性药物包括与心脏衰竭相关的药物、与缺血或血栓栓塞相关的药物、与高血压相关的药物、与其它毒性作用相关的药物，如填塞和心内膜心肌纤维化、出血性心肌炎、缓慢型心律失常、雷诺现象、自主神经病、qt延长或尖端扭转型室性心动过速(torsadesdepointes)或肺纤维化。心脏毒性药物的实例包括蒽环类/蒽醌类、环磷酰胺、曲妥珠单抗和其他基于单克隆抗体的酪氨酸激酶抑制剂、抗代谢物(氟尿嘧啶、卡培他滨)、抗微管剂(紫杉醇、多烯紫杉醇)、顺铂、沙利度胺、贝伐单抗、舒尼替尼、索拉非尼、白消安、紫杉醇、长春碱、博来霉素、长春新碱、三氧化二砷、博来霉素、甲氨蝶呤。
在一个实施方案中，同时施用各个成分。
在一个实施方案中，同时施用(i)艾塞那肽，或功能性衍生物或类似物，或它们的可药用的盐；(ii)环孢霉素，或功能性衍生物或类似物，或它们的可药用的盐，以及(iii)坎利酸钾，或其功能性衍生物或类似物。
在一个实施方案中，依次或单独施用各个成分。
对于三种成分的组合，可以同时施用全部三种成分，或者可以同时施用任意两种成分，而单独或依次施用第三种成分。或者，可以以任意顺序单独或依次施用全部三种成分。
在一个实施方案中，在依次或单独施用(ii)之前施用(i)。
在另一个实施方案中，在依次或单独施用(i)之前施用(ii)。
在一个实施方案中，在依次或单独施用(iii)之前施用(i)。
在一个实施方案中，在依次或单独施用(i)之前施用(iii)。
在一个实施方案中，依次或单独施用(i)艾塞那肽，或功能性衍生物或类似物，或它们的可药用的盐；(ii)环孢霉素，或功能性衍生物或类似物，或它们的可药用的盐，以及(iii)坎利酸钾，或其功能性衍生物或类似物。
在一个实施方案中，以相对于各个成分的治疗有效量施用各个成分。
在一个实施方案中，以相对于各个成分的治疗有效量分别施用(i)艾塞那肽，或功能性衍生物或类似物，或它们的可药用的盐；(ii)环孢霉素，或功能性衍生物或类似物，或它们的可药用的盐，以及(iii)坎利酸钾，或其功能性衍生物或类似物。
如本文所用，术语“治疗有效量”是指足以达到期望的治疗和/或预防效果的量，例如导致预防或减少缺血和/或再灌注损伤或与缺血和/或再灌注损伤相关的一种或多种症状的量。
在治疗或预防应用的情况下，向受试者施用的组合物的量将取决于疾病的类型和严重程度以及个体的特征，如一般健康状况、年龄、性别、体型、体重和耐药性。还将取决于疾病的严重程度和类型。本领域技术人员将能够根据这些和其他因素确定合适的剂量。也可以将组合物与一种或多种其他治疗剂联合施用。
在一个实施方案中，以相对于各个成分的亚治疗有效量分别施用各个成分。
在一个实施方案中，以相对于各个成分的亚治疗有效量分别施用(i)艾塞那肽，或功能性衍生物或类似物，或它们的可药用的盐；(ii)环孢霉素，或功能性衍生物或类似物，或它们的可药用的盐，以及(iii)坎利酸钾，或其功能性衍生物或类似物。
在一个实施方案中，在再灌注受试者之前施用各个成分。
在一个实施方案中，在再灌注受试者之前施用(i)艾塞那肽，或功能性衍生物或类似物，或它们的可药用的盐；(ii)环孢霉素，或功能性衍生物或类似物，或它们的可药用的盐，以及(iii)坎利酸钾，或其功能性衍生物或类似物。
在一个实施方案中，在受试者的再灌注期间施用各个成分。
在一个实施方案中，在受试者的再灌注期间施用(i)艾塞那肽，或功能性衍生物或类似物，或它们的可药用的盐；(ii)环孢霉素，或功能性衍生物或类似物，或它们的可药用的盐，以及(iii)坎利酸钾，或其功能性衍生物或类似物。
在一个实施方案中，在受试者的再灌注之后施用各个成分。
在一个实施方案中，在受试者的再灌注之后施用(i)艾塞那肽，或功能性衍生物或类似物，或它们的可药用的盐；(ii)环孢霉素，或功能性衍生物或类似物，或它们的可药用的盐，以及(iii)坎利酸钾，或其功能性衍生物或类似物。
在一个实施方案中，在受试者的再灌注之前和/或期间和/或之后施用各个成分。
在一个实施方案中，在受试者的再灌注之前、期间和之后施用(i)艾塞那肽，或功能性衍生物或类似物，或它们的可药用的盐；(ii)环孢霉素，或功能性衍生物或类似物，或它们的可药用的盐，以及(iii)坎利酸钾，或其功能性衍生物或类似物。
在所述方法的一些实施方案中，在受试者的再灌注之前、期间和之后连续向受试者施用(i)，并且在再灌注之前以推注剂量(bolusdose)向受试者施用(ii)。
在所述方法的一些实施方案中，在受试者的再灌注之前、期间和之后连续向受试者施用(ii)，并且在再灌注之前以推注剂量向受试者施用(i)。
在所述方法的一些实施方案中，在受试者的再灌注之前、期间和之后连续向受试者施用(i)、(ii)和(iii)。
在所述方法的一些实施方案中，可以在再灌注之后存在一种或多种成分的额外施用。优选地，将该重复施用进行至少两次，更优选的是2次至100次，或者可以以连续输注的形式进行。
在所述方法的一些实施方案中，在再灌注之前以推注剂量向受试者施用各个成分。
在所述方法的一些实施方案中，在再灌注期间以推注剂量向受试者施用各个成分。
在所述方法的一些实施方案中，在再灌注之后以推注剂量向受试者施用各个成分。
如本文所用，“再灌注”是血流恢复至血流减少或阻塞的任意器官或组织。例如，血流可以恢复至受缺血或缺氧影响的任意器官或组织。可以通过本领域技术人员已知的任何方法实现血流恢复(再灌注)。例如，可以由重建术实现缺血性心脏组织的再灌注。
在一个实施方案中，通过重建术术实现再灌注。在一个实施方案中，重建术术选自由下列构成的组：经皮冠状动脉介入术；球囊血管成形术；旁路移植物植入术；支架植入术；定向冠状动脉粥样硬化切除术；使用一种或多种血栓溶解剂的治疗术；以及堵塞物清除术。
在一个实施方案中，所述一种或多种血栓溶解剂选自由下列构成的组：组织纤溶酶原激活剂；尿激酶；尿激酶原；链激酶；酰化形式的血纤维蛋白溶酶原；酰化形式的血纤维蛋白溶酶；以及酰化链激酶-血纤维蛋白溶酶原复合物。
剂量
本领域普通技术人员无需过多的实验即可以容易地确定将本发明组合物中的一者施用于受试者的合适剂量。通常，医师将确定最适合个体患者的实际剂量，而这将取决于各种因素，包括所用的具体化合物的活性、该化合物的代谢稳定性和作用时长、年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、施用方式和时间、排泄速率、药物组合、具体病症的严重程度以及正在接受治疗的个体。本文公开的剂量为平均情况的示例。当然可以有更高或更低剂量范围的个别情况，这些都在本发明的范围内。
在本发明的一个高度优选的实施方案中，组合中的胰岛素调节剂(例如艾塞那肽)的剂量通常低于其目前批准的疗法中通常在单药疗法中所使用的剂量，和/或低于再灌注损伤文献中所报道的一般剂量。
在本发明的一个高度优选的实施方案中，组合中免疫抑制剂(例如环孢霉素)的剂量通常低于其目前批准的疗法中通常在单药疗法中所使用的剂量，和/或低于再灌注损伤文献中所报道的一般剂量。
当用于目前要求保护的组合时，艾塞那肽优选以约0.001μg/kg至约1.5μg/kg的剂量施用，更优选约0.005μg/kg至约0.15μg/kg。
当用于目前要求保护的组合时，坎利酸钾优选以约0.03mg/kg至约10mg/kg的剂量施用，优选约1mg/kg至约10mg/kg，更优选约1mg/kg至约5mg/kg，甚至更优选约1mg/kg至约3mg/kg。
当用于目前要求保护的组合时，环孢霉素优选以约0.001mg/kg至约10mg/kg的剂量施用，更优选约0.01mg/kg至约5mg/kg，甚至更优选约0.01mg/kg至约2.5mg/kg。
在一个高度优选的实施方案中，组合为包含各成分的预定剂量的固定剂量组合(例如约0.005μg/kg至约0.05μg/kg的艾塞那肽和约1mg/kg至约3mg/kg的坎利酸钾，更优选约0.05μg/kg的艾塞那肽和1mg/kg的坎利酸钾)。
非治疗应用
另一方面，本发明涉及一种组合的应用，其用于治疗和/或预防移植之前或移植期间的离体器官中的缺血和/或再灌注损伤，所述组合包括下列成分中的至少两者：(i)胰岛素调节剂、(ii)免疫抑制剂和(iii)醛固酮拮抗剂。
另一方面，本发明涉及一种组合的应用，其用于治疗和/或预防移植之前或移植期间的离体器官中的缺血和/或再灌注损伤，所述组合包括下列成分中的至少两者：(i)艾塞那肽，或功能性衍生物或类似物，或它们的可药用的盐；(ii)环孢霉素，或功能性衍生物或类似物，或它们的可药用的盐；以及(iii)坎利酸钾，或其功能性衍生物或类似物。
在一个实施方案中，本发明涉及一种组合的应用，其用于治疗和/或预防移植之前或移植期间的离体器官中的再灌注损伤，所述组合包括下列成分中的至少两者：(i)胰岛素调节剂、(ii)免疫抑制剂和(iii)醛固酮拮抗剂。
在一个实施方案中，本发明涉及一种组合的应用，其用于治疗和/或预防移植之前或移植期间的离体器官中的再灌注损伤，所述组合包括下列成分中的至少两者：(i)艾塞那肽，或功能性衍生物或类似物，或它们的可药用的盐；(ii)环孢霉素，或功能性衍生物或类似物，或它们的可药用的盐；以及(iii)坎利酸钾，或其功能性衍生物或类似物。
在一个实施方案中，本发明涉及一种组合的应用，其用于治疗和/或预防移植之前或移植期间的离体器官中的缺血，所述组合包括下列成分中的至少两者：(i)胰岛素调节剂、(ii)免疫抑制剂和(iii)醛固酮拮抗剂。
在一个实施方案中，本发明涉及一种组合的应用，其用于治疗和/或预防移植之前或移植期间的离体器官中的缺血，所述组合包括下列成分中的至少两者：(i)艾塞那肽，或功能性衍生物或类似物，或它们的可药用的盐；(ii)环孢霉素，或功能性衍生物或类似物，或它们的可药用的盐；以及(iii)坎利酸钾，或其功能性衍生物或类似物。
离体(从体内移出的)器官可能因缺乏血流而容易受到再灌注损伤。因此，本发明的组合可用于防止移出的器官中的再灌注损伤。优选地，所述器官为心脏、肝脏或肾脏，更优选为心脏。
在一些实施方案中，将移出的器官置于标准缓冲溶液中，如含有本发明的组合的本领域常用的溶液。例如，可将取出的心脏置于含有艾塞那肽和环孢霉素的心脏停搏液中。本领域技术人员可以容易地确定用于标准缓冲溶液中的艾塞那肽、环孢霉素和坎利酸钾的浓度。这样的浓度可以为(例如)约0.1nm至约10μm，优选约1nm至约10μm。
实施例
通过下列实施例对本发明进行进一步说明，这些实施例不应被解释为以任何方式进行限制。
实施例1.在急性心肌梗死损伤的兔模型中，组合的艾塞那肽和环孢霉素的治疗效果
研究表明，使用艾塞那肽治疗可以减轻/缓解由急性心肌梗死(ami)和/或经皮冠状动脉介入术/血管成形术(pci)之后临床上可能发生的缺血-再灌注(i/r)损伤所引起的心肌损伤。当在再灌注开始之前给予艾塞那肽(iv推注0.150μg/kg)时，可能具有心肌保护效果。此外，研究表明，使用环孢霉素a(csa)的治疗可以减轻/缓解由临床上ami和/或pci之后可能发生的i/r损伤所引起的心肌损伤。当在再灌注开始之前给予csa(iv推注2.5mg/kg)时，可能具有心肌保护效果。设计本研究用来测试艾塞那肽和环孢霉素a在模拟急性i/r损伤的临床方案中的对于心脏保护的组合效果。研究是在这样的假设下进行的，即相比于艾塞那肽或环孢霉素单独治疗，在缺血开始之后(但在再灌注之前)使用艾塞那肽和csa的联合治疗将提供更显著的心肌保护效果。
本研究中使用新西兰白兔。兔子为雄性，年龄>8周，体重为2.9kg至3.8kg。研究开始前得到了伦理委员会和兽医当局的批准。将动物室的环境控制设定为保持22℃至28℃的温度、30％至70％的相对湿度。每小时记录并每天监测室温和湿度。动物室每小时换气约10次至15次。光周期为12小时光照和12小时黑暗。进行常规日常观察。从抵达动物室起每天提供约180克认证的标准兔子饮食。
将艾塞那肽肽[
在全身麻醉下，静脉内给予试验/对照制品，以模拟在急性心肌梗死和原发性经皮冠状动脉介入术的临床环境中的预期给药途径。通过外周静脉(兔耳静脉)静脉内推注施用。
研究按照预定的安慰剂和假手术对照计划进行。简言之，将80只健康的、适应环境的雄性兔子随机分配到三个研究组中的一组。a组(n＝4，假手术)包括用生理盐水(ns；iv)治疗的假手术时间对照；b组(n＝18，对照/安慰剂)包括用生理盐水(ns；iv)治疗的i/r动物；c组(n＝18，艾塞那肽，0.15μg/kg)包括用艾塞那肽治疗的i/r动物；d组(n＝18，环孢霉素，2.5mg/kg，iv)包括用csa治疗的i/r动物；e组(n＝22，艾塞那肽+环孢霉素，iv)包括用艾塞那肽和csa治疗的i/r动物。
在i/r组(b组、c组、d组和e组)中，使兔子经受40分钟的心脏缺血(冠状动脉闭塞)，然后进行120分钟(2小时)的再灌注。在所有的情况下，在缺血发生之后30分钟(再灌注开始之前10分钟)进行治疗(静脉内推注施用ns或艾塞那肽或csa或艾塞那肽加csa)。在所有的情况下，在缺血之前和缺血期间以及再灌注之后120分钟(2小时)监测心血管功能。在再灌注之后2小时(研究结束)终止实验；评价这个时间点的不可逆性心肌损伤(通过组织形态计量学的梗死面积)，并且为研究的主要终点。将研究计划总结于表1中。
表1.实验方案
麻醉/手术准备。用氯胺酮(～35mg/kg至50mg/kg)和甲苯噻嗪(～5mg/kg至10mg/kg)混合物肌肉内(im)诱导全身麻醉。为了在整个实验过程中维持自主神经功能并保持麻醉状态，根据需要使动物接受额外的麻醉(～10mg至15mg氯胺酮/30分钟或～15mg/kg至20mg/kg戊巴比妥钠)。将静脉导管置于外周静脉(例如，耳朵耳静脉)中用于施用额外的麻醉剂和生理盐水/试验制品。通过以下方面对麻醉的效果进行评估：(i)动物的角膜反射完全消失、(ii)动物的呼吸中枢完全停止，而动物自主呼吸引起的气流对机械通气完全不产生任何阻力，以及(iii)血液动力学参数的稳定性。通过气管切开术(腹侧中线切口)放置有囊气管导管，并用于通过容积循环动物呼吸机用95％o2/5％co2混合物机械地进行肺通气(～40次呼吸/分钟，一次换气量为～12.5ml/kg)，从而在生理学范围内广泛维持paco2值。在整个实验过程中，持续监测心电图、动脉压、心脏脉冲和二氧化碳图。将温度探头插入直肠，并使用加热垫保持体温。最后，将动脉导管置于外周动脉(例如，耳朵)中用于血液采样。
随后，将动物以左侧卧位放置，并通过左侧胸廓切开术来手术打开胸腔。通过左侧第四肋间空间打开胸腔。暴露出跳动的心脏并切开心包。在心耳下，用3-0缝合丝线环绕旋动脉的第一个大前外侧分支，根据每只动物的冠状动脉解剖结构，如有必要，则环绕旋动脉本身。该区域的冠状动脉闭塞通常导致前外侧和顶心室壁的大面积缺血。使缝线的两端穿过一小块聚乙烯管，从而形成圈套。将线穿过管，借助小夹钳使线紧密固定在冠状动脉壁上，从而诱发缺血。缺血导致心电图上的st段抬高和心肌颜色的改变(即发绀)。缺血30分钟后，对动物进行iv推注赋形剂(生理盐水)或艾塞那肽或csa或艾塞那肽与csa的组合；治疗后使缺血再持续10分钟(即，缺血时间共计40分钟)。在缺血时期结束时，释放冠状动脉圈套，并使先前的缺血心肌进行再灌注达2小时。应该指出的是，在假手术的动物中，在缺血再灌注发生时操纵血管圈套，但没有将其收紧或松开。
在6个预定的时间点监测并记录血液动力学变量和直肠温度：麻醉之后(基线)、缺血刚发生之前(预闭塞)、缺血30分钟(施用赋形剂/试验制品)、以及再灌注之后30分钟、60分钟和120分钟。此外，为了确定/量化由使用和不使用艾塞那肽或csa或它们的组合的i/r损伤所导致的不可逆性心肌损伤(即梗死)的程度，因而对梗死面积进行评价。
血液样本。在两个数据收集时间点收集静脉(<3ml)全血样本用于通过心脏生物标志物分析来评价心肌损伤：基线和再灌注后120分钟。对作为最有价值且最可靠的临床使用的生物标志物心肌肌钙蛋白-i(ctni)进行测定。使用生化分析仪(
组织病理学/组织形态计量学。在方案完成后，评估由i/r损伤导致的不可逆性心肌损伤(即梗死)。简言之，在再灌注结束后，将心脏切离，安装在设备上，并用生理盐水灌注2分钟以去除血液。然后将冠状动脉环绕线在同一部位重新固定，并输注5ml绿色荧光聚合物微球溶液(8mg/ml，直径为3μm至8μm；fluoro-maxtm，thermoscientific，ca，美国)用于区分正常灌注区域(非缺血区域)并描绘缺血期间的心肌危险区域(aar，缺血区域)。使心脏在-20℃下保持24小时，并垂直于心脏的长轴(从顶点到底部)将其切割成3mm厚的切片。随后，在37℃下，将切片在2％的三苯基-四唑-氯化物(ttc，sigma，st.louis，mo，美国)中孵育20分钟，并在10％的非缓冲福尔马林溶液中固定。
固定后，数字化描绘/测量总的左心室区域(lv)、危险区域(aar)和梗死区域(if)。使用波长为366nm的紫外光，从各切片中的梗死区域(if)和非缺血区域中区分出缺血区域(aar)。将所有区域描摹到醋酸纤维纸上。随后将摹图输入图像分析程序(imagej；国立卫生研究院)，并进行计算机辅助平面测量以确定左心室(lv)、危险区域(aar)和梗死区域(if)的总面积。对于各切片，将aar表示成lv区域的百分比(aar/lv)，并将if表示成aar的百分比(if/aar)。在所有的情况下，均由对治疗分配/研究计划不知情的人员进行定量组织形态计量学分析。
数据分析/统计。使用excel工作表将从上述实验过程得到的数据列表并计算。采用spss21.0版(spssinc.，il，美国)进行统计分析。将数值表示成平均值±标准误差(sem)。使用具有bonferroni校正分析的单向方差分析(anova)模型分析三组中数值变量的统计学比较。认为计算的p值小于0.05是统计学上显著的。
动物观察/结果。
表2示出了血液动力学变量、平均动脉压和心率。所有组的基线值相似。如我们通常在我们的兔子模型中看到的，手术和闭塞之后动脉压下降，并且在再灌注结束时最明显。在这个压力变量中，组间没有显著差异。随着时间的推移，所有组都遵循相似的模式
表2：血液动力学参数a
a值为平均值±sem；hr：平均心率，单位为心跳次数/分钟；map：平均动脉血压；
在所有经治疗的动物中，lv面积和aar面积相当，从而表明组之间初始左心室和缺血区域没有统计学差异。虽然与对照组相比，艾塞那肽或csa的施用导致梗死面积减小，但是艾塞那肽和csa的联合施用更有效地减小了梗死面积。同样地，艾塞那肽或csa分别使ctni释放减少48％和36％，而艾塞那肽和环孢素联合治疗使ctni释放减少61％(62.6±10.7，p<0.001)。
表3列出了这样的数据，示其出了本研究中使用的各组的心肌肌钙蛋白i水平、危险区域与左心室之比，梗死区域与左心室之比，以及梗死区域与危险区域之比。
表3.研究生物化学和组织病理学的结果
这些结果表明，在急性心肌缺血和再灌注损伤的标准化兔模型中，相比于艾塞那肽或csa单药疗法组，在再灌注开始前10分钟作为iv推注而施用的艾塞那肽和csa(分别为0.15μg/kg和2.5mg/kg)的联合疗法能够显著更大的减少心肌梗死面积。因此，这些结果首次证明，在心肌再灌注损伤的治疗中，联合施用环孢霉素和艾塞那肽是更有益且有利的，并且提供了优于单独使用环孢霉素或艾塞那肽治疗的临床结果。因此，组合的艾塞那肽和csa在预防和治疗哺乳动物受试者的缺血-再灌注损伤的方法中特别有效。
实施例2.在急性心肌梗死损伤的大鼠模型中，组合的艾塞那肽和环孢霉素治疗的剂量依赖性效应
设计本研究用来研究各种剂量的艾塞那肽、csa及其组合在心肌再灌注损伤的大鼠模型中的心脏保护效果。研究是在这样的假设下进行的，即在缺血发生之后且在再灌注之前，使用艾塞那肽和csa的联合治疗还会导致其他动物模型中梗死面积的减少。
本研究中使用wistar大鼠。大鼠为雄性，体重为266g至370g。研究开始前得到了伦理委员会和兽医当局的批准。使用经hepa过滤的空气将动物饲养在单独通风的笼中，其符合最新的实验动物护理和使用指南dhew(nih)和2010/63/eu指令中关于保护用于科学目的的动物的规模建议。将动物室的环境控制设定为保持22℃至28℃的温度、30％至70％的相对湿度。放置在笼下的垫草材料每周至少更换三次。动物室每小时换气约10次至15次。光周期为12小时光照和12小时黑暗。进行常规日常观察。在试验之前，使动物适应饲养设施至少3天。可随意获取标准实验室大鼠食物和经过滤的自来水。
将艾塞那肽(
该研究按照预定的安慰剂对照计划进行。简言之，将130只健康的、适应环境的雄性大鼠随机分配到十个研究组中的一组。使所有动物均经受30分钟的心脏缺血(冠状动脉闭塞)，然后进行120分钟(2小时)的再灌注。在所有的情况下，在缺血发生之后20分钟(再灌注开始之前10分钟)进行治疗(静脉内推注施用ns或艾塞那肽或csa或它们的组合)。在所有的情况下，在缺血之前和缺血期间以及再灌注之后120分钟(2小时)监测心血管功能。在再灌注之后2小时(研究结束)终止实验；评价这个时间点的不可逆性心肌损伤(通过组织形态计量学的梗死面积)，并且为研究的主要终点。将研究计划总结于表4中。
表4.实验方案
麻醉/手术准备。通过腹膜内(ip)注射戊巴比妥(euthazol，produlabpharmab.v.，raamsdonksveer，荷兰；60mg/kg推注剂量，然后在实验期间需要时，给予15mg/kg至20mg/kg)对雄性wistar大鼠进行麻醉。将大鼠称重，并且剃去胃部和胸部区域的毛。使用恒温加热垫协助维持体温。将连接到啮齿动物呼吸机的塑料套管插入气管。使用室内空气对动物进行通气(6.2ml/kg，70±5次呼吸/分钟)。在整个实验中监测血压、表面导联ecg和身体核心温度，以确保准备的稳定性。将右侧颈动脉插管用于测量血压，并将右侧颈静脉插管用于试验制品的给药。在第5肋间隙进行胸廓切开术，并使心脏暴露。将5-0prolene缝线置于左降冠状动脉周围。然后通过将缝线穿过一小块塑料管道并用止血钳将圈套适当拉紧，从而使冠状动脉闭塞30分钟。冠状动脉闭塞30分钟后，通过释放圈套来启动再灌注并持续120分钟。
在6个预定的时间点监测并记录血液动力学变量：麻醉之后(基线)、缺血刚发生之前(预闭塞)、缺血20分钟(施用赋形剂/试验制品)、以及再灌注之后30分钟、60分钟和120分钟。此外，为了确定/量化由使用和不使用艾塞那肽或csa或艾塞那肽和csa的i/r损伤所导致的不可逆性心肌损伤(即梗死)的程度，因而对心脏生物标志物以及梗死面积进行评价。
组织病理学/组织形态计量学。在120分钟的再灌注时期结束时，取出心脏并测定梗死面积。简言之，将冠状动脉左前降支重新封闭，使用4ml0.3％(w/v)的evans-blue染料(sigma-aldrich)以100cmh2o的恒定压力灌注到心脏主动脉中，从而描绘危险区域的地带。非缺血性灌注的组织区域被染成蓝色，而危险区域则未被染色。将染色的心脏快速冷冻(在-20℃下至少2小时)，切成2mm厚的切片，并在37℃下将各切片在1.5ml的溶有1％(w/v)ttc(merckbiosciences)的50mm的磷酸盐缓冲液(ph7.4)中孵育10分钟。然后将切片转移至10％的福尔马林溶液中5分钟。
固定后，数字化描绘/测量总的左心室区域(lv)、危险区域(aar)和梗死区域(if)。将切片置于玻璃板之间，并从心脏切片的两侧拍摄数码相片。通过数字平面测量法(infarctsizetm2.5，pharmahungary，szeged，hungary)对不同染色区域的图像进行量化。在整个研究过程中由具备经验的人以不知情的方式进行所有图像的评价。对于各切片，将aar表示成lv区域的百分比(aar/lv)，并将if表示成aar(if/aar)的百分比。
数据分析/统计。使用excel工作表将从上述实验过程得到的数据列表并计算。采用spss21.0版(spssinc.，il，usa)进行统计分析。将数值表示成平均值±标准误差(sem)。通过使用单向anova，而后进行tukey事后检验，来分析终点测量值(即梗死面积，aar)的平均值之间的差异，从而在适当的时候将各组与对照组进行比较。通过重复测量双向anova和tukey事后检验来分析连续变量的平均值之间的差异(即血液动力学数据)。认为计算的p值小于0.05是统计学上显著的。
动物观察/结果。
表5示出了血液动力学变量、平均动脉压和心率。所有组的基线值相似。如我们通常在我们的大鼠模型中看到的，手术和闭塞之后动脉压下降，并且在再灌注结束时最明显。在这个压力变量中，组间没有显著差异。随着时间的推移，所有组都遵循相似的模式
表5：血液动力学参数
hr：平均心率，单位为心跳次数/分钟；map：平均动脉血压，单位为mmhg。
在所有经治疗的动物中，lv面积和aar面积相当，从而表明组之间初始左心室和缺血区域没有统计学差异。艾塞那肽或csa的施用表现出剂量依赖性效应。具体而言，使用较低剂量的艾塞那肽和csa治疗动物导致梗死面积相比于对照组显著减小，而较高剂量则没有效果。有趣的是，低剂量的艾塞那肽和csa的联合施用更有效地减少了梗死面积。与对照组(62.9±3.7)相比，0.03μg/kg剂量的艾塞那肽和0.5mg/kg剂量的csa分别使梗死面积减少27％(45.9±1.4；p<0.05)和26.6％(46.2±3.7；p<0.05)，而艾塞那肽和csa联合疗法使梗死面积减少39.1％(38.3±2.7；p<0.05)。
表6列出了这样的数据，示其出了本研究中各组的危险区域与左心室之比和梗死区域与危险区域之比。
表6.研究组织病理学的结果
这些结果表明，在急性心肌缺血和再灌注损伤的其他标准化动物(大鼠)模型中，相比于艾塞那肽或csa单药疗法，艾塞那肽和csa的联合疗法也能够显著更大的减少心肌梗死面积。然而，在本大鼠模型中，与实施例1的兔模型相比，在较低剂量下心脏保护效果明显，从而表明不同物种可能对艾塞那肽或csa或它们的组合的反应不同。在兔模型中缺血持续时间较长的事实也可能是两种物种所观察到的效果差异的原因。尽管如此，这些结果再次证明，在心肌再灌注损伤的治疗中，联合施用csa和艾塞那肽是更有益且有利的，并且提供了优于单独使用环孢霉素或艾塞那肽治疗的临床结果。因此，组合的艾塞那肽和csa在预防和治疗哺乳动物受试者的缺血-再灌注损伤的方法中特别有效。
实施例3.在急性心肌梗死损伤的兔模型中，组合的艾塞那肽和坎利酸钾的治疗效果
研究表明，使用坎利酸钾治疗可以减轻/缓解由临床上ami和/或pci之后可能发生的i/r损伤所引起的心肌损伤。设计本研用来在测试艾塞那肽和坎利酸钾在模拟急性i/r损伤的临床方案中的组合心脏保护效果。研究是在这样的假设下进行的，即相比于艾塞那肽或坎利酸钾单独治疗，在缺血开始后(但在再灌注之前)使用艾塞那肽和坎利酸钾的联合治疗将提供更显著的心肌保护效果。
本研究中使用新西兰白兔。兔子为雄性，年龄>8周，体重为2.6kg至3.8kg。所有动物均按照保护用于实验和其他科学目的的脊椎动物的2010/63/ue欧洲公约的指令进行处理，并符合美国国立卫生研究院出版的实验动物护理和使用指南(nih出版号85-23，1985年修订)。研究开始前得到了伦理委员会和兽医当局的批准。将动物室的环境控制设定为保持22℃至28℃的温度、30％至70％的相对湿度。每小时记录并每天监测室温和湿度。动物室每小时换气约10次至15次。光周期为12小时光照和12小时黑暗。进行常规日常观察。从抵达动物室起每天提供约180克认证的标准兔子饮食。
将艾塞那肽(
在全身麻醉下，静脉内给予试验/对照制品，以模拟在急性心肌梗死和原发性经皮冠状动脉介入术的临床环境中的预期给药途径。通过外周静脉(兔耳静脉)静脉内推注施用。
该研究按照预定的安慰剂对照计划进行。简言之，将52只健康的、适应环境的雄性兔子随机分配到四个研究组中的一组。在所有的组中，使兔子经受30分钟的心脏缺血(冠状动脉闭塞)，然后进行180分钟(3小时)的再灌注。在所有的情况下，在缺血发生之后15分钟(再灌注开始之前15分钟)进行治疗(静脉内推注施用生理盐水或艾塞那肽或坎利酸钾或它们的组合)。在再灌注之后3小时(研究结束)终止实验；评价这个时间点的不可逆性心肌损伤(通过组织形态计量学的梗死面积)，并且为研究的主要终点。将研究计划总结于表7中。
表7.实验方案
麻醉/手术准备。用氯胺酮(～35mg/kg至50mg/kg)和甲苯噻嗪(～5mg/kg至10mg/kg)混合物肌肉内(im)诱导全身麻醉。为了在整个实验过程中维持自主神经功能并保持麻醉状态，根据需要使动物接受额外的麻醉(～10mg至15mg氯胺酮/30分钟或～15mg/kg至20mg/kg戊巴比妥钠)。将静脉导管置于外周静脉(例如，耳朵耳静脉)中用于施用额外的麻醉剂和生理盐水/试验制品。通过气管切开术(腹侧中线切口)放置有囊气管导管，并用于通过容积循环动物呼吸机用95％o2/5％co2混合物机械地进行肺通气(～40次呼吸/分钟，一次换气量为～12.5ml/kg)，从而在生理学范围内广泛维持paco2值。
随后，将动物以左侧卧位放置，并用左侧胸廓切开术手术打开胸腔。通过左侧第四肋间空间打开胸腔。暴露出跳动的心脏并切开心包。在心耳下，用3-0缝合丝线环绕冠状动脉左前降支(lad)。该区域的冠状动脉闭塞通常导致前外侧和顶心室壁的大面积缺血。使缝线的两端穿过一小块聚乙烯管，从而形成圈套。将线穿过管，借助小夹钳使线紧密固定在冠状动脉壁上，从而诱发缺血。缺血导致心肌颜色的改变(即发绀)。缺血15分钟后，对动物进行iv推注赋形剂(生理盐水)或指定的试验制品；治疗后使缺血再持续15分钟(即，缺血时间共计30分钟)。在缺血时期结束时，释放冠状动脉圈套，并使先前的缺血心肌进行再灌注达3小时。为了确定/量化由进行和不进行指定的治疗的缺血和再灌注损伤所导致的不可逆性心肌损伤(即梗死)的程度，因而对梗死区域进行评价。
组织病理学/组织形态计量学。在方案完成后，评估由i/r损伤导致的不可逆性心肌损伤(即梗死)。简言之，在再灌注结束后，将心脏切离，安装在设备上，并用生理盐水灌注2分钟以去除血液。然后将冠状动脉环绕线在同一部位重新固定，并输注5ml绿色荧光聚合物微球溶液(8mg/ml，直径为3μm至8μm；fluoro-maxtm，thermoscientific，ca，美国)用于区分正常灌注区域(非缺血区域)并描绘缺血期间的心肌危险区域(aar，缺血区域)。使心脏在-20℃下保持24小时，并垂直于心脏的长轴(从顶点到底部)将其切割成3mm厚的切片。随后，在37℃下，将切片在2％的三苯基-四唑-氯化物(ttc，sigma，st.louis，mo，美国)中孵育20分钟，并在10％的非缓冲福尔马林溶液中固定。
固定后，数字化描绘/测量总的左心室区域(lv)、危险区域(aar)和梗死区域(if)。使用波长为366nm的紫外光，从各切片中的梗死区域(if)和非缺血区域中区分出缺血区域(aar)。将所有区域描摹到醋酸纤维纸上。随后将摹图输入图像分析程序(imagej；国立卫生研究院)，并进行计算机辅助平面测量以确定左心室(lv)、危险区域(aar)和梗死区域(if)的整体面积。对于各切片，将aar表示成lv区域的百分比(aar/lv)，并将if表示成aar的百分比(if/aar)。在所有的情况下，均由对治疗分配/研究计划不知情的人员进行定量组织形态计量学分析。
数据分析/统计。采用spss21.0版(spssinc.，il，美国)进行统计分析。将数值表示成平均值±标准误差(sem)。使用具有bonferroni校正分析的单向方差分析(anova)模型分析三组中数值变量的统计学比较。认为计算的p值小于0.05是统计学上显著的。
动物观察/结果。
在所有动物中，左心室(lv)和缺血区域(aar)的面积相当，并且在研究组之间没有统计学差异。在对照组中，诱导缺血(30分钟)和再灌注(180分钟)导致对实验动物心肌的显著损伤(49.47±3.97％)，表明模型的充分实施和研究实验过程的重现性。与对照组相比，艾塞那肽单药治疗(0.150μg/kg)导致梗死程度下降36.2％(31.55±3.31％；p<0.05)。与对照组相比，坎利酸钾单药疗法(1mg/kg)的施用使梗死区域减少30.5％(34.36±2.83％；p<0.05)。与对照组相比，艾塞那肽和坎利酸钾组合的治疗导致梗死程度显著降低73.1％(13.31±2.14％；p<0.001)。有趣的是，与艾塞那肽和坎利酸钾各自的单药疗法相比，组合的效果也是统计学显著的(p<0.01)。
表8列出了这样的数据，其示出了本研究中使用的各组的危险区域与左心室之比以及梗死区域与危险区域之比。
表8.研究组织病理学的结果
这些结果表明，在急性心肌缺血和再灌注损伤的标准化兔模型中，相比于艾塞那肽或坎利酸钾单药疗法组，在再灌注开始前15分钟作为iv推注而施用的艾塞那肽和坎利酸钾(分别为0.15μg/kg和1mg/kg)的联合疗法能够显著更大的减少心肌梗死面积。此外，令人很感兴趣的是，目前的结果首次提供了强有力的证据，即坎利酸钾与艾塞那肽的联合疗法也以协同作用的方式降低了心肌损伤的程度，因为所得的组合的减少效果超过了各自的单药疗法的减少效果之和。因此，这些结果首次证实，在心肌再灌注损伤的治疗中，联合施用坎利酸钾和艾塞那肽是更有益且有利的，并且提供了优于单独使用坎利酸钾或艾塞那肽治疗的临床结果。因此，组合的艾塞那肽和坎利酸钾在预防和治疗哺乳动物受试者的缺血-再灌注损伤的方法中特别有效。
实施例4.三重联合疗法：在急性心肌梗死损伤的兔模型中，组合的艾塞那肽、环孢霉素和坎利酸钾治疗的效果
设计本研究用来测试艾塞那肽、环孢霉素(csa)和坎利酸钾在模拟急性i/r损伤的临床方案中的组合心脏保护效果。研究是在这样的假设下进行的，即相比于使用艾塞那肽和环孢霉素的双重治疗，在缺血开始之后(但在再灌注之前)使用艾塞那肽、csa和坎利酸钾的三重联合治疗将提供更显著的心肌保护效果。
本研究中使用新西兰白兔。兔子为雄性，年龄>8周，体重为2.6kg至3.8kg。所有动物均按照保护用于实验和其他科学目的的脊椎动物的2010/63/ue欧洲公约的指令进行处理，并符合美国国立卫生研究院出版的实验动物护理和使用指南(nih出版号85-23，1985年修订)。研究开始前得到了伦理委员会和兽医当局的批准。将动物室的环境控制设定为保持22℃至28℃的温度、30％至70％的相对湿度。每小时记录并每天监测室温和湿度。动物室每小时换气约10次至15次。光周期为12小时光照和12小时黑暗。进行常规日常观察。从抵达动物室起每天提供约180克认证的标准兔子饮食。
将艾塞那肽(
在全身麻醉下，静脉内给予试验/对照制品，以模拟在急性心肌梗死和原发性经皮冠状动脉介入术的临床环境中的预期给药途径。通过外周静脉(兔耳静脉)静脉内推注施用。
研究按照预定的安慰剂对照计划进行。简言之，将55只健康的、适应环境的雄性兔子随机分配到四个研究组中的一组。在所有的组中，使兔子经受30分钟的心脏缺血(冠状动脉闭塞)，然后进行180分钟(3小时)的再灌注。在所有的情况下，在缺血发生之后15分钟(再灌注开始之前15分钟)进行治疗(静脉内推注施用生理盐水或试验制品组合)。在再灌注之后3小时(研究结束)终止实验；评价这个时间点的不可逆性心肌损伤(通过组织形态计量学的梗死面积)，并且为研究的主要终点。将研究计划总结于表9中。
表9.实验方案
麻醉/手术准备。用氯胺酮(～35mg/kg至50mg/kg)和甲苯噻嗪(～5mg/kg至10mg/kg)混合物肌肉内(im)诱导全身麻醉。为了在整个实验过程中维持自主神经功能并保持麻醉状态，根据需要使动物接受额外的麻醉(～10mg至15mg氯胺酮/30分钟或～15mg/kg至20mg/kg戊巴比妥钠)。将静脉导管置于外周静脉(例如，耳朵耳静脉)中用于施用额外的麻醉剂和生理盐水/试验制品。通过气管切开术(腹侧中线切口)放置有囊气管导管，并用于通过容积循环动物呼吸机用95％o2/5％co2混合物机械地进行肺通气(～40次呼吸/分钟，一次换气量为～12.5ml/kg)，从而在生理学范围内广泛维持paco2值。
随后，将动物以左侧卧位放置，并用左侧胸廓切开术手术打开胸腔。通过左侧第四肋间空间打开胸腔。暴露出跳动的心脏并切开心包。在心耳下，用3-0缝合丝线环绕冠状动脉左前降支(lad)。该区域的冠状动脉闭塞通常导致前外侧和顶心室壁的大面积缺血。使缝线的两端穿过一小块聚乙烯管，从而形成圈套。将线穿过管道，借助小夹钳使线紧密固定在冠状动脉壁上，从而诱发缺血。缺血导致心肌颜色的改变(即发绀)。缺血15分钟后，对动物进行iv推注赋形剂(生理盐水)或指定的试验制品；治疗后使缺血再持续15分钟(即，缺血时间共计30分钟)。在缺血时期结束时，释放冠状动脉圈套，并使先前的缺血心肌进行再灌注达3小时。为了确定/量化由进行和不进行指定的治疗的缺血和再灌注损伤所导致的不可逆性心肌损伤(即梗死)的程度，因而对梗死区域进行评价。
组织病理学/组织形态计量学。在方案完成后，评估由i/r损伤导致的不可逆性心肌损伤(即梗死)。简言之，在再灌注结束后，将心脏切离，安装在设备上，并用生理盐水灌注2分钟以去除血液。然后将冠状动脉环绕线在同一部位重新固定，并输注5ml绿色荧光聚合物微球溶液(8mg/ml，直径为3μm至8μm；fluoro-maxtm，thermoscientific，ca，美国)用于区分正常灌注区域(非缺血区域)并描绘缺血期间的心肌危险区域(aar，缺血区域)。使心脏在-20℃下保持24小时，并垂直于心脏的长轴(从顶点到底部)将其切割成3mm厚的切片。随后，在37℃下，将切片在2％的三苯基-四唑-氯化物(ttc，sigma，st.louis，mo，美国)中孵育20分钟，并在10％的非缓冲福尔马林溶液中固定。
固定后，数字化描绘/测量总的左心室区域(lv)、危险区域(aar)和梗死区域(if)。使用波长为366nm的紫外光，从各切片中的梗死区域(if)和非缺血区域中区分出缺血区域(aar)。将所有区域描摹到醋酸纤维纸上。随后将摹图输入图像分析程序(imagej；国立卫生研究院)，并进行计算机辅助平面测量以确定左心室(lv)、危险区域(aar)和梗死区域(if)的整体面积。对于各切片，将aar表示成lv区域的百分比(aar/lv)，并将if表示成aar的百分比(if/aar)。在所有的情况下，均由对治疗分配/研究计划不知情的人员进行定量组织形态计量学分析。
数据分析/统计。采用spss21.0版(spssinc.，il，美国)进行统计分析。将数值表示成平均值±标准误差(sem)。使用单向方差分析(anova)模型，随后用fisherlsd事后检验分析三组中数值变量的统计学比较。认为计算的p值小于0.05是统计学上显著的。
动物观察/结果。
在所有动物中，左心室(lv)和缺血区域(aar)的面积相当，并且在研究组之间没有统计学差异。与对照组(49.47±4)相比，艾塞那肽和csa的双重联合治疗(分别为0.150mg/kg和0.5mg/kg)使梗死区域减少50％(24.74±3.8％；p<0.05)。与对照组相比，在该治疗中添加坎利酸钾(1mg/kg)使梗死区域进一步减少70.6％(14.56±3％；p<0.001)。同样地，与对照组相比，艾塞那肽、坎利酸钾和csa1mg/kg的三重联合施用使梗死区域减少74.8％(12.49±2.2％；p<0.001)。有趣的是，与艾塞那肽和csa的双重联合相比，这些三重联合的效果是统计学上显著的(p<0.05)。然而，艾塞那肽、坎利酸钾和csa2.5mg/kg的三重组合的施用使梗死程度降低46.5％(26.48±2.93％；p<0.05)，与艾塞那肽和csa的双重组合相比无统计学显著性。
表10列出了这样的数据，其示出了本研究中使用的各组的危险区域与左心室之比以及梗死区域与危险区域之比。
表10.研究组织病理学的结果
这些结果表明，在急性心肌缺血和再灌注损伤的标准化兔模型中，艾塞那肽和csa的联合施用提供了有益效果，而在治疗中添加坎利酸钾显示出显著地进一步增强了该组合的心脏保护效果。令人很感兴趣的是，本实施例首次提供了强有力的证据，即与艾塞那肽和csa联合治疗相比，艾塞那肽、csa和坎利酸钾的三重联合疗法更大地降低心肌损伤程度。因此，这些结果首次证实，在心肌再灌注损伤的治疗中，艾塞那肽、csa和坎利酸钾的三重联合施用是更有益且有利的，并且提供了优于单药疗法或者csa和艾塞那肽作为联合疗法施用的临床结果。同样地，组合的艾塞那肽、csa(至少在低剂量时)和坎利酸钾在预防和治疗哺乳动物受试者的缺血-再灌注损伤的方法中特别有效。
实施例5.在急性心肌梗死损伤的小鼠模型中，艾塞那肽、环孢霉素和坎利酸钾以及它们的双重或三重联合疗法的效果
设计本研究用来测试以下内容：
i)在其他的心肌再灌注损伤的动物(鼠科)模型中，艾塞那肽、csa和坎利酸钾作为单药疗法的剂量依赖性效应。
ii)在低于最佳单药疗法剂量的剂量下，艾塞那肽、csa和坎利酸钾双重联合疗法的效果。
iii)在与双重组合中所用的各成分相同的剂量下，艾塞那肽、csa和坎利酸钾三重联合疗法的效果。
研究旨在进一步证明在小鼠模型中，在缺血发生之后且在再灌注之前，相比于各自的单药疗法，使用艾塞那肽、csa和坎利酸钾的双重联合疗法使梗死面积减小更多，而相比于双重联合疗法，使用艾塞那肽、csa和坎利酸钾的三重联合疗法更有益且更有优势。
本研究中使用c57bl/6小鼠。小鼠为雄性，13-15周龄。所有动物均按照保护用于实验和其他科学目的的脊椎动物的2010/63/ue欧洲公约的指令进行处理，并符合美国国立卫生研究院出版的实验动物护理和使用指南(nih出版号85-23，1985年修订)。研究开始前得到了伦理委员会和兽医当局的批准。将动物室的环境控制设定为保持22℃至28℃的温度、30％至70％的相对湿度。每小时记录并每天监测室温和湿度。动物室每小时换气约10次至15次。光周期为12小时光照和12小时黑暗。进行常规日常观察。可随意获取标准实验室小鼠食物和经过滤的自来水。
将艾塞那肽(
在全身麻醉下，静脉内给予试验/对照制品，以模拟在急性心肌梗死和原发性经皮冠状动脉介入术的临床环境中的预期给药途径。
研究按照预定的安慰剂对照计划进行。简言之，将149只健康的、适应环境的雄性小鼠随机分配到二十(20)个研究组中的一组。在所有的组中，使小鼠经受30分钟的心脏缺血(冠状动脉闭塞)，然后进行120分钟(2小时)的再灌注。在所有的情况下，在缺血发生之后20分钟(再灌注开始前10分钟)进行治疗(静脉内推注生理盐水或试验制品或它们的组合)。在再灌注之后2小时(研究结束)终止实验；评价这个时间点的不可逆性心肌损伤(通过组织形态计量学的梗死面积)，并且为研究的主要终点。将研究计划总结于表11中。
表11.实验方案
麻醉/手术准备。通过腹膜内注射(0.01ml/kg)氯胺酮、甲苯噻嗪和阿托品的组合(氯胺酮、甲苯噻嗪和阿托品的最终剂量分别为100mg/kg、20mg/kg和0.6mg/kg)对小鼠进行麻醉。通过对趾尖刺激的踏板反射丧失和呼吸速率来评估麻醉深度。进行气管切开术，用于以120-150次呼吸/分钟和呼气末正压2.0(一次换气量为0.2ml；flexivent啮齿动物呼吸机，scireq，montreal，on，加拿大)进行人工呼吸。然后在第四肋骨和第五肋骨之间进行胸廓切开术，小心地使心包膜缩回，以显现左前降支(lad)，使用置于左心耳尖端下方1mm处的8-0prolene单丝聚丙烯缝合线将lad结扎。在结扎以诱发缺血之前，使心脏稳定12分钟。在缺血时期之后，将结扎线释放，从而使心肌能够进行再灌注。在整个实验中，通过加热垫使体温保持在37±0.5℃，并通过直肠插入的热电偶监测体温。
组织病理学/组织形态计量学。再灌注之后，使用腹膜内注射氯胺酮(200mg/kg)和甲苯噻嗪(50mg/kg)麻醉剂混合物(0.02ml/kg)将动物处死，将心脏从小鼠体内快速切离，直接插管并用2.5ml含有1％肝素的盐水去除血液。将5ml37℃的含有1％ttc的磷酸盐缓冲液注入冠状动脉循环；将组织在相同的缓冲液中孵育5分钟。将用蒸馏水稀释的1％的伊文思蓝(2.5ml)注入心脏。使心脏在-20℃下保持24小时，然后平行于房室沟切成1mm的切片，然后在4％的福尔马林中固定过夜。然后将切片在相距1mm的玻璃板之间压平，并通过zeiss459300显微镜使用cannonpowershota620数码相机拍照，并用scionimage程序测量。将危险和梗死的心肌组织区域自动转化为体积。梗死和危险区域的体积以单位为cm3表示。对于各切片，将aar表示成lv区域的百分比(aar/lv)，并将if表示成aar的百分比(if/aar)。在所有的情况下，均由对治疗分配/研究计划不知情的人员进行定量组织形态计量学分析。
数据分析/统计。所有的结果均表示为平均值±sem。使用具有bonferroni校正分析和tukey事后分析的单向方差分析(anova)模型分析组之间数值变量的比较。使用stata13.1统计软件包(statacorp，tx，美国)进行分析。认为计算的p值小于0.05是统计学上显著的。
动物观察/结果。
在所有动物中，左心室(lv)和缺血区域(aar)的面积相当，并且在研究组之间没有统计学差异。在对照组中，诱导缺血(30分钟)和再灌注(120分钟)导致对实验动物心肌的显著损伤(47.4±1.9％)，表明模型的充分实施和研究实验过程的重现性。
与对照组相比，艾塞那肽单药疗法(0.001μg/kg至1.5μg/kg)引起0.005μg/kg和0.05μg/kg剂量的剂量效应作用，从而使梗死面积分别减少36.9％(29.9±1.8％；p<0.05)和31.6％(32.4±1.9％；p<0.05)。与对照组相比，环孢霉素单药疗法(0.001mg/kg至2.5mg/kg)引起0.01mg/kg和0.15mg/kg剂量的剂量效应作用，从而使梗死面积分别减少43.7％(26.7±2.8％；p<0.05)和49.4％(24±1.9％；p<0.05)。与对照组相比，坎利酸钾单药疗法(0.03mg/kg至10mg/kg)引起1mg/kg和10mg/kg剂量的剂量效应作用，从而使梗死面积分别减少30％(33.2±2.4％；p<0.05)和58.9％(19.5±2.5％；p<0.05)。
与对照组相比，艾塞那肽和环孢霉素的双重组合造成梗死范围减少52.5％(22.5±2.3％；p<0.05)。然而，与艾塞那肽和环孢霉素各自的单药治疗剂量相比，这种效果不具有统计学显著性。与对照组相比，艾塞那肽和坎利酸钾的双重组合造成梗死范围减少70.9％(13.8±1.3％；p<0.01)。有趣的是，与艾塞那肽和坎利酸钾单药疗法的各自的剂量相比，该组合的效果也是统计学显著的(p<0.05)。然而，当艾塞那肽与较高剂量(10mg/kg)的坎利酸钾组合时，使梗死面积减小52.3％(22.6±2％)，这与各自的单药疗法无统计学差异。与对照组相比，环孢霉素和坎利酸钾的双重组合造成梗死程度降低61.4％(18.3±2.6％；p<0.05)。然而，与环孢霉素和坎利酸钾的各自的单药疗法剂量相比，这种效果不具有统计学显著性。最后，与对照组相比，艾塞那肽、环孢素和坎利酸钾的三重组合造成梗死程度降低56.7％(20.5±2％；p<0.05)。然而，与艾塞那肽、环孢霉素和坎利酸钾各自的单药疗法剂量相比，这种效果不具有统计学显著性。
表12列出了这样的数据，其示出了本研究中使用的各组的危险区域与左心室之比以及梗死区域与危险区域之比。
表12.研究组织病理学的结果
这些结果表明，在急性心肌缺血和再灌注损伤的其他标准化动物(鼠科)模型中，当在再灌注开始之前10分钟作为iv推注施用时，与艾塞那肽或csa或坎利酸钾单药疗法组相比，艾塞那肽、环孢霉素和坎利酸钾的联合疗法能够更大地减小心肌梗死面积。令人很感兴趣的是，目前的结果提供了强有力的证据，即坎利酸钾与艾塞那肽的联合疗法也以协同作用的方式降低了心肌损伤的程度，因为所得的组合的减少效果超过了各自的单药疗法的减少效果之和。因此，这些结果表明，在心肌再灌注损伤的治疗中，与各自的单药疗法或其他双重或三重组合相比，艾塞那肽和坎利酸钾的联合施用提供了最好的心脏保护作用。因此，组合的艾塞那肽和坎利酸钾在预防和治疗哺乳动物受试者的缺血-再灌注损伤的方法中特别有效。
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