白介素‑27在治疗艰难梭菌感染中的应用的制作方法

本发明涉及医药技术领域，特别是涉及白介素-27在治疗艰难梭菌感染中的应用。

背景技术：

艰难梭菌(Clostridium difficile，Cd)为革兰阳性厌氧芽孢杆菌，是人类肠道中的正常菌群之一，广泛分布于自然环境和动物粪便中。1978年，英国BARTLETT等首次确认Cd为抗生素相关性腹泻(AAD)的主要病原菌，主要症状包括无症状携带、轻至中度腹泻和严重的伪膜性肠炎(Pseudomembrannous Colitis，PMC)。从2001年以来，由于艰难梭菌感染率的上升、强毒力株(BI/NAP1/027/毒素Ⅲ型)的出现及爆发性流行，导致该病的严重病例数、复发率和病死率均明显增高，耐药菌株也在增多，该病的治疗引起全球研究者和医务工作者的高度重视。

目前，治疗艰难梭菌感染的首要策略是停用抗生素，改用其他治疗措施，同时纠正水、电解质紊乱，纠正低蛋白血症等。针对Cd的主要抗菌药物为甲硝唑、万古霉素。在治疗过程中，同时可应用一些微生态制剂作为抗菌药的辅助用药，如服用乳酸杆菌、双歧杆菌或酵母菌等，帮助恢复肠道正常菌群，有助于缩短抗生素的疗程，减少复发。但是，在过去二十多年里，治疗失败、感染复发的概率明显升高，特别是感染了强毒力株(BI/NAP1/027/毒素Ⅲ型)的病人，发展更有效的和更有针对性的CDI(艰难梭菌感染)治疗方法仍然是控制艰难梭菌流行的必要手段之一。

IL-27是一种异源二聚体细胞因子，由激活的抗原呈递细胞所分泌，有着促炎症和抗炎症的作用，与多种感染性疾病和炎症性疾病密切相关。它通过促进幼稚CD4+T细胞向Th1特异谱系的早期提交而促成炎症。与此相反，它又抑制Th17分化并在分化的Th1和Th2效应细胞中诱导调节性T细胞(Tr1)般的活性而抑制炎症。利用感染了各种病原体的TCCR/WSX-1缺陷型小鼠开展的研究表明，IL-27的信号也是防止过度的T细胞活性和限制促炎症细胞因子产生所必需的，揭示了IL-27在抗微生物感染中所发挥的重要作用。但是关于IL-27在艰难梭菌感染中发挥治疗作用的具体研究还有待深入。

技术实现要素：

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供白介素-27在治疗艰难梭菌感染中的应用，用于解决现有技术中对艰难梭菌感染的治疗效果不佳等问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供白介素-27在制备治疗或预防艰难梭菌感染的药物中的应用。白介素-27治疗的对象，可以是还没有被艰难梭菌感染的对象，可以是被艰难梭菌感染但还没有表现出相关症状的对象，也可以是被艰难梭菌感染，达到引起相关疾病的对象。

在本发明的一些实施例中，所述白介素-27选自人白介素-27、重组人白介素-27、鼠白介素-27、重组鼠白介素-27中的一种或多种组合。

在本发明的一些实施例中，白介素-27用于治疗艰难梭菌感染引起的疾病。

在本发明的一些实施例中，所述疾病包括艰难梭菌感染引起的抗生素相关性腹泻。

在本发明的一些实施例中，所述疾病包括艰难梭菌感染引起的伪膜性肠炎。

在本发明的一些实施例中，所述疾病还包括艰难梭菌感染引起的肾盂肾炎、脑膜炎、腹腔及阴道感染、菌血症、气性坏疽。

本发明第二方面提供一种治疗或预防艰难梭菌感染的药物，所述药物中含有有效量的白介素-27。

在本发明的一些实施例中，所述白介素-27选自人白介素-27、重组人白介素-27、鼠白介素-27、重组鼠白介素-27中的一种或多种组合。

如上所述，本发明的白介素-27在治疗艰难梭菌感染中的应用，具有以下有益效果：本发明经过体内动物实验发现IL-27(白介素-27)对CDI具有较好的治疗作用，是一种具有广阔应用前景的治疗药物，为更好地治愈CDI提供了另一种可行的选择，提高患者的生活质量。

附图说明

图1显示为艰难梭菌感染病人血清及粪便中Il-27的含量图。

图2显示为艰难梭菌感染后PBS、WT、KO三组小鼠的体重随时间的变化图。

图3显示为艰难梭菌感染后PBS、WT、KO三组小鼠的生存率随时间的变化图。

图4显示为小鼠的结肠组织HE染色图。

图5显示为分别用生理盐水和rmIL-27处理后小鼠的生存率变化图。

图6显示为rmIL-27治疗组和对照组小鼠盲肠内容物菌落计数结果图。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

以下实施例中的酒精浓度均指体积浓度。

实施例1

艰难梭菌感染的病人血清及粪便中IL-27检测

临床病人送检的粪便标本，由检验科微生物室进行艰难梭菌的相关检测，待检测完毕后，收集剩余的粪便标本和病人送检当天的血清标本；同时，收集健康人的血清及粪便标本作为对照，立即存于-80℃冰箱中，待后续实验用。将所有病人分为2组：腹泻阳性且组艰难梭菌培养阳性(CDI组)、腹泻阳性且艰难梭菌培养阴性组(Diarrhea组)，健康人作为对照组(Control组)。利用人IL-27ELISA试剂盒(购自R&D Systems公司)，检测病人血清及粪便中IL-27蛋白的含量，具体操作步骤严格参考试剂盒说明书。

结果显示：健康人及腹泻但无艰难梭菌感染的病人，其血清和粪便中几乎检测不出IL-27；而腹泻伴艰难梭菌感染的病人血清及粪便中IL-27的含量则明显升高，较腹泻但无艰难梭菌感染病人和健康人有统计学意义(如图1所示)，说明IL-27在艰难梭菌感染中发挥一定作用。

实施例2

艰难梭菌感染小鼠模型的建立及鉴定

为进一步探究IL-27在艰难梭菌感染过程中发挥的作用，本发明构建艰难梭菌感染的小鼠模型。实验小鼠包括20只6-8周龄雌性IL-27受体缺陷型(WSX-1^-/-)小鼠随机分为实验组(KO+CDI组)和对照组(KO+PBS)；20只6-8周龄的野生型(WT)雌性C57BL/6小鼠(购自重庆医科大学实验动物中心)，随机分为实验组(WT+CDI组)和对照组(WT+PBS组)两组，每组10只。小鼠全部接受混合抗生素(购自生工生物工程(上海)股份有限公司)治疗，包括卡那霉素(0.4mg/mL)、庆大霉素(0.035mg/mL)、多粘菌素(850U/mL)、甲硝唑(0.215mg/mL)和万古霉素(0.045mg/mL)，将上述抗生素按所需量配成饮用水给小鼠饮用5天，然后换成普通的饮用水，饮用2天后，即灌菌前一天，所有小鼠予克林霉素(10mg/kg)腹腔注射。实验组给予0.2mL艰难梭菌(购自美国菌种保藏中心标准株ATCC43255)菌悬液(10⁸CFU/mL)灌胃，对照组小鼠予同体积无菌PBS灌胃。然后，每日称体重，观察粪便形态、小鼠活动度、有无弓背、腹泻、湿尾或死亡；同时通过留取小鼠结肠组织，对其进行HE染色，检验肠组织病理情况。观察终点为动物濒死状态或至灌菌后第7天，通过以上指标，验证小鼠艰难梭菌感染模型是否构建成功。

结果显示：与两对照组相比较，KO实验组和WT实验组小鼠在艰难梭菌感染后第1天开始，小鼠活动度变差，体重下降(如图2所示)，大便性状稀软，甚至呈水样便，出现湿尾、弓背姿势，上述症状在KO组小鼠中更为明显、严重，且KO组小鼠死亡率较WT组高(如图3)。另外，所有存活的小鼠在感染后第3天体重最轻，第4天后开始恢复；两对照组小鼠体重变化不大，无艰难梭菌感染的相关症状，体重变化情况如图2所示，说明艰难梭菌感染的小鼠模型构建成功，且IL-27在艰难梭菌感染过程中起重要作用。

实施例3

结肠组织病理学检查

在观察过程中小鼠死亡或至观察终点，分别麻醉并脱颈处死小鼠后，分别留取实验组(CDI)和对照组(PBS)小鼠的结肠组织，每组分别有5个样品(n＝5)，具体的组织处理步骤如下：

1)固定：组织加入到10％(质量浓度)的中性福尔马林中，固定大概1天；

2)脱水：取出固定好的组织，将其依次放入梯度酒精进行脱水(分别是70％酒精1h，80％酒精1h，95％酒精1h和100％酒精1h)；

3)透明：先用二甲苯I浸泡10mim，然后用二甲苯II浸泡20min；

4)浸蜡：先用软蜡在60℃下浸泡1h，然后用硬蜡在60℃下浸泡2h；

5)包埋：硬蜡包埋；

6)切片与贴片：在石蜡切片机进行组织切片，切片的厚度大概为4μm；放到加热的水中烫平，再贴到载玻片上，放45℃恒温箱中烘干。

7)脱蜡染色：将干燥的石蜡切片放置于二甲苯中，依次在梯度酒精中(100％酒精3min，95％酒精3min，80％酒精3min，70％酒精3min)进行脱蜡处理，最后入蒸馏水。将已入蒸馏水后的切片放入苏木精水溶液中染色数分钟；酸水及氨水中分色，各数秒钟，使用流水冲洗1小时后入蒸馏水片刻，然后入70％和90％酒精中脱水各10分钟，最后入酒精伊红染色液染色2—3分钟。染色后的切片经纯酒精脱水，再经二甲苯使切片透明，滴上树胶进行封固，利用显微镜进行图像采集。

艰难梭菌感染观察结束后，进行病理检测，评估结肠组织炎性细胞浸润、血管充血和组织水肿、上皮细胞损伤的情况。结果显示：艰难梭菌感染的小鼠，其结肠组织明显充血，水肿，上皮细胞损伤严重，伴有大量的炎性细胞浸润，且KO组小鼠更严重；对照组小鼠的结肠组织无上述变化，见图4。

实施例4

鼠IL-27重组蛋白(recombinant IL-27)改善小鼠的艰难梭菌感染症状

采用实施例2的方法对野生型(WT)小鼠和对照组小鼠进行抗生素预处理以及艰难梭菌灌胃处理，野生型(WT)小鼠在CDI后的第0天和第3天，用异氟醚轻度麻醉，然后腹腔注射含有IL-27的注射液(rmIL-27组)，本实施例的注射计量为100μL，注射液中含有10μg/mL的重组小鼠IL-27蛋白，IL-27蛋白购自R&D Systems公司，货号：NYA0915111，规格：10μg/支，每10μg的IL-27蛋白溶于1mL无菌PBS溶液中，制得所述注射液；对照组为只注射同等剂量(100μL)的生理盐水(氯化钠质量浓度为0.9％)的艰难梭菌感染的小鼠模型(Saline组)，观察两组小鼠感染艰难梭菌的相关症状是否得到改善，具体包括腹泻、弓背、体重、湿尾、活动度等，具体描述见结果部分。观察结束时，留取小鼠的结肠组织做病理学检查，具体实施方法如实施例3所述。

结果如图5所示，经IL-27治疗的小鼠生存率增高，体重减轻幅度小，活动度较好，无弓背、湿尾等艰难梭菌感染的症状；病理检查结果(如图4)表明IL-27治疗后，肠组织的损伤、水肿和炎性浸润程度较轻，而未治疗组即生理盐水处理组的野生小鼠CDI的相关症状比较明显，说明经IL-27治疗后，小鼠艰难梭菌感染症状得到了改善，提高了小鼠的生存率。

实施例5

小鼠肠内容物菌落计数

在小鼠艰难梭菌感染观察结束后，取rmIL-27治疗组和对照组小鼠盲肠内容物，盛放于1.5mL的微量离心管中称重，然后加1mL无菌PBS(PH7.4)涡旋混匀，1500g离心30s获得悬浮液，将其10倍稀释，连续稀释4次(10^-1to 10^-4)，每个浓度的悬浮液各接种50uL于头孢西丁-D-环丝氨酸-果糖琼脂平板上(CCFA)，37℃厌氧培养48h后进行菌落计数。

结果显示：艰难梭菌感染后经rmIL-27治疗，小鼠肠内容物中艰难梭菌载量较对照组明显降低(如图6所示为rmIL-27治疗组和对照组小鼠盲肠内容物菌落计数结果图)，说明IL-27有助于清除肠道中艰难梭菌，对小鼠具有显著的治疗作用。

综上所述，本发明经过体内动物实验发现IL-27对CDI具有较好的治疗作用，是一种具有广阔应用前景的治疗药物，为更好地治愈CDI提供了另一种可行的选择，提高患者的生活质量。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。