本发明涉及雪片莲水提物在抑制成纤维细胞端粒缩短中的应用。
背景技术：
在化妆品生产中，抗衰老的化妆品一直被人们所关注，这是因为针对抵御皮肤老化的问题是公众所关注的重点。保护皮肤、延缓皮肤衰老是很多人的梦想，因此抗衰老化妆品的开发和应用化妆品行业中的一个重要研究方向。
皮肤表象的衰老反映在细胞水平即为细胞衰老。在老化的皮肤中，存在着因为成纤维细胞衰老而引起的细胞增殖减弱，胶原等细胞外基质成分合成不足甚至降解增加，导致真皮老化。因此，研究如何减缓成纤维细胞衰老进而延缓皮肤衰老具有深远的意义。
雪片莲(leucojumvernum)是石蒜科雪花莲属，球根状草本植物，开有下垂的白色花朵。雪花莲具有鳞茎，叶线形，花茎直立，在花茎顶端著生有一朵花，钟形；花瓣六片，花瓣分为内外两层，内层与外层各有三片花瓣，外层的花瓣比内层的花瓣较长且较凸起。从休眠的雪花莲中提取的活性成分，植物休眠精华，具有类肉毒素的作用，抗皱平纹；通过促进超氧化物歧化酶(sod)的表达，提高皮肤自身抗氧化能力；适宜浓度的提取物能有效且长效地阻断肌肉-神经共培养体系中肌肉的收缩。对于雪片莲水提物的研究空间仍然很大。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术中对雪片莲水提物在抑制成纤维细胞端粒缩短方面的空白，而提供了雪片莲水提物在抑制成纤维细胞端粒缩短中应用。
本发明提供了一种雪片莲水提物在抑制成纤维细胞端粒缩短中的应用。
本发明中，所述雪片莲水提物在抑制成纤维细胞端粒缩短时一般均保证细胞活性正常。
本发明中，所述雪片莲水提物在抑制成纤维细胞端粒缩短可通过抑制端粒缩短能力来反映，所述抑制端粒缩短能力一般可通过与外界胁迫物(可使成纤维细胞端粒迅速缩短的外界物质，例如过氧化氢)比较得到，具体的，所述抑制端粒缩短能力＝(b-a)/(nt-a)*100％；其中，a为包含外界胁迫物(不含有其他影响细胞端粒长度的物质)的成纤维细胞端粒相对长度；b为包含所述雪片莲水提物和a中所述外界外界胁迫物(不含有其他影响细胞端粒长度的物质)的成纤维细胞端粒相对长度；nt为正常的成纤维细胞端粒的相对长度。
成纤维细胞端粒的相对长度的计算方法为本领域技术人员均知的方法。
所述雪片莲水提物中的雪片莲优选夏雪片莲(leucojumaestivum)。
所述雪片莲水提物是指雪片莲按照本领域常规的水提方法提取得到的提取物，本发明特别优选以下提取方法：将所述雪片莲(可为全株或鳞茎)，在水中粉碎，10℃～50℃(例如15℃～45℃)温度下提取40～60min(例如45min)，去除固体，稀释过滤即可；所述雪花莲在所述粉碎前进行清洗和/或剥皮。
所述雪片莲可处于休眠期或非休眠期，进一步优选休眠期；休眠期是指植物体或其器官在发育的过程中，生长和代谢出现暂时停顿的时期，所述雪片莲的休眠期在冬季。
所述粉碎可采用本领域的常规粉碎方法，优选采用粉碎机，粉碎机转速为25000～30000转/分钟，更佳的为29000转/分钟；所述粉碎时所述水或纯水的用量为所述雪片莲质量的5-7倍；所述粉碎时间由粉碎为匀浆状态确定。
所述稀释时优选采用水和/或甘油作为溶剂。
所述过滤优选采用0.2μm的过滤器进行过滤。
在不违背本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
(1)雪片莲水提物可抑制成纤维细胞端粒缩短；
(2)雪片莲水提物在细胞中的浓度为3～0.5mg/ml，更佳为1.5mg/ml范围内没有细胞毒性。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
本发明中，在成纤维细胞的培养过程中通过添加不同浓度的雪片莲水提取物，测定其细胞活性，观察细胞是否受损。
本发明中，在成纤维细胞培养中分别添加过氧化氢及过氧化氢与雪片莲水提物，实时荧光定量pcr测定dna端粒长度，可有效反应雪片莲水提物抑制成纤维细胞端粒缩短的作用。
1、夏雪片莲水提物的制备
清洗处于休眠期的夏雪片莲植株，并对其进行剥皮。在纯水(6倍雪片莲质量)中粉碎鳞茎(粉碎机转速为29000转/min，时间为3h，直到形成匀浆状态。在25℃的温度下，螺旋搅拌提取45min，通过倾析祛除粗固体。再进行细固体的祛除(100℃左右加热浆液，倾析液相提取物至新的清洁容器，通过流速5kg/min的盘式离心机离心获得。在水中稀释以获得10mg/l(即每升水中含有10mg的固体鳞茎)的质量，提取物使用0.2μm的过滤器过滤，最终的提取物的颜色为浅黄色。
2、细胞培养及加样处理
细胞培养：人成纤维细胞al15012lf-p2使用完全培养基(dmem，10％fcs，1％p/s)在37℃的5％co2细胞培养箱培养，至90％汇合时，消化种板。
细胞毒性实验：al15012lf-p3
5000/孔
96孔板在37℃的5％co2细胞培养箱中培养48小时
样品及浓度：
*每毫升水中含有固体鳞茎的质量
加样：样品储备液(上述1中所得的浅黄色提取物的水溶液，区别在于浓度，存储液浓度见上表)用培养基稀释100倍加到孔中；
细胞培养：细胞在含有待测样品的培养基(dmem，2％fcs，1％p/s)中培养24小时
3、细胞毒性实验
细胞与待测样品共培养24小时后，移除培养基，加入mtt0.5mg/ml，3小时后小心吸去上清，加入dmso，于550nm下进行检测；以0.25％十二烷基硫酸钠(sds)作为参照，定义样品孔为t，未处理孔为nt，以t与nt的比值(t/nt)，即fb细胞活性≥90％视为无细胞毒性，比值＜90％视为有细胞毒性，实验结果如下表1所示：
表1
fb细胞活性(％相对于未处理孔nt)
与对照sds(0.25％)明显有细胞毒性相比，样品(sf)在终浓度3～0.5mg/ml范围内没有细胞毒性，可使用此区间浓度继续进行后续实验。
4、细胞端粒长度测试实验
4.1细胞活性实验
按照上述3中所述细胞毒性实验具体操作，仅对样品进行改变。
样品编号h2o2+雪片莲(1.5ml/ml)代表40um的h2o2+1.5ml/ml雪片莲(1.5ml/ml雪片莲是指上述1中所得浅黄色物质用水稀释至1.5ml/ml)；
样品编号h2o2+雪片莲(0.75ml/ml)代表40um的h2o2+0.75ml/ml雪片莲(0.75ml/ml雪片莲是指上述1中所得浅黄色物质用水稀释至0.75ml/ml)；
样品编号h2o2+雪片莲(0.5ml/ml)代表40um的h2o2+0.5ml/ml雪片莲(0.5ml/ml雪片莲是指上述1中所得浅黄色物质用水稀释至0.5ml/ml)；
其余编号含义类同。
fb细胞活性(％)≥90％视为细胞活性正常，可见上述样品均可使成纤维细胞保持正常活性。
4.2细胞端粒长度测试加样处理
采用双氧水(h2o2)等氧化压力可引起细胞端粒缩短，进行相关实验。
将人原代成纤维细胞al15012lf(p5)接种于6孔板，使用培养基(dmem+10％fcs)于37度co2培养箱中培养48h；
nt(未处理组)：加入单纯培养基(dmem+10％fcs)处理2h，之后换新的培养基(dmem+10％fcs)；
h2o2(加压衰老组)：加入含40umh2o2的培养基处理2h，之后换新的培养基(dmem+10％fcs)；
样品组：加入含40umh2o2及样品雪花莲1.5mg/ml、0.75mg/ml或0.5mg/ml的培养基处理2h，之后换新的培养基(dmem+10％fcs)；
上述处理过程连续处理三天。
4.3实时荧光定量pcr测定dna端粒长度
端粒(t)重复拷贝数与单拷贝基因(s)的比率与端粒的长度成正比关系，即t/s比率可以得出端粒的相对长度，计算方法如下公式所示：
t/s＝[2ct(tel)/2ct(hbg)]＝2-δct
根据端粒相对长度，计算抑制端粒缩短能力，从而反应雪片莲水提物在抑制成纤维细胞端粒缩短方面的作用。
抑制端粒缩短能力＝(样品端粒相对长度-h2o2组端粒相对长度)/(nt端粒相对长度-h2o2组端粒相对长度)。
每种条件下3个平行样(n＝3)，统计数据如下所示：
由上表可以看出，当加入雪片莲水提物时可抑制成纤维细胞端粒缩短，且随着浓度的增加，抑制作用有所增强。